可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用：由中药油相辅料、多药耐药逆转剂及难溶性抗肿瘤化疗药物组成，特征是本中西药微乳共传递系统中还含有表面活性剂、助乳化剂及水；所述中药油相辅料、多药耐药逆转剂、难溶性抗肿瘤化疗药物、表面活性剂、助乳化剂及水之间的重量比是40：5~30：1~4：10~35：10~20：80~200。本发明解决了抗肿瘤化疗过程中肿瘤多药耐药问题，将易产生耐药的抗肿瘤化疗药物纳入到微乳递药系统中，可用于难溶性药物的增溶，控制药物释放；中药与西药的联合给药，能更好地发挥协同抗肿瘤作用；能够逆转肿瘤多药耐药，更好地促化疗药物发挥抗肿瘤活性。
【专利说明】可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]世界卫生组织报告，近年来癌症导致的死亡人数占全球死亡人数的13%。另据美国癌症协会报告，全球每年约数百万人死于癌症，并且这种趋势并无缓解迹象。国家卫生部公布的资料显示近两年来恶性肿瘤已成为我国城乡居民死亡首要因素。癌症化疗无效而致死的主要原因是由于肿瘤本身固有的耐药性，或者肿瘤在化疗过程中逐渐产生的耐药性。肿瘤在化疗过程中产生耐药性是指在接受单一药物治疗的过程中，肿瘤细胞获得了对一种或者多种结构和功能各不同的化疗药物的交叉耐药性，使肿瘤细胞对化疗药物不再敏感，从而导致化疗失败。这种现象被称之为多药耐药(multidrug resistance,MDR)。尽管出现了钙离子阻滞剂如维拉帕米、环孢素A等P-gp抑制剂，也出现了写抑制MDR-1的mRNA过度表达的反义核苷酸等逆转多药耐药的药物，但都因价格昂贵或疗效不显著等原因影响临床应用。
[0003]中药以单味药或者以复方的形式用于肿瘤的治疗或者辅助治疗已有千百年的历史，显然中药在 抗肿瘤领域，尤其是在逆转肿瘤多药耐药方面有着独特的优势。临床显示不少中药或者复方能逆转肿瘤多药耐药，实现抗癌药物的“增效减毒”，同时减少患者的痛苦，增强免疫功能，改善生存质量。
[0004]五味子、汉防己、人参皂苷、苦参碱、白花前胡和茶多酚等都可以通过各种不同的途径改善多药耐药现象。譬如:五味子主要成分为木脂素，包括五味子甲素，五味子乙素，五味子丙素，五味子醇甲，五味子醇乙，五味子酯甲，五味子酯乙以及gomisin E, D, G, F等,这些五味子提取物以及五味子木脂素类化合物具有体内外逆转MDR作用；汉防己碱是从防己科植物汉防己的干燥根中分离得到的一种生物碱，其具有多方面的药理活性，包括抗肿瘤活性。近年来的研究更显示了汉防己碱作为肿瘤MDR逆转剂的应用前景；苦参碱是从苦参根中提取的一类四环喹嗪啶生物碱，具有抑制肿瘤生长，诱导MDR肿瘤细胞凋亡的作用；同样地，有文献报道白花前胡根的提取物能部分逆转P-gp过量表达的KBVl细胞对抗肿瘤药物的耐药性，追踪研究发现逆转MDR的活性成分为白花前胡甲素；中药泽泻提取物泽泻醇B23-单乙酸酯能修复P-gp-MDR细胞H印G2-MDR和K562-MDR对长春碱、阿霉素和紫杉醇等的敏感性；茶多酚也有逆转肿瘤MDR的作用，显示良好的应用前景。
[0005]最引人注目地是，经常用来与化疗药物联合使用，促化疗药物“增效减毒”的人参中，部分三萜型人参皂苷也出现了逆转肿瘤MDR，增强肿瘤对化疗药物的敏感性的报道。Zhang等人指出人参皂苷Rh2在耐药MCF-7细胞模型中表现出可逆转多药耐药的作用，具体机制是人参皂苷Rh2可以抑制P-gp的表达。
[0006]中药在抗肿瘤领域的优势在于调节免疫能力、诱导细胞凋亡，作用温和，但是效能不及西药；而西药尽管杀伤肿瘤细胞的能力很强，但是毒副作用较大。因此临床常用中医药联合治疗的方案对抗肿瘤。
[0007]近年来，中药纳米递药系统成为中药制剂现代化发展的热点研究领域。微乳作为纳米递药系统的一种，由乳化剂、助乳化剂、油相自组装形成，可以显著增溶难溶性中药组分并促其口服吸收。但是微乳剂型能够逆转MDR的报道尚不多见。本发明采用临床上常用的中西结合治疗的思路，将中西药纳入同一给药系统，利用中药的“扶正培本”，降低化疗药物的毒副作用，协同抗肿瘤。更重要地是，借助中药在逆转肿瘤多药耐药的优势，构建一个依托中药组分的中西药协同给药微乳口服系统，不但能够发挥中西药协同抗肿瘤效应，还能使整个给药系统具备逆转肿瘤多药耐药的能力。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明用以解决抗肿瘤化疗过程中肿瘤多药耐药的问题，利用某些中药能够逆转多药耐药的优势，将这些中药和易产生耐药的抗肿瘤化疗药物纳入到微乳递药系统中，一方面这种 纳米递药系统可用于难溶性药物的增溶，控制药物释放；另一方面中药与西药的联合给药，能够更好地发挥协同抗肿瘤作用；更重要地是，整个递药系统能够逆转肿瘤多药耐药，更好地促化疗药物发挥抗肿瘤活性。
[0009]完成上述发明任务的技术方案是，一种可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，由中药油相辅料(也称为“微乳油相”)、多药耐药逆转剂及难溶性抗肿瘤化疗药物(也称为“所包埋的化疗药物”)组成，其特征在于，本中西药微乳共传递系统中还含有表面活性剂、助乳化剂及水；所述中药油相辅料、多药耐药逆转剂、难溶性抗肿瘤化疗药物、表面活性剂、助乳化剂及水之间的重量比是40: 5~30:1~4: 10~35: 10~20: 80~200，最优的质量比为40: 10~20: 2~3: 15~20: 12~18: 120~180。
[0010]以上方案中，所述油相辅料(微乳油相)选自:薏苡仁油、油酸、橄榄油、蓖麻油或甘油酸三油脂之一；表面活性剂选为RH40、助乳化剂选为PEG-400。
[0011]本发明所述多药耐药逆转剂选自:人参皂苷及部分单体(包括Rh2，Rg3，Rhl，Rgl，PPT, PPD)、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、gomisin E，D，G，F、汉防己碱、苦参碱、白花前胡甲素、泽泻醇B23-单乙酸酯或茶多酚等中的一种或多种。
[0012]本发明中的难溶性抗肿瘤化疗药物(所包埋的化疗药物)包括:依托泊甙、紫杉醇、阿霉素、环孢素A、替尼钼甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、尼莫地平、多烯紫杉醇，灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋吟，尤其是对紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、环孢素A、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙或尼莫地平。
[0013]本发明用可逆转肿瘤多药耐药的中药组分修饰微乳的辅料，并搭载难溶性抗肿瘤化疗药物构建中西药协同共传递微乳。本发明将采用易进行大规模生产的搅拌水注入制备工艺，使其与微乳的油相和乳化剂相互作用，水相中自组装形成能够逆转肿瘤多药耐药的纳米级的乳剂，以适合用于药物、与药物组配或作为药物载体，尤其是作为毒性小、载药量高、口服利用度高的口服制剂或可静脉注射给药的药物载体。
[0014]完成本申请第二个发明任务的技术方案是，上述可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统的制备方法，其特征在于，步骤如下:
[0015]I)取可逆转肿瘤多药耐药的中药组分加入至微乳油相中，室温搅拌2_8h混匀，取助乳化剂至上述混合体系中，继续室温搅拌2-6h后加入表面活性剂搅拌至匀质状态，备用；
[0016]2)取难溶性抗肿瘤化疗药物加入至上述制备的混合体系中，室温或加热机械搅拌2-8h，直至无不溶物悬浮于体系，备用；
[0017]3)将去离子水恒速、缓慢、定量地滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌体系，直至出现透亮澄明的体系。
[0018]参照专利(200910031997.6,201210461902.6,201210552211.7)方法，本发明的微乳递药系统，油相辅料选择为薏苡仁油、油酸、橄榄油、蓖麻油、甘油酸三油脂之一；表面活性剂选为RH40、吐温80、cremophor? EL、司盘20、人参皂苷(或其单体Rh2，Rg3，Rh I，Rgl，PPT, PPD)中的一种或几种；助乳化剂选为PEG-400、乙醇、异丙醇或丙二醇中的一种。
[0019]更优选的制备方法包括(此部分油相以薏苡仁油，乳化剂为RH40，多药耐药逆转剂为人参皂苷Rh2，难溶性抗肿瘤化疗药物以依托泊甙为例叙述，涉及其他辅料、耐药逆转剂及难溶性抗肿瘤化疗药物的微乳制备方法类似):
[0020]I)取薏苡仁油加入至人参皂苷Rh2和RH40 (或不加RH40)中，室温搅拌4_6h至完全混匀，取助乳化剂PEG-400至上述混合体系中，继续室温搅拌4-5h，备用；
[0021]2)取难溶性抗肿瘤化疗药物依托泊甙加入至上述制备的混合体系中，机械搅拌4-6h，直至无不溶物悬浮于体系，备用；
[0022]3)将去离子水恒速、缓慢并定量地滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌体系，直至出现透亮澄明的体系。
[0023]最优选的包埋依托泊甙的薏苡仁油-人参皂苷Rh2微乳(ECG-ME)的制备方法包括:
[0024]取等质量比的薏苡仁油和人参皂苷Rh2，室温搅拌6h至完全混匀，将与人参皂苷质量比2: I的助乳化剂PEG-400加入到上述混合体系中，继续室温搅拌4h;取与人参皂苷Rh2质量比的20: I的依托泊甙，缓慢分批加入至上述制备的混合体系中，机械剧烈搅拌搅拌4h，直至无不溶物悬浮于体系；将人参皂苷Rh2 6倍量的去离子水恒速、缓慢滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌体系，直至出现透亮澄明的体系。
[0025]完成本申请第三个发明任务的技术方案是，上述可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0026]本发明的ECG-ME微乳系统辅料用可逆转肿瘤多药耐药的中药成分修饰，相比已报道的各类型的微乳剂型相比，这种微乳系统能够改善肿瘤化疗易出现的多药耐药问题；同时，用一种递药系统将适合联合应用的中药和西药同时增溶，同时传递，协同给药，这种策略更贴近中药临床治疗实施方案，更能发挥中药抗肿瘤治疗特色。
[0027] 为了阐明可逆转肿瘤多药耐药的中药组分修饰微乳的辅料后能否成功制备微乳；这些中药组分与抗肿瘤化疗药物是否适合同时递送给药；以及这种多组分的组合方式能否成功载入本发明的微乳递送系统等问题，本发明将重点考察不同肿瘤耐药逆转剂修饰辅料对微乳自组装能力的影响，以及各种逆转剂的修饰对整个递送系统逆转肿瘤多药耐药能力的差异。本发明的递药系统较之以往已公开的微乳系统的优势在于整合中西药抗肿瘤的优势，并将其整合至同一递药系统，实现逆转肿瘤多药耐药的能力，并发挥中西药的协同抗肿瘤作用。
[0028]本发明的中西药共传递微乳递药系统，不但可以将具有逆转肿瘤多药耐药功能的中药组分作为辅料的修饰剂，赋予递药系统逆转肿瘤多药耐药的功能，而且这些中药组分本身还具有抗肿瘤活性，可以也适合与易产生耐药的抗肿瘤化疗药物联合使用，因此该类的递药系统优势还在于为中西药联用提供了新的方案。
[0029]本发明的微乳递药系统适合用于药物和药物组配，尤其是作为可逆转肿瘤多药耐药、促化疗药物增效减毒、载药量高、广泛增溶、胃肠道中稳定的口服给药系统。同时，若将某些注射安全性已获确认的药用辅料作为载体所制备的递药系统，还可以用于注射治疗抗肿瘤。
[0030]本发明以包埋依托泊甙的薏苡仁油-人参皂苷Rh2微乳(ECG-ME)和依托泊甙市售制剂为例，体外采用Caco-2细胞系作为肠上皮细胞模型，比较了细胞对依托泊甙的摄取，并以A549和耐药型A549细胞系作为肺癌细胞模型，比较了 ECG-ME和依托泊甙市售制剂的体外抗肿瘤活性和逆转肿瘤多药耐药能力。
[0031]微乳体外摄取方案如下:
[0032]将新鲜制备的ECG-ME、依托泊甙市售制剂分别用不完全培养基精确配制成不同依托泊甙的浓度备用。Caco-2细胞培养至24孔细胞培养板中，待细胞生长至板壁80%密度，移去培养基，每孔加入400 μ L上述各浓度微乳稀释溶液，37°C下共孵育2h。移去药液，每孔用500 μ LX 3的PBS洗涤除去残留药液，200 μ L ΝΡ-40裂解液37°C下孵育30min裂解细胞。裂解液12000 X 5min离心，上清液取20 μ L，用BCA试剂盒测蛋白含量；另取100μ L上清液，加入100 μ L甲醇，涡旋振荡5min，12000X 5min离心，上清液HPLC测定，记录峰面积并计算药物测得含量。细胞摄取量为所测得药物的含量与细胞蛋白量的比佰。具体公式如下所示:
【权利要求】
1.一种可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，由中药油相辅料、多药耐药逆转剂及难溶性抗肿瘤化疗药物组成，其特征在于，本中西药微乳共传递系统中还含有表面活性剂、助乳化剂及水；所述中药油相辅料、多药耐药逆转剂、难溶性抗肿瘤化疗药物、表面活性剂、助乳化剂及水之间的重量比是40:5~30:1~4:10^35:10~20:80~200。
2.根据权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，其特征在于，所述油相辅料选自:薏苡仁油、油酸、橄榄油、蓖麻油或甘油酸三油脂之一。
3.根据权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，其特征在于，所述表面活性剂为RH40、吐温80、cremophor? EL、司盘20、人参皂苷，或其单体Rh2，Rg3, Rhl, Rgl, PPT, PPD 中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，其特征在于，所述助乳化剂为PEG-400、乙醇、异丙醇或丙二醇中的一种。
5.根据权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，其特征在于，所述多药耐药逆转剂选自:人参皂苷及其Rh2单体，Rg3单体，Rhl单体，Rgl单体，PPT单 体，PH)单体、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、gomisin E, D, G, F、汉防己碱、苦参碱、白花前胡甲素、泽泻醇B23-单乙酸酯或茶多酚中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，其特征在于，所述难溶性抗肿瘤化疗药物选自:依托泊甙、紫杉醇、阿霉素、环孢素A、替尼钼甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、尼莫地平、多烯紫杉醇，灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋吟。
7.根据权利要求1-6之一所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统，其特征在于，所述中药油相辅料、多药耐药逆转剂、难溶性抗肿瘤化疗药物、表面活性剂、助乳化剂及水之间的重量比是40:10~20:2~3:15~20:12~18:120~180。
8.权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统的制备方法，其特征在于，步骤如下: 1)取可逆转肿瘤多药耐药的中药组分加入至微乳油相中，室温搅拌2-8h混匀，取助乳化剂至上述混合体系中，继续室温搅拌2-6 h后加入表面活性剂搅拌至匀质状态，备用； 2)取难溶性抗肿瘤化疗药物加入至上述制备的混合体系中，室温或加热机械搅拌2-8h，直至无不溶物悬浮于体系，备用； 3)将去离子水恒速、缓慢、定量地滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌体系，直至出现透亮澄明的体系。
9.根据权利要求8所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统的制备方法，其特征在于，所述油相辅料为薏苡仁油，乳化剂为RH40，多药耐药逆转剂为人参皂苷Rh2，难溶性抗肿瘤化疗药物以依托泊甙，具体操作方法是: 1)取等质量比的薏苡仁油加入至人参皂苷Rh2和RH40中，室温搅拌4_6h至完全混匀，取与人参皂苷质量比2:1助乳化剂PEG-400至上述混合体系中，继续室温搅拌4-5 h，备用； 2)取与人参皂苷Rh2质量比的20:1难溶性抗肿瘤化疗药物依托泊甙加入至上述制备的混合体系中，机械搅拌4-6 h，直至无不溶物悬浮于体系，备用；3)将人参皂苷Rh2 6倍量的去离子水恒速、缓慢并定量地滴入上述制备的混合体系中，并不断匀速搅拌 体系，直至出现透亮澄明的体系。
10.权利要求1所述的可逆转肿瘤多药耐药的中西药微乳共传递系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61K31/704GK103948542SQ201410149596
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】陈彦, 瞿鼎, 周静 申请人:陈彦