专利名称：一种检测乙肝耐药的基因芯片、制备及检测方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体的说，本发明描述了一种耐药乙肝病毒检测芯片，以及该芯片的制备和检测方法。
背景技术：
目前，我国携带乙肝病毒的人群约有一亿二千万，且多为慢性携带状态，也就是说，这些人中绝大多数要终生携带病毒，而只有少数人有望将病毒自然清除。乙肝病毒并不直接引起肝细胞破坏，而是通过一种间接机制，先激活机体的免疫系统，然后在免疫系统攻击病毒的同时引起肝细胞损害.
目前临床上常用的治疗乙肝的药物按其作用可分为两大类，即保肝药和抗病毒药，当然这两种药的作用并不是截然分开的，常常是一种药物兼具两种作用。这是因为病毒与肝损害本来就密切相关。
抗病毒药主要用来抑制病毒复制，或直接破坏病毒.这类药又可分为两种，一种为免疫增强药或叫免疫调节药，通过提高机体的免疫功能而抑制病毒，其典型代表如干扰素，胸腺肽，抗乙肝免疫核糖核酸等.另一种为直接抗病毒药，以核苷类似物为主，如无环鸟苷，阿糖腺苷，拉米呋啶等.这类药物结构简单，可直接抑制病毒的复制而对机体的免疫系统影响很小。
慢性乙型肝炎到目前为止治疗效果还很不理想，其根本原因是由于病人体内HBV持久的存在及复制，不能被人体免疫功能和药物所清除，使肝脏病变持续发生及进展，因此，对乙肝病人治疗的关键是清除体内的HBV。1999年以来，在对乙肝病人的药物抗病毒治疗中，核苷类似物拉米呋啶得到广泛应用，疗效较为理想，但由于拉米呋啶的作用只是抑制HBV-DNA多聚酶的活性，使HBV-DNA的复制受到抑制，而不能清除HBV复制的原始模板，故应用拉米呋啶治疗慢性乙肝一般认为要长期服药，不能停用，而随着用药时间的延长，病毒发生变异而耐药的可能性越来越大，其服用一年耐药率为20％左右，二年在30％以上，逐年增加。对耐药病毒进行检测分型，针对不同的耐药病毒采用相应的药物及治疗方案是解决这一临床难题的方法之一。
基因芯片技术是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。其原理十分简单，即DNA的碱基配对和序列互补原理，但其应用范围却相当广泛。
基因芯片的制备方法多种多样，但其原理主要有两种1.原位合成法1996年美国Affymatrix公司生成出的第一块芯片就是用这种方法合成的。最初是采用原位光刻合成法，即在合成碱基的5’羟基末端连上光敏保护基，光照脱保护使之连在芯片上。后来经过技术的发展，又出现了原位喷印合成法，这种方法类似于喷墨打印，只不过把墨盒换成A、G、C、T四种碱基。
2.合成点样法即利用点样仪将事先合成的探针直接点在芯片上形成微陈列，所以又称microarray。探针和介质之间的连接主要是利用化学基因之间形成的化学健来完成的。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定，SNP分析等。但其缺点是合成寡聚合苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，它的最大优点是靶基因特异性非常好，用作检测诊断的结果非常可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片。
发明内容
本发明的目的在于应用国内外生物医药领域的基因芯片技术，设计出一种耐药乙肝病毒基因检测芯片。它具有特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠及适于批量样本检测的特点，适用于耐药乙型病 毒肝炎的血源检测，可用于临床诊断并指导治疗。
本发明通过将合成的耐药乙肝病毒寡核苷酸固定在修饰过的玻片上，形成砌砖样的矩阵样结构，制成耐药乙肝病毒检测芯片；对耐药病人血清进行抽提、逆转录、PCR、标记等一系列反应；然后将扩增产物与芯片杂交，根据其不同探针上的荧光信号的强弱来检测确定耐药病毒突变的位点。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是耐药乙肝病毒检测芯片，其中左边8排是涉及到的两个突变位点，右边两列为阳性参照兼定位点。
图2是待测样品的耐药芯片检测结果，其中左边第四排为与目的片段完全配对的序列，为耐药样品。
具体实施例方式
实施例1 耐药乙肝病毒检测芯片的制备按文献所载，在长期应用拉咪呋啶的过程中，有如下位点出现突变与乙型肝炎病毒的耐药有关。
L417ML515MF501LV542IN453TV515MV508LS548TT463NT519SL570IQ550HT463IL522IN573ST554AT470CA535VL575VI559ST485AM539IS558TL564VL499FM539V L564M根据以上的突变位点，我们选取了如下的核苷酸片段628bp TTT to CTTGTCCTGGGC TTT CGCAAAATAGTCCTGGGC CTT CGCAAAATAGTCCTGGGC GTT CGCAAAATAGTCCTGGGC ATT CGCAAAATA648 bp GTG to CTGCCTATGGGA GTG GGCCTCAGT
CCTATGGGA CTG GGCCTCAGTCCTATGGGA ATG GGCCTCAGTCCTATGGGA TTG GGCCTCAGT经氨基修饰后用TE溶解成100uM的原液，原液再用TE稀释成20uM，临点样前用spotting solution对半稀释成10uM，进行点样，点样矩阵图像见图1。
点样完成后，水合30min，用0.2％SDS洗涤2min，重复一次，再用水洗涤2min，重复一次，晾干，点样区用NaBH4封闭5min，用0.2％SDS洗涤1min，重复两次，用水冲洗干净，晾干，4℃保存。
实施例2 待测样本的制备1.血清抽提取100ul被检血清，加入裂解液200ul，用振荡器充分混匀，置冰上10分钟；加入(酸性)酚∶氯仿(1∶1)300ul，用振荡器充分混匀至无颗粒状态；13000rpm离心10分钟；取出上清200-230ul，加入等体积的预冷异丙醇(-20℃)、1ultRNA，混匀，13000rpm，0℃离心20分钟；轻轻将液体全部倒掉，在滤纸上沾干残留部分；加入500ul的75％预冷的酒精(-20℃)，颠倒混匀(缓慢)，13000rpm离心5分钟；轻轻倒掉液体，在滤纸上沾干残留部分，室温晾干；用20ul去离子水溶解。
2.反转录及PCR扩增取RT-Mix(13ul/人份)，加入模板(6.5ul/人份)，70℃水浴15分钟，之后立即置于并冰上1分钟；然后加入逆转录酶(0.5ul/人份)，混匀，42℃水浴30分钟，进行反转录反应；75℃灭活15分钟。
取PCR-MIX(20ul/人份)，加入反转录产物(5ul/人份)，进行试剂处理和PCR扩增。
试剂处理 37℃ 10分钟
PCR程序如下94℃ 5分钟 3.标记PCR取标记-MIX(23ul/人份)，进行试剂处理；试剂处理程序37℃ 10分钟94℃ 5分钟加入第一次PCR产物(2ul/人份)，进行标记PCR扩增，标记PCR程序同上。
实施例3 杂交检测1.PCR产物沉淀在各管中分别加入2ul tRNA和2ul鱼精DNA，NaAc2.5ul和无水乙醇50ul；混匀后于-20℃放置30分钟；3000rpm离心15分钟；弃上清，在沉淀中加入300ul预冷的75％酒精(4℃)；13000rpm离心10分钟；弃上清，自然晾干。
2.杂交以7.5ul去离子水溶解沉淀，加入7.5ul杂交液，混匀；94℃变性3分钟，立即置于冰上；把15ul混合液全部加在点样区，盖上盖玻片，放进杂交舱；把杂交舱置于垫有湿巾纸的铝盒内，48℃杂交30分钟。
3.洗脱用40℃预热的0.1×SSC溶液冲掉盖玻片，使其自然脱落；放入40℃预热的0.2％×SDS+2×SSC中洗25分钟；取出，再放入40℃预热的2×SSC中洗10分钟；避光晾干。
实施例4 扫描，分析结果将诊断芯片插入ScanArray 3000扫描仪中根据点样位置进行扫描，并使用Imagene软件分析杂交结果。检测监控系统对照有荧光信号；在疾病诊断系统中根据信号的有无强弱来判断待测样品的耐药情况，扫描结果见图2。
权利要求
1.一种检测乙肝耐药的基因芯片，其特征在于该芯片载有耐药乙肝病毒突变位点的特征性核苷酸序列。
2.一种制备权利要求1所述的检测芯片的方法，包括耐药乙肝病毒特征性核苷酸序列的制备、转化、测序验证，靶基因的制备纯化、步骤，点样，其特征在于(1)耐药乙肝病毒特征性核苷酸序列通过RT-PCR和nest-PCR方法获得的；(2)含有经过测序验证的耐药乙肝病毒特征性核苷酸序的质粒作为PCR扩增的模板，经过两次扩增后，纯化PCR产物，得到样品；(3)将样品按照点样矩阵的要求点于玻片上，干燥后，去除背景干扰。
3.一种利用如权力要求1所述的乙肝耐药检测芯片检测待检测样本中耐药情况的方法，包括从待检测样本中抽提核酸，反转录扩增，标记荧光，杂交，检测，分析，其特征在于(1)利用HBV核酸抽提液从待测样本中分别抽提乙肝病毒核酸；(2)利用反转录试剂进行RT-PCR；(3)利用末端标记和全长标记的方法对PCR产物进行标记；(4)利用杂交试剂将探针和检测芯片进行杂交；(5)将杂交后的检测芯片进行扫描；(6)利用软件分析杂交结果，得出检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测乙肝耐药的基因芯片，此基因芯片的制备方法。本发明还公开了此基因芯片用于检测乙肝耐药情况的方法，以及结果的分析方法，诊断乙肝耐药的情况并指导治疗。
文档编号C12Q1/68GK1405323SQ0112643
公开日2003年3月26日 申请日期2001年8月9日 优先权日2001年8月9日
发明者吴海, 王炜, 董爽, 郭慧, 张翼 申请人:上海博华基因芯片技术有限公司