基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法
【专利摘要】本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及基于HepG2?HBV?rtS202G?ETV耐药变异株细胞系及其建立方法，本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD，其载体骨架为pREP10载体，HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为恩替卡韦耐药基因型S202G后插入切除RSV启动子的pREP10构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-S202G；将该质粒转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与HepG2.2.15细胞株比较后，获得耐药HBV细胞株HepG2.HS202G，保藏号为CGMCC?No.6393。该细胞系可用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。
【专利说明】基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立
方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，涉及HBV细胞模型，具体涉及基于HepG2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法，该细胞系可用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。
【背景技术】
[0002]研究显示，HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具，在研究发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中有重要的作用。IfepG2.2.15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-Ι重组载体转染H印G2细胞，经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。目前H印2.2.15仍是应用最为广泛的HBV细胞模型。近年来以拉米夫定为代表的核苷类似物类抗HBV药物的临床应用在为慢性乙型肝炎(CHB)患者带来福音的同时，也带来了严重的耐药问题，目前临床上对于应用的核苷类(似)药物如拉米夫定、阿德福韦以及恩替卡韦均可检出相应的耐药病毒株。由于目前恩替卡韦为国内慢性乙肝患者的一线用药，虽然其高耐药屏障可以迅速抑制病毒并且耐药发生率明显低于拉米夫定以及阿德福韦，但是长期临床使用发现恩替卡韦耐药病毒株也在逐年增多，对于恩替卡韦耐药的患者可加用替诺福韦继续治疗，但国内并未上市以及其价格较为昂贵。一般临床上对于恩替卡韦耐药患者只能增加恩替卡韦剂量以联合阿德福韦继续治疗，因此，明显加重了患者的经济负担以及治疗顺应性。目前对于HBV耐恩替卡韦的分子生物学机制以及筛选新型药物的研究成为重点。目前已知耐核苷类药物HBV的基因变异主要集中于反转`录区(RT区)，临床最广泛的耐药恩替卡韦病毒株为在rtM204V即YVDD变异基础上再次发生T184、S202或M250的变异，可以导致HBV对于拉米夫定以及恩替卡韦的敏感性明显下降，由于RT区核苷酸变异影响耐核苷类药物HBV变异株的复制能力，耐药HBV病毒株的复制能力往往低于野生型约50-100倍左右，由HBV耐药变异株基因构建稳定表达HBV变异株细胞系的难度也相应增高。目前仅有少量文献报道耐拉米夫定和阿德福韦HBV细胞系的建立，但相应病毒产量以及病毒蛋白合成明显低于传统的HBV细胞系!fepG2.2.15，并且没有稳定表达恩替卡韦耐药细胞系的建立报道。
[0003]在HBV耐恩替卡韦病毒株逐年上升的临床背景下，HepG2.2.15不能完全满足对于耐药HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，本发明拟在前期构建耐拉米夫定以及阿德福韦HBV细胞系的基础上，建立一种能够稳定表达HBV耐恩替卡韦变异株的肝癌细胞系。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于为满足对于耐药HBV病毒株的研究，为研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，提供基于H印G2 HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系及其建立方法。
[0005]本实验室在前期构建野生型、耐拉米夫定以及阿德福韦变异型细胞系基础上进一步构建耐恩替卡韦HBV细胞株，该细胞株尤其适合实验室研究用。
[0006]本发明采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD，(福建医科大学分子病毒实验室)其载体骨架为PREPlO载体，该载体相对优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-1基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达；HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为恩替卡韦耐药基因型S202G后插入切除RSV启动子的pREPIO构建成HBV真核表达质粒PREP-HBV-S202G ;将该质粒转染H印G2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与H印G2.2.15细胞株相比较后，确立耐药HBV细胞克隆株的建立。经检测，结果显示该耐药HBV细胞克隆株pREP-HBVA181V能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可以产生感染性HBV颗粒，通过基因测序产生HBV基因序列与所转染质粒相同。与目前广泛使用的H印2.2.15相比，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于!fep2.2.15，细胞上清HBV颗粒水平与略低于H印G2.2.15。
[0007]该细胞株命名为H印G2.HS202G,已于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，中心保藏登记编号CGMCC N0.6393。
[0008]本细胞株H印G2.HS202G通过下述方法构建，
[0009]1.质粒转染H印G2细胞
[0010]①细胞培养:!fepG2细胞以DMEM培养液培养；
[0011]②细胞转染:将处于生长对数期的细胞，经胰酶消化，继续培养后，按一定的转染量，与转染试剂混合，同时与稀释的质粒DNA混和，后继续培养；
[0012]2.潮霉素筛选细胞克隆
[0013]①转染后细胞培养24小时后扩大培养并设空白对照(未转染HepG2细胞)；
[0014]②待细胞贴壁后加入潮霉素；
[0015]③换液培养；
[0016]④待空白对照细胞死亡后观察细胞克隆生长情况；
[0017]⑤挑取细胞克隆，以潮霉素继续培养；
[0018]⑥待细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平；
[0019]⑦获取HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆株，将阳性克隆传至6孔培养板以潮
霉素继续培养；
[0020]3.细胞克隆的有限稀释
[0021]细胞传至20代左右，有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆；
[0022]将处于生长对数期的细胞，胰酶消化，吹打成单个细胞悬液，计数后，细胞密度稀释，接种含潮霉素培养基，继续培养，待细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，获得稳定表达病毒颗粒以及病毒蛋白的细胞克隆，并命名为H印G2.HS202G。
[0023]4.高表达HBV YVDD变异株的生物学特征及表型耐药分析
[0024]细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测
[0025]HBsAg 及 HBeAg 精确定量试剂盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagentkit 和Archipct HBeAg Reagentkit 7HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供说明书，real-timePCR扩增仪采用AB1-7300，检测结果(如图1所示)显示:
[0026]本发明所述的H印G2.HS202G细胞株已稳定传代20余代，能稳定表达病毒颗粒以及HBsAg以及HBeAg病毒蛋白，其HBsAg约200IU/ml左右，HBeAg约200S/C0左右，较H印G2.2.15高约5-10倍左右，上清HBV-DNA约IO4-1O5左右，略低于H印G2.2.15。
[0027]本发明所述的H印G2.HS202G细胞株进行了细胞内HBV复制情况检测，
[0028]细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液，37°C过夜后加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE，1.3%凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交，结果显示有HBV杂交信号，表明细胞内存在HBV复制，但较H印G2.2.15细胞为低(如图2所示)。
[0029]该细胞系能满足对于耐药HBV病毒株的研究，可用于筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是H印G2.HS202G细胞株稳定传代20余代，能稳定表达病毒颗粒以及HBsAg以及HBeAg病毒蛋白。
[0031]图2是细胞内HBV复制检测结果，其中显示有HBV杂交信号，提示细胞内存在HBV复制，但较H印G2.2.15细胞为低。
【具体实施方式】
[0032]实施例1构建细胞株H印G2.HS202G`[0033]2质粒转染H印G2细胞
[0034]①细胞培养:!fepG2细胞以DMEM培养液(Gibco公司，含10%小牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，0.03%谷氨酰胺)培养
[0035]②细胞转染:将处于生长对数期的细胞，以0.25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数。按5 X IO5细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90%融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染。按照每孔转染2 μ g 的量，将 50 μ I OptiDMEM 培养液与 5 μ lLipofectamin2000 转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2 μ g质粒DNA稀释于50 μ I OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟。将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟。将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养。
[0036]2)潮霉素筛选细胞克隆
[0037]①转染后细胞培养24小时后扩大培养至IOcm培养皿，并设空白对照(未转染HepG2细胞)
[0038]②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml
[0039]③每3天换液一次
[0040]④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况
[0041]⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养
[0042]⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平
[0043]⑦共获取HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆共2株，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养
[0044]3)细胞克隆的有限稀释
[0045]4株阳性克隆中I株细胞克隆HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为120-150IU/ml左右，HBeAg水平100 S/C0左右，HBV-DNA水平维持于104-105copies/mL.细胞传至20代左右，有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆。
[0046]将处于生长对数期的细胞，以0.25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为IOcelΙ/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml)。显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种Icell的培养孔，继续培养，每周换液一次。2-3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养。待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的细胞克隆继续传代观察病毒颗粒以及病毒蛋白稳定表达情况，并且命名为 H印G2.HS202G。
[0047]4)高表达HBV YVDD变异株的生物学特征及表型耐药分析
[0048]细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测
[0049]HBsAg 及 HBeAg 精确定量试剂盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagentkit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供说明书，real-timePCR扩增仪采用AB1-7300，检测结果显示， H印G2.HS202G细胞株稳定传代20余代，能稳定表达病毒颗粒以及HBsAg以及HBeAg病毒蛋白，其HBsAg约200IU/ml左右，HBeAg约200S/C0左右，较H印G2.2.15高约5-10倍左右，上清HBV-DNA约IO4-1O5左右，略低于H印G2.2.15 (如图1所示)；
[0050]进行细胞内HBV复制情况检测，细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液，37°C过夜后加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE，
1.3%凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交，结果显示有HBV杂交信号，表明细胞内存在HBV复制，但较H印G2.2.15 细胞为低(如图2所示)。
【权利要求】
1.基于H印G2HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系，其特征在于，该细胞株保藏登记编号为 CGMCC N0.6393，命名为 H印G2.HS202G。
2.按权利要求1所述的基于H印G2HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系，其特征在于，所述的H印G2.HS202G细胞株稳定传代20余代，稳定表达病毒颗粒以及HBsAg以及HBeAg病毒蛋白，其 HBsAg200IU/ml，HBeAg200S/C0,较 H印G2.2.15 高 5-10 倍，上清 HBV-DNA104-105。
3.按权利要求1所述的基于H印G2HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系，其特征在于，所述的H印G2.HS202G细胞株存在细胞内HBV复制。
4.权利要求1的基于H印G2HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系的构建方法，其特征在于，其包括: 采用HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD，其载体骨架为pREPIO载体，HBV复制子为含cp启动子以及完整HBV前基因组的HBV1.2倍体，并定点诱变为恩替卡韦耐药基因型S202G后插入切除RSV启动子的pREPIO构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV_S202G ;将该质粒转染HepG2细胞后通过潮霉素筛选后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与H印G2.2.15细胞株比较后，确立耐药HBV细胞克隆株H印G2.HS202G的建立。
5.权利要求1的基于H印G2HBV rtS202G ETV耐药变异株细胞系在制备筛选抗药物、研究HBV生物学特点及其与·细胞间相互作用的HBV细胞模型中的用途。
【文档编号】C12Q1/02GK103820392SQ201210469842
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月18日 优先权日:2012年11月18日
【发明者】张轶俊, 张继明 申请人:复旦大学附属华山医院