一种免洗抗菌凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及临床消毒技术，具体涉及一种新型免洗抗菌凝胶的制备方法与应用。

背景技术：

耐药细菌感染是临床抗感染治疗中极为棘手的问题，也是造成重症感染死亡的首要原因。2014年世界卫生组织《全球抗生素耐药报告》发出警告，耐药致病菌在全世界范围内继续蔓延扩散，多重耐药和新耐药细菌持续不断出现，耐药菌感染所致疾病的死亡率依然不断攀升。美国疾病控制与预防中心(cdc)最新调查数据显示，美国每年耐药细菌感染的人数高达200多万，有耐药菌感染所致死亡人数达23000余人，每年用于对抗耐药菌感染的费用高达350亿美元。我国细菌耐药监测网(carss)最新监测数据显示，目前临床感染常见的致病菌已经对大多数一线主流抗生素产生耐药，特别是临床分离的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(mrsa)和甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(mrse)检出率依然较高。在我国广州地铁检等公共设施超级细菌耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)的检出率为2.5％。为了严格控制感染，加强个人卫生防护、去除手部细菌接触是有效预防耐药菌感染和传播的重要措施。特别是医院中人流量大、耐药细菌分布密集，患者和家属、以及医务人员在就诊和治疗等过程中，互相接触的机会较多，做好手部皮肤的清洁与消毒是防止医院感染的重要措施，以及术前进行手部消毒对于防止手术患者的医院感染起着至关重要的作用。因此，研制能有效杀灭多重耐药细菌的免洗消毒凝胶具有重要临床意义和应用价值。

目前免洗消毒凝胶的种类繁多，其中皮肤消毒剂的成分及含量各有不同。免洗消毒凝胶所采用的溶剂主要为易挥发的有机溶剂，常用的为醇溶剂，尤其采用乙醇、异丙醇为最多，但是这些成分存在消毒作用时效不长、效果不理想、对皮肤刺激较大、易燃等缺点。此外，传统的抑菌或抗菌凝胶或洗手液不能有效杀死耐药细菌，抗耐药细菌效果较差。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种免洗抗菌凝胶。

本发明的免洗抗菌凝胶的制备原料包括：3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素、卡波姆、甘油、乙醇和水。

进一步，免洗抗菌凝胶由3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素、卡波姆、甘油、无水乙醇和去离子水制备而成；其中3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素的质量/体积百分比为0.1％、卡波姆的质量/体积百分比为0.6％、甘油的体积百分比为5.0％、无水乙醇的体积百分比为45％，去离子水的体积百分比为50％。

本发明的另一目的在于提供上述免洗抗菌凝胶的制备方法。

本发明的制备方法包括：在甘油、卡波姆和水的混合溶液中加入配方量的3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素乙醇溶液。

采用试管法检测免洗抗菌凝胶的最低抑菌浓度，以市售洁芙柔免洗消毒凝胶为对照，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为抗菌对象，进行最低抑菌浓度的检测。结果表明本发明制备的免洗抗菌凝胶对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明显的杀菌作用，对上述四株细菌的最低抑菌浓度为15.625‰(v/v)，此时3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素的浓度为16μg/ml，对耐药细菌的杀菌活性强于对照凝胶的杀菌活性。

采用试管法检测免洗抗菌凝胶的杀菌曲线，以金黄色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐药菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，xj75302)、usa300(lac)，中度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(mu50atcc700699)为检测菌进行杀菌活性的测定。杀菌曲线结果显示，与对照组相比，凝胶浓度为15.625‰(v/v)对上述四种菌株有明显的杀菌作用，随着作用时间的延长，细菌数逐渐降低。

采用mtt法检测化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范围内对人表皮细胞和人静脉内皮细胞生长的影响，结果显示在上述浓度范围内化合物对人表皮细胞和人静脉内皮细胞没有毒性。

在sd大鼠完整皮肤，连续涂抹免洗抗菌凝胶14d，给药侧皮肤均未见红斑和红肿，与对照侧皮肤比较未见异常。试验期内，试验动物受试侧皮肤最高积分均值为0，刺激强度属无刺激性。

附图说明

图1为本发明的有效成分3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素的核磁共振图谱；

图2为本发明的免洗抗菌凝胶的杀菌曲线。

具体实施方式

实施例1：3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素的合成路线及方法为：

a：将适量的4-羟基香豆素和无水乙醇混合后加热至4-羟基香豆素溶解；

b：加入3-溴-4-氟苯甲醛，加热回流；

c：有固体颗粒析出，继续加热，待反应结束，冷却、抽滤，再用乙醇重结晶，最终得纯白色颗粒状结晶。

结构鉴定：

利用质谱(ms)、核磁共振波谱(nmr)、红外吸收光谱(ir)和紫外吸收光谱(uv)等有机波谱，对合成的3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素进行分子量、结构和纯度等鉴定。

鉴定结果为：

3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素

3,3′-(3-bromo-4-fluorobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)

1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.885-7.901(d,3h),7.763(s,2h),7.562-7.601(t,2h),7.279-7.357(m,4h),6.403(s,1h).

化合物对表皮细胞和静脉内皮细胞毒性评价

第一步，培养人表皮细胞(hacat细胞系)和人静脉内皮细胞(huvec细胞系)，收集细胞，用细胞计数板进行细胞计数，按照2.5×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板中，5％co2、37℃孵箱中培养。

第二步，实验前弃去培养基，用pbs淋洗细胞3次。对照组设为3列24个孔，加入含10％胎牛血清的dmem培养基100μl，dmso浓度共8个梯度，从化合物最高浓度32μg/ml和dmso浓度1％开始，向下倍比稀释，5％co2、37℃孵育8～24h。

第三步，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h后终止培养，倒去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，低速震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪od490nm处检测各孔的吸光度值。

结果如表1所示，与空白对照组相比，化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范围内对人表皮细胞和静脉内皮细胞生长没有统计学差异，显示化合物对上述细胞活性没有影响，毒性较低。

表1.化合物对表皮细胞和静脉内皮细胞毒性试验

实施例2：本发明免洗抗菌凝胶的制备

在本实施例中，免洗抗菌凝胶具体制备步骤如下。

第一步，将0.6g卡波姆940、5ml甘油和适量去离子水搅拌混合后在50～60℃的水中微热30min。

第二步，放置过夜，使卡波姆940充分溶胀。

第三步，将100mg3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素溶解在45ml无水乙醇中，搅拌均匀，将该溶液缓慢加入到步骤二的混合溶液中，边加边搅拌。

第四步，加入适量去离子水配至100ml，将凝胶ph值调至6～7。

ph调节剂可选用三乙醇胺。

另外一种制备方法中，用卡波姆941替换实施例2中的卡波姆940。

又一实施方案中，用卡波姆934替换实施例2中的卡波姆940。

实施例3：实施例2免洗消毒凝胶的最低抑菌浓度测定

第一步，免洗抗菌凝胶和对照凝胶的梯度稀释方法：吸取100μl制好的免洗抗菌凝胶加入96孔板的每排第1号孔内，l号孔经混合后吸出100μl，加入2号孔内，依次倍比稀释至8号后，吸出100μl弃去，这样凝胶的的梯度浓度依次为50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰(v/v)，相对应的3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素浓度为512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。阳性对照为洁芙柔免洗手消毒凝胶，阴性对照为不含有3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素的凝胶。此外，设置单独使用梯度浓度的3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素溶液作为对照。

第二步，检测菌的准备：取冻存于-20℃的金黄色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)以及中度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(mu50atcc700699)四种检测菌，划线接种于m-h琼脂培养基，在孵箱(35±2℃)中孵育20～24h。次日挑取单克隆菌落，接种于3mltsb培养基中，180rpm、37℃摇菌过夜。处于对数生长期的细菌菌液，用m-h肉汤培养基校正浓度至od630＝0.1(含菌量约10⁸cfu/ml)，再用m-h肉汤1:1000稀释(含菌量约10⁵cfu/ml)。稀释后的菌液应在15min内接种。

第三步，检测菌的接种：用微量加样器取100μl稀释后的菌液依次加到96孔板中，最终接种细菌浓度为每孔5×10⁴/ml。这时从第1孔到第8孔药物的浓度依次为25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰、1.953125‰(v/v)，相对应的3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素浓度为256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml。振荡1min，使各孔内菌液混匀，微孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并置湿盒内35℃孵育16～20h。同时每组设无凝胶生长对照孔(即只加100μlm-h肉汤和100μl复苏后的菌液)和无菌对照孔(即只加200μlm-h肉汤)。

第四步，结果判断：无菌对照孔在整个试验过程中应始终保持清亮，表明整个实验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状，孔底出现沉淀等)相比较进行判断，无肉眼可见生长的最低凝胶浓度为测定凝胶对检测菌的最低抑菌浓度(mic)。

结果如表2所示，可以看出，免洗消毒凝胶对金黄色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明显的杀菌作用，对上述四个细菌的最低抑菌浓度为15.625‰，此时3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素浓度为16μg/ml。与对照免洗手消毒凝胶和阴性对照凝胶相比，本发明免洗抗菌凝胶对药物敏感菌和多重耐药的金黄色葡萄球菌均有明显杀菌活性，且比单独使用3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素的抗菌活性高(由表2所示，本发明免洗抗菌凝胶内含16μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素时有抑菌效果，3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素水溶液中内含32μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素时有抑菌浓度)。

表2.免洗抗菌凝胶的最低抑菌浓度

实施例4：实施例2免洗抗菌凝胶杀菌曲线的测定

第一步，取无菌锥形瓶8个，分别标记为“生长对照和免洗抗菌凝胶”。每瓶分别加入6ml营养肉汤。

第二步，在免洗抗菌凝胶标记的锥形瓶中加入定量免洗抗菌凝胶，其浓度为15.625‰(v/v)，生长对照组加同等体积的去离子水。

第三步，在各锥形瓶中加入6μl浓度为0.5麦氏比浊标准的待测菌液金黄色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(mu50atcc700699)，各管菌液的最终浓度约为10⁵cfu/ml。

第四步，加菌后立即将锥形瓶均匀涡旋15s，倍比连续稀释1000倍后，分别取0.1ml菌液接种于m-h琼脂平板上(各接种两份)，用l型玻棒均匀涂布接种，35℃孵育过夜后做菌落计数，并取其平均数。

第五步，37℃分别培养0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18h后，将锥形瓶均匀涡旋15s，同上法倍比连续稀释100～10⁷倍后，分别取0.1ml菌液接种于m-h琼脂平板上(各接种三份)，35℃孵育过夜后，取菌落数在30-300之间的平板计数，并取其平均数。

第六步，cfu＝三块板的菌落平均数×稀释倍数，即为原液中每毫升菌液中的活菌数。肉眼计数不同时间点的菌落，并求其平均值，从而在对数坐标纸绘制不同时间点的杀菌曲线图。

结果如图2所示，与对照组相比，抗菌凝胶作用后的金黄色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(mu50atcc700699)的生长均受到明显的抑制。随着作用时间的延长，抗菌凝胶作用后的上述四种细菌菌落数逐渐减少，说明抗菌凝胶对药物敏感菌和多重耐药的金黄色葡萄球菌有快速、明显的杀灭作用。

实施例5：实施例2抗菌凝胶皮肤刺激试验

第一步，选健康、成年、皮肤无损伤的sd大鼠10只，将实验动物背部脊柱两侧背毛剪掉，不损伤表皮，去毛范围1.5cm×1.5cm。

第二步，取免洗抗菌凝胶受试物0.5ml直接涂在皮肤上，然后用二层纱布(2cm×2cm)和一层无刺激油纸覆盖，再用无刺激胶布固定，另一侧作为对照。刺激4h后，用生理盐水除去残留受试物。

第三步，每天涂抹1次，连续14d，每次涂抹后24h观察结果。

结果表明，连续涂抹14d，给药侧皮肤均未见红斑和红肿，与对照侧皮肤比较未见异常。试验期内，试验动物受试侧皮肤最高积分均值为0，刺激强度属无刺激性。