专利名称：一种快速检测乙型肝炎病毒耐药基因变异的方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒相关基因变异的方法，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关基因变异的方法及其快速诊断试剂盒。
背景技术：
在历年法定甲乙类传染病发病情况报告中，乙型肝炎一直高居首位，严重威胁人类的健康，估计全球有20亿人感染。据国家卫生部2003年8月最新公布的数字，截至2002年底，全国乙肝病毒携带者达到1.3亿人，慢性乙型肝炎患者有2000余万例，占人口总数的1.57％。其中50％～75％有活跃的病毒复制和肝脏炎症改变，部分慢性肝炎可进展为肝硬化、肝衰竭或原发性肝癌。
乙肝治疗的周期长，医药费用昂贵，给国家和个人带来了严重的经济负担。目前临床使用的抗病毒药物主要有α-干扰素(IFN-α)和拉米夫定(Lamivudine，3-TC)。α-干扰素(IFN-α)是目前乙型肝炎治疗中抗病毒的首选药物，其对乙型肝炎的治疗效果(HBV DNA消失、HBeAg转阴)报道不一，一般在20-40％之间(Mauracher E，Gut，3499-10，1993；Korenman J et al，Ann Intern Med，114629-634，1991)，除治疗应答率低下、价格昂贵外，长期使用干扰素具有较大的副作用。拉米夫定(Lamivudine，3-TC)原为抗HIV感染的核苷类药物，近年发现短期内对乙型肝炎病毒的复制有较好的抑制作用(Hadziyannis SJ et al，Hepatology，32847-851，2000)。然而它的主要缺点为易产生耐药，一旦出现耐药，药物对病毒复制无抑制作用，血清HBV DNA的水平回升，对病毒的感染无根除作用。停药后病毒可高度复制而导致肝炎的爆发或加剧(Yuen MF et al，Hepatology，34785-791，2002)。
病毒变异不断地在自然界中发生，或在药物压力下产生，是病毒遗传进化的基本因素。有报道，乙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HBV)基因的P区、前S/S区、前C/C区、X等区都会发生基因变异。P基因区占整个病毒基因组的75％，分为5个区(A，B，C，D和E)，主要编码DNA多聚酶。这些区域可与核苷酸或模板结合，具有催化活性，负责病毒基因的复制。近年来，核苷类药物，如拉米夫定已经成为乙型肝炎治疗的主要药物之一，而在用核苷类药物治疗患者中，最大的问题是P区基因相关位点发生突变，导致病毒对核苷类药物发生耐药。拉米夫定能显著降低HBV DNA水平，并可使ALT正常化和肝组织学改善。但若长期治疗，则在编码DNA多聚酶的YMDD基序会发生变异，这种耐药突变主要是YMDD基序上第552位的蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)替代(M552I或M552V)，M552V突变常常与L528M的变异联合发生。一般认为YMDD突变后HBV DNA常常反跳引起活动性肝炎。YMDD变异株在转染细胞系中的复制活性低于野毒株，然而对拉米夫定敏感性降低1000-10000倍。临床上，随着血清YMDD突变株的出现，HBV DNA可重新回升，部分病人出现肝炎急性发作，甚至肝功能失代偿。因此，检测HBV P区基因的变异可以及时了解患者治疗疗效，随时调整治疗方案，对乙型肝炎临床核苷类似物药物治疗具有重要的指导意义。
目前检测HBV基因变异的方法除了基因测序外，还有线性探针法(Line ProbeAssay，LiPA)、杂交双探针荧光检测技术、寡核苷酸基因芯片，限制性内切酶多态性分析、单链构象多态性分析(SSCP)、高效液相色谱(DHPLC)和实时荧光定量多聚酶链式反应(Real-time PCR)技术等。目前，应用实时荧光定量PCR技术进行基因突变分析的方法是基于比较野生型和突变型基因扩增产物的熔解曲线和Tm值，比较二者之间的差异来判断样品中病毒基因是否存在变异。由于乙型肝炎患者的体内病毒滴度不同，经拉米夫定治疗后存在的变异常为混合变异，即YMDD、YIDD、和YVDD三者间的共生，加上它们之间的比例不一，高拷贝的毒株会竞争性的掩盖低拷贝的变异毒株，通过比较熔解曲线和Tm值的差异判断基因变异的方法难以检测出HBV基因确切的变异情况，对混合突变的检测也无能为力。传统的测序技术虽然准确，但由于耗时、实验繁琐、对序列进行专业比对等缺点限制了其广泛应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服传统检测方法的缺陷，提供一种简便、快速、准确率高的检测乙型肝炎病毒耐药基因变异的方法，具体涉及一种用荧光定量聚合酶链式法检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关基因变异的方法。
本发明的进一步目的是提供用于该方法的快速诊断试剂盒。
本方法利用实时荧光定量PCR MGB(minor groove binder)Taqman探针技术，依据HBV拉米夫定耐药主要突变区YMDD核酸序列，设计引物及探针检测HBV YMDD区域的基因变异。
本方法利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入不同荧光(FAM，HEX)标记的两条探针，分别和同一基因的两种突变基因序列相对应，两个探针的5’端标以荧光发射基团FAM或HEX标记，靠近3’端标以荧光淬灭基团(quencher)，同时3’端结合上M6B，即DNA小沟结合物，是源于某些抗菌素分子的化学基团，其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，有效提高探针的退火温度，探针的3’端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。反应体系中的两种探针其中一条可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，另外一条探针由于有一个碱基序列不同，杂交温度大为降低，不能杂交到DNA模板上。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，检测波长处光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合处切断探针，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放，结果中被检测到的荧光信号所标记的探针，对应于检测区域的突变基因。
本发明方法包括下述步骤a、根据乙型肝炎病毒拉米夫定耐药性相关突变位点的靶基因序列设计、合成一对引物，靶基因片段长度最优为50-200个碱基；b、根据靶基因序列在引物之间设计、合成多个荧光探针，分别针对不同的变异基因；c、使用步骤a中的引物和步骤b中的荧光探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，其中镁离子浓度为5mM，Taq酶的用量为0.25单位/反应；d、从待测血清标本中采用Chelex100抽提乙型肝炎病毒DNA，加入步骤c中的荧光聚合酶链式反应体系，在荧光定量PCR仪，或普通PCR仪上进行扩增实验；e、进行30-50个循环的聚合酶链式反应，循环中或循环结束后移至可读终点荧光的仪器上读取荧光值，将扩增产物的荧光信号与域值进行比较，判定与探针对应的突变情况；f、对于存在混合突变的样品，根据各探针反应时扩增曲线的Ct值比较估算出混合突变病毒毒株的大致比例。
步骤a中所述的两个引物之间相距50-200碱基，扩增的靶基因片段长度为92bps。
步骤b中所述的荧光探针为MGB-Taqman探针，长度为15-30碱基，5′端以FAM或HEX标记，3′端以MGB-quencher标记。
步骤a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药性相关突变位点的特异性基因序列为1 GTAGGGCTTT CCCCCACTGT TTGGCTTTCA GCTATATGGA TGATGTGGTA51 TTGGGGGCCA AGTCTGTACA ACATCTTGAG TCCCTTTTTA CC步骤a中所述的引物序列为引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′步骤b中所述的荧光探针的序列为探针15′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′探针25′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′探针35′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′Taq酶是指具有3′→5′DNA聚合酶活性，5′→3′外切酶活性的耐高温聚合酶，最好是95℃半衰期大于40分钟的高温聚合酶。
阴性对照模板为阴性献血员血清，经乙肝两对半免疫测定和HBV核酸保守区PCR检测，各项指标均为阴性。
荧光激发光FAM和HEX荧光基团的激发波长分别为490nm和530nm，二者检测波长分别为520nm和555nm。
本发明采用PCR反应混合液A、PCR反应混合液B、Taq酶、HBV DNA抽提试剂、阴性质控品、ddH2O组成PCR试剂盒。
本发明对上述试剂进行优化改进制备试剂盒，经过改进的试剂配方具有更高的扩增效率，能快速准确检测出特定位点基因突变情况，并能对混合突变的病毒基因比例进行相对定量。此外本试剂盒不仅可以在实时荧光定量PCR仪上进行检测，也可在普通PCR仪上扩增后将产物移至常规荧光检测仪上读取荧光值，判断与相应探针对应的基因突变类型，因此不受医疗机构仪器设备的条件限制，易于普及。
选取经克隆测序确认的临床乙肝患者拉米夫定治疗前及治疗不同阶段的血清标本共68例，用乙型肝炎病毒拉米夫定耐药基因突变检测试剂盒进行检测，检出率为98.53％，对于YMDD、YIDD、YVDD共生的标本也能检出，准确率为100％(表1)。对35份YMDD(5份)、YIDD(5份)、YVDD(5份)、YMDD/YIDD(5份)、YMDD/YVDD(5份)、YIDD/YVDD(5份)、阴性血清(5份)标本重复实验三次，结果重复性达100％，表明试剂盒的重复性和稳定性较好。表1是试剂盒检测与测序比对表。
表1
本试剂盒与目前市场上检测突变的试剂盒相比具有以下优点1)准确常规测序方法往往难以将共生的病毒毒株全部挑出，通常只能测到其中的一种病毒毒株；通过荧光定量PCR、比较熔解曲线和Tm值差异的方法也只能检测出占优势的病毒毒株，会漏检所占比例较少的病毒毒株，因此不能代表患者体内病毒的真实变异情况。2)可以对共生的病毒毒株的相对比例进行估算，了解患者用药治疗后体内病毒发生变异的变化情况，随时掌握治疗的疗效，有利于监控疗效、调整治疗方案。3)快速从抽提HBV DNA到出报告整个过程只需2-3小时，比测序等其他检测突变的方法省时、简便。
图1为荧光探针PCR反应检测YMDD、YIDD、YVDD原理图。
其中，R荧光报告基团 Q荧光淬灭基团图2为采用荧光探针技术检测乙肝拉米夫定耐药基因突变型扩增曲线其中，A图是判定为YMDD的荧光扩增曲线，即用PCR反应液A扩增，于FAM-490nm检测出高于设定域值的荧光信号，判定标本中的HBV DNA为YMDD野生型。
B图是判定为YIDD的荧光扩增曲线，即用PCR反应液B扩增，于FAM-490nm检测出高于设定域值的荧光信号，判定标本中的HBV DNA为YIDD突变型。
C图是判定为YVDD的荧光扩增曲线，即用PCR反应液B扩增，于HEX-530nm检测出高于设定域值的荧光信号，判定标本中的HBV DNA为YVDD野生型。
D图是判定为YIDD/YVDD共生的荧光扩增曲线，即用PCR反应液B扩增，于490nm和530nm均检测出高于设定域值的荧光信号，判定标本中的HBV DNA为YIDD和YVDD共生突变型。二者扩增曲线与基线交汇处的Ct值分别为23和25，ΔCt为2，推算YIDD和YVDD病毒变异毒株的相对比例约为22∶1，即4∶1。
具体实施例方式
实施例1 制备试剂盒试剂盒主要成份有PCR反应混合液A(其中还含引物1、2和荧光探针M)，PCR反应混合液B(其中还含引物1、2和荧光探针I和V)，Taq酶，HBV DNA抽提试剂，阴性质控品和ddH2O。
所述的引物和荧光探针设计在乙型肝炎病毒P基因区编码第552位氨基酸附近，只对乙型肝炎病毒特异，和其它物种没有交叉反应。在EMBL的HBV编码聚合酶的DNA序列的YMDD区域附近设计引物，全长92bps，为单拷贝基因序列。荧光探针设计位点位于两个引物之间。
引物序列为引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′19bps引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′21bps针对YMDD、YIDD、YVDD的荧光探针序列分别为探针M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′19bps
探针I5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′17bps探针V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′17bps所述PCR反应混合液A每人份组份为10×PCR缓冲液 5μlMgcl2(25mM) 10μldNTPs(各10mM) 各1μl引物1、2(20pmol/μl)各1μl荧光探针M(20pmol/μl) 0.2μlTaq酶(5单位/μl)0.5μlddH2O 28.3μl总量 50μl所述PCR反应混合液B每人份组份为10×PCR缓冲液 5μlMgcl2(25mM) 10μldNTPs(各10mM) 各1μl引物1、2(20pmol/μl)各1μl荧光探针I、V(20pmol/μl)各0.2μlTaq酶(5单位/μl)0.5μlddH2O 28.1μl总量 50μl所述HBV DNA抽提试剂组份为I液8％ 聚乙二醇 8000、1M NaCl；II液10％Chelex-100所述阴性质控品为阴性献血员血清，经乙肝两对半免疫测定和HBV核酸保守区PCR检测，各项指标均为阴性。
实施例2 使用乙型肝炎病毒基因耐药突变检测试剂盒进行突变检测取待测血清样本50μl，加入50μl HBV DNA抽提I液，振荡混匀15秒，12000rpm离心10min，弃上清。加入HBV DNA抽提II液50μl振荡混匀，100℃水浴10min。12000rpm离心2min，取上清供PCR扩增用，或-20℃储存备用。
阴性质控品同上处理。
PCR扩增2μl经上述方法抽提的含HBV DNA的上清加入PCR反应混合液A和B中，混匀后放入实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，iCycler)，按下列循环进行扩增反应94℃预变性5分钟→(94℃变性20秒→60℃退火40秒)×40循环，每次循环后在60℃采集荧光。
分析扩增曲线，做如下结果判定1.PCR反应混合液A管在FAM-490nm波长处有高于域值的荧光信号，表明标本中HBV DNA 552位为YMDD野生型(图2A)；2.PCR反应混合液B管在FAM-490nm波长处有高于域值的荧光信号，表明标本中HBV DNA 552位为YIDD突变型(图2B)；3.PCR反应混合液B管在HEX-530nm波长处有高于域值的荧光信号，表明标本中HBV DNA 552位为YVDD突变型(图2C)；4.若出现以上三种中任两种或两种以上高于域值的荧光信号，表明标本中乙型肝炎病毒为共生突变(图2D)；5.对于共生突变的毒株相对比例可按下列方法进行估算从扩增曲线上分别读取共生毒株的Ct值，以2ΔCt进行估算两者的拷贝数差异(图2D)。
实施例3同实施例1配置PCR反应液，将PCR管放入可读取荧光的荧光检测仪上读取数值，记下荧光值A0，将PCR管转入普通PCR仪上，按下列循环进行扩增反应94℃预变性5分钟→(94℃变性20秒→60℃退火40秒→72℃延伸30秒)×40循环→72℃延伸2分钟，再将PCR产物移至荧光检测仪上读取荧光值Ax。
分析终点荧光值，可做如下结果判定1.PCR反应混合液A管(Ax-A0)数值高于阴性对照10倍标准差以上认为该标本中HBV DNA 552位为野生型YMDD；2.PCR反应混合液B管在FAM-490nm波长处有荧光信号，并且(Ax-A0)数值高于阴性对照10倍标准差以上，表明标本中HBV DNA 552位为突变型YIDD；3.PCR反应混合液B管在HEX-530nm波长处有荧光信号，并且(Ax-A0)数值高于阴性对照10倍标准差以上表明标本中HBV DNA 552位为突变型YVDD；4.若出现以上三种中任两种或两种以上情况，表明标本中乙型肝炎病毒相应突变毒株共生。
权利要求
1.一种快速检测乙型肝炎病毒耐药基因变异的方法，其特征是利用实时荧光定量PCR MGB Taqman探针技术，依据乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变区YMDD核酸序列，设计引物及探针检测HBV YMDD区域的基因变异，包括下述步骤，a、根据乙型肝炎病毒拉米夫定耐药性相关突变位点的靶基因序列设计、合成引物和荧光探针，所述的靶基因片段长度为50-200个碱基；b、上述引物和荧光探针与聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，其中镁离子浓度为5mM，Taq酶的用量为0.25单位/反应；c、采用Chelex100抽提乙型肝炎病毒DNA，加入上述反应体系循环扩增；d、读取荧光值，判定基因变异情况，估算混合突变病毒毒株比例。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药性相关突变位点的靶基因序列位于两个引物之间，引物相距50-200碱基。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药性相关突变位点的靶基因长度为92碱基。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的荧光探针为MGB-Taqman探针，其5′端以FAM或HEX标记，3′端以MGB-quencher标记。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物长度各为15-25碱基。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的荧光探针长度为15-30碱基。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的聚合酶链式反应循环为30-50个。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c中所述的聚合酶链式反应循环为40个。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药性相关突变位点的特异性基因序列为1 GTAGGGCTTT CCCCCACTGT TTGGCTTTCA GCTATATGGA TGATGTGGTA51 TTGGGGGCCA AGTCTGTACA ACATCTTGAG TCCCTTTTTA CC。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物序列为引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′。
11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的荧光探针的序列为探针M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′探针I5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′探针V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′。
12.一种检测权利要求1的乙型肝炎病毒耐药相关基因变异的诊断试剂盒，其特征是由PCR反应混合液A，PCR反应混合液B，Taq酶，HBV DNA抽提试剂，阴性质控品和ddH2O组成，其中所述的反应混合液A中还含引物1、2和荧光探针M，反应混合液B中还含引物1、2和荧光探针I和V。
13.按权利要求12所述的诊断试剂盒，其中所述的引物序列为，引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′ 19bps引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′21bps。
14.按权利要求12所述的诊断试剂盒，其中所述的荧光探针序列为，探针M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′19bps探针I5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′ 17bps探针V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′ 17bps。
15.按权利要求12所述的诊断试剂盒，其中所述的PCR反应混合液A每人份组份为5μl 10×PCR缓冲液，10μl 25mM Mgcl2，各1μl 10mM dNTPs，各1μl20pmol/μl引物1和2，0.2μl 20pmol/μl荧光探针M，0.5μl 5单位/μl Taq酶，28.3μl ddH2O；其中所述的PCR反应混合液B每人份组份为5μl 10×PCR缓冲液，10μl 25mM Mgcl2，各1μl 10mM dNTPs，各1μl 20pmol/μl引物1和2，各0.2μl 20pmol/μl荧光探针I和V，0.5μl 5单位/μl Taq酶，28.1μlddH2O。
16.按权利要求12所述的诊断试剂盒，其中所述的HBV DNA抽提试剂组份为，I液8％聚乙二醇8000、lM NaCl；II液10％Chelex-100。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药相关基因变异的方法。本发明利用实时荧光定量PCR MGB Taqman探针技术，依据乙肝病毒拉米夫定耐药突变区YMDD核酸序列，设计引物及探针检测HBV YMDD区域的基因变异。采用PCR反应混合液A，B、Taq酶、HBV DNA抽提试剂、阴性质控品、ddH
文档编号C12Q1/68GK1737164SQ20051006544
公开日2006年2月22日 申请日期2005年4月6日 优先权日2004年8月27日
发明者袁正宏, 王 华, 耿海峰, 华兵, 邵醇 申请人:上海复旦悦达生物技术有限公司, 复旦大学