专利名称：梨树病毒一步rt－pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及梨树病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
目前检测和鉴定果树病毒的传统方法是指示植物法、血清学方法，经过几十年筛选，国际上已经确认了成套标准指示植物。该法对鉴定目前已知的果树病毒来说，虽然可靠性高，但所需时间较长，并且费土耗地，血清学方法较指示植物法检测果树病毒的灵敏性和检测速度大大提高，特异性增强，但该方法因果树病毒的抗血清制备困难而致使检测成本高，并且很多果树病毒因未能制备抗血清而无法使用该方法。80年代以来，分子生物学技术的飞速发展，为果树病毒的研究堤供了一种前所未有的新途径。比起指示植物法和血清学方法该技术检测病毒的灵敏性更高、特异性更强、速度更快，关于果树病毒分子检测试剂盒及其检测方法尚没有。
发明内容
本发明的目的是提供一种梨树病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。
本发明的内容是；检测梨树病毒的RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括上游引物梨环纹花叶病毒5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，苹果茎沟病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脉黄病毒 5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，苹果茎沟病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脉黄病毒5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTTGTTGGT---3′，上述上游引物、下游引物的浓度为0.0009mmol/L；1#液，研磨缓冲液含有6000mmol/L盐酸胍、200mmol/L醋酸钠、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液，含有10％十二烷基硫酸纳，30mL，3#液，含有6000mmol/L碘化钠溶液，10mL，4#液，含有乙醇，5mL，5#液，含有1000mg/mL硅粉悬液0.75mL，6#液，含有洗涤锾冲液10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化钠、50％乙醇，30mL，7#液，含有TE10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液，含有RT-PCR锾冲液病毒特异引物各0.0009mmol/L、四种碱基混合物各0.0.75mmol/L、10× Tag酶缓冲液、氯化镁2mmol/L，0.3mL，9#液，含有鼠白血病病毒反转录酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反转录酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL，10#液，含有无菌去离子水，1mL，11#液，含有病毒阳性对照(CK+)，0.1mL，12#液，含有病毒阴性对照(CK-)，0.1mL。
上述的三种病毒的杂交检测试剂盒，提供了30次的检测量。
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，反转录酶为鼠白血病病毒反转录酶。
梨树病毒一步RT-PCR检测方法及其步骤如下A.病毒RNA的提取，a.取样品200mg加入1mL 1#液匀浆，b.将0.5mL匀浆转入2mL离心管中，加入0.1mL 2#液；70℃温浴5分钟，间歇摇动几次，然后冰浴5分钟，c.13000g离心10分钟，取上清0.3mL转入一个新管中；加入0.3mL3#液、0.15mL4#液、0.025mL5#液，室温放置10分钟，间歇摇动几次，d.6000g离心1分钟，弃去悬液，沉淀重悬于0.5mL6#液，重复洗涤一次，e.重悬于0.15mL7#液，70℃温浴4分钟解脱核酸；13000离心5分钟，上清液转入一个新的离心管中于-20℃贮存，B.RT-PCR扩增反应，a.根据扩增样品数量，按每管加0.00875mL8#液、0.00125mL9#液，盖上管盖备用，b.分别取阳性对照、阴性对照及各标本RNA0.0025mL加入对应的反应管中，加样完毕的反应管混匀后，瞬离3秒，取出放入扩增仪里，c.反应程序设置37℃，1小时；94℃，5分钟；然后94℃变性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟，C结果观察a.取0.005-0.010mL扩增产物与加样缓冲液按5∶1的比例混合；b.将混合液上样与1.5％琼脂糖疑胶上；c.将琼脂糖凝胶经100伏电压电泳30分钟左右，并用DNA分子量标准进行对照；d.观察前沿指示剂迁移至加样孔至少5cm处，在凝胶成像分析仪上观察并记录试验结果，e.梨环纹花叶病毒在635bp处一条带，苹果茎沟病毒在256bp处有一条带，梨脉黄病毒在346bp处有一条带，上述的RT-PCR检测方法，检测所使用的上游引物是梨环纹花叶病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，苹果茎沟病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脉黄病毒5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物是梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，苹果茎沟病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脉黄病毒5′--CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT--3′，所用引物的浓度为0.0009mmol/L。
确定适宜的RT-PCR反应循环参数，在整个病毒样本的扩增过程中至关重要，它主要包括变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数。
RT-PCR扩增参数为37℃，1小时；94℃，5分钟；然后94℃变性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟。
本发明所称待测样品或为梨树组织，或为梨树组织RNA。
本发明还在于在电泳设备中电泳PCR扩增物，记录结果的具体步骤为a.取0.005-0.010mL扩增物与加样缓冲液按5∶1的比例混合，b.将混合液上样于琼脂糖疑胶上，c.将琼脂糖疑胶80-100伏电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA分子量标准进行对照，d.观察前沿指示剂移至距加样孔至少5cm处，在凝胶成象仪上观察并记录试验结果，e.观察并记录结果梨环纹花叶病毒在635bp处有一条带，苹果茎沟病毒在256bp处有一条带，梨脉黄病毒在346bp处有一条带。
根据引物设计的结果，扩增出的梨树梨环纹花叶病毒片段长度为635bp，梨树苹果茎沟病毒片段长度为256bp，梨树梨脉黄病毒片段长度为346bp，因此若扩增出635bp、256bp、346bp处和阳性对照相同位置的条带，则可判断此梨树模板RNA带有梨环纹花叶病毒、苹果茎沟病毒、梨脉黄病毒。
本发明较现有技术具有如下优点，本发明所配制的RT-PCR检测试剂盒制作方法简便，易于产业化生产，针对RT-PCR检测试剂盒所提供的检测方法检测梨树的梨环纹花叶病毒、苹果茎沟病毒、梨脉黄病毒的灵敏度高、重复性好、可操作性强、简单易行、检测成本相对较低。
附图1附为本发明梨环纹花叶病毒样品检测结果影像。
附图2为本发明苹果茎沟病毒样品检测结果影像。
附图3为本发明梨脉黄病毒样品检测结果影像。。
具体实施例方式实施例1RT-PCR检测试剂盒，检测梨树病毒的RT-PCR检测试剂盒，包括；上游引物梨环纹花叶病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，下游引物梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，上述上游引物、下游引物的浓度为0.0009mmol/L；1#液；研磨缓冲液含有6000mmol/L盐酸胍、200mmol/L醋酸钠、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液；含有10％十二烷基硫酸纳，30mL，3#液；含有6000mmol/L碘化钠溶液，10mL，4#液；含有乙醇，5mL，5#液；含有1000mg/mL硅粉悬液0.75mL，6#液；含有洗涤锾冲液10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化钠、50％乙醇，30mL，7#液；含有TE10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液；含有RT-PCR锾冲液病毒特异引物各0.0009mmol/L、四种碱基混合物各0.0.75mmol/L、10×Tag酶缓冲液、氯化镁2mmol/L，0.3mL，9#液；含有鼠白血病病毒反转录酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反转录酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL10#液；含有无菌去离子水，1mL，11#液；含有病毒阳性对照(CK+)，0.1mL，12#液；含有病毒阴性对照(CK-)，0.1mL。
本实施例中的耐热DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，反转录酶为鼠白血病病毒反转录酶。
检测仪器设备包括PCR仪、电泳设备、凝胶成像仪、冰箱、高速离心机、微量进样器等。
检测实施的操作A.病毒RNA的提取a.取样品200mg加入1mL 1#液匀浆。
b.将0.5mL匀浆转入2mL离心管中，加入0.1mL 2#液；70℃温浴5分钟，间歇摇动几次，然后冰浴5分钟；c.13000g离心10分钟，取上清0.3mL转入一个新管中；加入0.3mL3#液、0.15mL4#液、0.025mL5#液，室温放置10分钟，间歇摇动几次；d.6000g离心1分钟，弃去悬液，沉淀重悬于0.5mL6#液，重复洗涤一次；e.重悬于0.15mL7#液，70℃温浴4分钟解脱核酸；13000离心5分钟，上清液转入一个新的离心管中于-20℃贮存。
B.RT-PCR扩增反应a.根据扩增样品数量，按每管加0.00875mL8#液、0.00125mL9#液，盖上管盖备用。
b.分别取阳性对照、阴性对照及各标本RNA0.0025mL加入对应的反应管中，加样完毕的反应管混匀后，瞬离3秒，取出放入扩增仪里。
c.反应程序设置37℃，1小时；94℃，5分钟；然后94℃变性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟。
C.在电泳设备中电泳PCR扩增物，记录结果的具体步骤为a.取0.005-0.010mL扩增物与加样缓冲液混合。
b.将混合液上样于琼脂糖疑胶上。
c.将琼脂糖疑胶80-100伏电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA分子量标准进行对照。
e.观察并记录结果梨环纹花叶病毒在635bp左右有一条带。
实施例2与实施例1的区别在于上游引物是苹果茎沟病毒 5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′下游引物是梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′上述上游引物、下游引物的浓度为0.0009mmol/L；e.观察并记录结果苹果茎沟病毒在256bp处有一条带。
实施例3与实施例1的区别在于上游引物是梨脉黄病毒5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′上述上游引物、下游引物的浓度为0.0009mmol/L；梨脉黄病毒5′--CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT--3′引物的浓度为0.0009mmol/Lf.观察并记录结果梨脉黄病毒在346bp处有一条带。
权利要求
1.一种用于梨树病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括，上游引物梨环纹花叶病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，苹果茎沟病毒5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，梨脉黄病毒 5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，苹果茎沟病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脉黄病毒 5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT---3′，上述上游引物、下游引物的浓度为0.0009mmol/L；1#液；研磨缓冲液含有6000mmol/L盐酸胍、200mmol/L醋酸钠、25mmol/L乙二胺四乙酸，30mL，2#液；含有10％十二烷基硫酸纳，30mL，3#液；含有6000mmol/L碘化钠溶液，10mL，4#液；含有乙醇，5mL，5#液；含有1000mg/mL硅粉悬液0.75mL，6#液；含有洗涤锾冲液10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.05mmol/L乙二胺四乙酸、50mmol/L氯化钠、50％乙醇，30mL，7#液；含有TE10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1mmol/L乙二胺四乙酸，5mL，8#液；含有RT-PCR锾冲液病毒特异引物各0.0009mmol/L、四种碱基混合物各0.0.75mmol/L、10×Tag酶缓冲液、氯化镁2mmol/L，0.3mL，9#液；含有鼠白血病病毒反转录酶和Tap DNA聚合酶混合物其中鼠白血病病毒反转录酶16000U/mL、Tap DNA聚合酶1000U/mL，0.060mL，10#液；含有无菌去离子水，1mL，11#液；含有病毒阳性对照(CK+)，0.1mL，12#液；含有病毒阴性对照(CK-)，0.1mL。
2.梨树病毒一步RT-PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤A.病毒RNA的提取a.取样品200mg加入1mL 1#液匀浆。b.将0.5mL匀浆转入2mL离心管中，加入0.1mL 2#液；70℃温浴5分钟，间歇摇动几次，然后冰浴5分钟；c.13000g离心10分钟，取上清0.3mL转入一个新管中；加入0.3mL3#液、0.15mL4#液、0.025mL5#液，室温放置10分钟，间歇摇动几次；d.6000g离心1分钟，弃去悬液，沉淀重悬于0.5mL6#液，重复洗涤一次；e.重悬于0.15mL7#液，70℃温浴4分钟解脱核酸；13000离心5分钟，上清液转入一个新的离心管中于-20℃贮存。B.RT-PCR扩增反应a.根据扩增样品数量，按每管加0.00875mL8#液、0.00125mL9#液，盖上管盖备用。b.分别取阳性对照、阴性对照及各标本RNA0.0025mL加入对应的反应管中，加样完毕的反应管混匀后，瞬离3秒，取出放入扩增仪里。c.反应程序设置37℃，1小时；94℃，5分钟；然后94℃变性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟。C结果观察a.取0.005-0.01mL扩增产物与加样缓冲液按5∶1的比例混合；b.将混合液上样与1.5％琼脂糖疑胶上；c.将琼脂糖凝胶经100伏电压电泳30分钟左右，并用DNA分子量标准进行对照；d.观察前沿指示剂迁移至加样孔至少5cm处，在凝胶成像分析仪上观察并记录试验结果。使用的上游引物是梨环纹花叶病毒 5′---TGGAACAGACACTGGATGCC---3′，苹果茎沟病毒5′---TAGGCAGAACTCTTTGAACGAATGT---3′，苹果茎沟病毒5′---TGGAACCTCATGCTGCAAACTC---3′，下游引物是梨环纹花叶病毒 5′---ACACTCCAATTAAATACCATGACTCT---3′，苹果茎沟病毒5′---TTGTCCTTCAGTACGAAAAAGCCTT---3′，梨脉黄病毒 5′---CTTTACTAAAAAGCATAAATACTTGTTGGT---3′，引物浓度为0.0009mmol/L。
3.如权利要求2所述的梨树病毒一步RT-PCR检测方法，其特征在于RT-PCR扩增参数为37℃，1小时；94℃，5分钟；然后94℃变性40秒；60℃退火40秒；72℃延伸60秒，共32个循环，最后72℃延伸10分钟。
4.如权利要求2或3所述的梨树病毒一步RT-PCR检测方法，其特征在于待测样品或为梨树组织，或为梨树组织RNA。
5.如权利要求2所述的梨树病毒一步RT-PCR检测方法，其特征在于在电泳设备中电泳PCR扩增物，记录结果的具体步骤为a.取0.005-0.010ml扩增物与加样缓冲液按5∶1的比例混合，b.将混合液上样于琼脂糖疑胶上，c.将琼脂糖疑胶80-100伏电压电泳30分钟左右，并用1000bp或3000bp的DNA分子量标准进行对照，d.观察前沿指示剂移至距加样孔至少5cm处，在凝胶成象仪上观察并记录试验结果，e.观察并记录结果。
6.如权利要求2或3或、或5所述的梨树病毒一步RT-PCR检测方法，其特征在于梨树的梨环纹花叶病毒在635bp处有一条带，苹果茎沟病毒在256bp处有一条带，梨脉黄病毒在346bp处有一条带。
全文摘要
梨树病毒一步RT－PCR检测试剂盒及其检测方法，本发明涉及梨树上潜隐的梨环纹花叶、苹果茎沟、梨脉黄三种病毒的一步RT－PCR检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒，包括、引物、十二烷基磺酸钠、研磨缓冲液、反转录酶、聚合酶、上游引物、下游引物，RT－PCR检测试剂盒制作方法简便，易于产业化生产，针对RT－PCR检测试剂盒所提供的检测方法检测梨树的梨环纹花叶病毒、苹果茎沟病毒、梨脉黄病毒的灵敏度高、重复性好、可操作性强、简单易行、检测成本相对较低。
文档编号C12Q1/68GK1696314SQ200510065419
公开日2005年11月16日 申请日期2005年4月1日 优先权日2005年4月1日
发明者牛建新, 马兵钢 申请人:石河子大学