专利名称：梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
检测和鉴定果树病毒的传统方法是指示植物法、血清学方法。经过几十年筛选，国际上已经确认了成套标准指示植物。该法对鉴定目前已知的果树病毒来说，虽然可靠性高，但所需时间较长，并且费工耗地。血清学方法较指示植物法检测果树病毒的灵敏性和检测速度大大提高，特异性增强，目前已经成为常规的果树病毒检测和鉴定方法，有关这方面的研究国内外有很多报道。但该检测方法因为果树病毒的抗血清制备困难而致使检测成本高。并且很多果树病毒因未能制备抗血清而无法使用该方法。
80年代以来，分子生物学技术的飞速发展，为果树病毒的研究提供了一种前所未有的新途径。比起指示植物法和血清学方法，分子生物学技术检测果树病毒有其独特的优势，该技术检测病毒的灵敏性比上述方法高出几个数量级，可以检测到用上述方法检测不到的病毒，而且特异性更强、速度更快。欧美一些国家率先采用分子生物学技术检测果树病毒。我国对果树病毒病的研究起步较晚。植物病毒检测试剂盒的研制很少，仅有烟草花叶病毒检测试剂盒等几种。国际马铃薯研究中心研制了马铃薯病毒检测试剂盒，并已实际应用。此试剂盒采用了血清学检测法，可检测PVY，PVX，PVS，PLRV等四种病毒。该试剂盒的出现对我国马铃薯病毒的发生情况研究起到了巨大的推动作用。随着分子生物学技术的成熟，很多方法已应用于果树病毒检测中，关于果树病毒分子检测试剂盒的研究却没有。
发明内容
本发明目的在于提供一种梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法。
本发明的内容为；梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法，其特征在于包括梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列<210>1所示。
苹果茎沟病毒探针序列如序列表中的序列<210>2所示。
梨脉黄病毒探针序列如序列表中的序列<210>3所示。
上述探针的量为0.005-0.03mg/mL DNA；
1#液，预杂交液，含有50％去离子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸钠，5×SSC，20mmol/L磷酸钠，0.5mg/mL鲑精DNA，20mL，2#液，杂交液，含有50％去离子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸钠，5×SSC，20mmol/L磷酸钠，0.5mg/mL鲑精DNA，20mL并含有0.005-0.030mg/mL DNA探针的预杂交液20mL，3#液；清洗液I#，含有0.1％十二烷基硫酸钠的2×SSC，40mL，4#液；清洗液II#，含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.1×SSC，40mL，5#液；缓冲液I#，含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，150mmol/L氯化钠，100mL，6#液；缓冲液II#，含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，150mmol/L氯化钠，3％(w/v)牛血清白蛋白40mL，7#液；抗体液，含有抗地高辛抗体结合蛋白750U/mL，0.005mL，8#液；缓冲液III#，含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，100mmol/L氯化钠，50mmol/L氯化镁，40mL，9#液；含有氯化氮蓝四唑32.5mg/mL、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸17.5mg/mL，0.2mL，10#液；显色液病毒阳性对照(CK+)，0.010mL，11#液；病毒阴性对照(CK-)，0.010mL，杂交膜(4cm×10cm)1张，杂交管(5mL)10支。
上述的三种病毒的杂交检测试剂盒，提供了10次的检测量。
梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法及步骤如下A.点样预先将膜剪成1cm×4cm小条，用铅笔在膜上作好标记，以便区分，最多可每0.5cm点一个样(共7个样)。将提取的样品RNA及阳性对照、阴性对照分别取0.001mL点到膜上，B.固定用80℃，60分钟或120℃，30分钟固定样品，C.预杂交将固定好的膜放入一个5mL杂交管中，加入2mL1#液，42℃预杂交20分钟，D.探针处理2#液于沸水浴中变性10分钟，迅速移至冰上5分钟，E.杂交杂交管中加入2mL2#液，42℃轻摇1.5小时，F.洗膜用2mL3#室温洗膜2次，每次5分钟；再用2mL4#液42℃下洗膜2次，每次5分钟，G.封闭用2mL5#液洗膜1分钟，弃去，加适量2mL6#液轻摇封闭20分钟。
H.结合抗体弃6#液，重新加入2mL 6#液(其中加入0.0004mL 7#液)，轻摇30分钟，I.显色将膜移入新管中，用3mL5#液洗涤两次，每次10分钟，再用2mL8#液浸泡2分钟倒出；重新加入2mL8#液(其中加入0.02mL9#液)后，将容器放入一个封闭的盒内，黑暗中静置显色1小时，J.终止反应待显色适当时，倒出显色液，加入2mL5#液浸泡5分钟终止反应，(3)结果观察与记录病毒在点样部位显现蓝紫色斑点。
上述方法所用的探针序列如下梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列(<210>1)所示。
梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列(<210>2)所示。
苹果茎沟病毒探针序列如序列表中的序列(<210>3)所示。
上述探针的量为；0.005-0.03mg/mL DNA。
梨树病毒的杂交检测方法，待测样品或为梨树组织，或为梨树组织RNA。
梨树病毒应在点样位置显现蓝紫色斑点。
上述方法所用的试剂，其中去离子甲酰胺、磷酸钠、鲑精DNA、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、氯化镁2、氯化氮蓝四唑、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸由华美生物工程公司提供。抗地高辛抗体结合蛋白、地高辛-11-脱氧尿苷三磷酸为ROCH公司产品。梨环纹花叶、苹果茎沟、梨脉黄三种病毒的DNA探针根据石河子大学提供的引物序列并在石河子大学标记了地高辛-11-脱氧尿苷三磷酸。梨环纹花叶、苹果茎沟、梨脉黄三种病毒的阳性对照(CK+)和阴性对照(CK-)由石河子大学提供。
上述方法所用的仪器设备包括杂交炉、恒温箱、冰箱、微量进样器等。
本发明利用cDNA杂交检测试剂盒检测梨树上3种潜隐病毒梨环纹花叶、苹果茎沟、梨脉黄。相对于指示植物法和血清学检测法，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、快捷、易于操作等优点。可高效地应用于梨病毒种类及分布情况的调查研究及无病毒规范化生产。
附图1为本发明梨脉黄病毒样品检测结果影像。
附图2为本发明梨环纹花叶病毒样品检测结果影像。
附图3为本发明苹果茎沟病毒样品检测结果影像。
图示中1-10内检测样品，CK-为阴性对照。
具体实施例方式
实施例1梨树上的梨环纹花叶病毒的杂交检测试剂盒及其检测方法，具体包括如下；梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列(<210>1)所示。
上述探针的量为；0.005-0.03mg/mL DNA。
1#液；预杂交液，含有50％去离子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸钠，5×SSC，20mmol/L磷酸钠，0.5mg/mL鲑精DNA，20mL。
2#液；杂交液，含有，50％去离子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸钠，5×SSC，20mmol/L磷酸钠，0.5mg/mL鲑精DNA，20mL并含有0.005-0.030mg/mL DNA探针的预杂交液20mL，3#液；清洗液I#，含有0.1％十二烷基硫酸钠的2×SSC，40mL，4#液；清洗液II#，含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.1×SSC，40mL5#液；缓冲液I#，含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，150mmol/L氯化钠，100mL，6#液；缓冲液II#，含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，150mmol/L氯化钠，3％(w/v)牛血清白蛋白，40mL，7#液；抗体液，含有抗地高辛抗体结合蛋白750U/mL，0.005mL，8#液；含有缓冲液III#，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，100mmol/L氯化钠，50mmol/L氯化镁，40mL，9#液；含有氯化氮蓝四唑32.5mg/mL、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸17.5mg/mL，0.2mL，10#液；显色液病毒阳性对照(CK+)，0.010mL，11#液；病毒阴性对照(CK-)，0.010mL，杂交膜(4cm×10cm)1张，杂交管(5mL)10支。
梨树的梨环纹花叶病毒病毒的杂交检测方法及步骤如下A.点样预先将膜剪成1cm×4cm小条，用铅笔在膜上作好标记，以便区分，最多可每0.5cm点一个样(共7个样)。将提取的样品RNA及阳性对照、阴性对照分别取0.001mL点到膜上，B.固定用80℃，60分钟或120℃，30分钟固定样品。
C.预杂交将固定好的膜放入一个5mL杂交管中，加入2mL1#液，420℃预杂交20分钟，D.探针处理2#液于沸水浴中变性10分钟，迅速移至冰上5分钟，E.杂交杂交管中加入2mL2#液，42℃轻摇1.5小时，F.洗膜用2mL3#室温洗膜2次，每次5分钟；再用2mL4#液42℃下洗膜2次，每次5分钟，G.封闭用2mL5#液洗膜1分钟，弃去，加适量2mL6#液轻摇封闭20分钟，H.结合抗体弃6#液，重新加入2mL 6#液(其中加入0.0004mL 7#液)，轻摇30分钟，I.显色将膜移入新管中，用3mL5#液洗涤两次，每次10分钟，再用2mL8#液浸泡2分钟倒出；重新加入2mL8#液(其中加入0.020mL9#液)后，将容器放入一个封闭的盒内，黑暗中静置显色1小，J.终止反应待显色适当时，倒出显色液，加入2mL5#液浸泡5分钟终止反应。
(3)结果观察与记录病毒在点样部位显现篮紫色斑点。
梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列(<210>1)所示。
结果观察与记录病毒在点样部位显现蓝紫色斑点。
实施例2本实施例与实施例1的区别在于用于梨树苹果茎沟病毒探针序列如序列表中的序列(<210>2)所示。
上述探针的量为；0.005-0.03mg/mL DNA。
结果观察与记录病毒在点样部位显现篮紫色斑点。
实施例3本实施例与实施例1的区别在于用于梨脉黄病毒探针序列如序列表中的序列(<210>3)所示。
上述探针的量为；0.005-0.03mg/mL DNA。
结果观察与记录病毒在点样部位显现蓝紫色斑点。
序列表<110>石河子大学<120>梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法<160>9<210>1<211>629<212>DNA<213>梨环纹花叶病毒(pear ring pattern mosaic virus)<400>1tggaacagac actggatgcc atcttcgcga acatagcgat acaagggacg tcggagcaga 60cggaattcct ggatctagtg gtggaggtga aatcaatgga ggaccagaag gtaatcgggt 120cctacaattt gaaggaggtg gtcaacatga tcaaagcttt caaaactacc tcttcggatc 180cgaacatcag caacatgact ttccgccagg tgtgtgaggc tttcgcaccg gaggcaagaa 240acgggttggt caagctgaag tataaagggg ttttcactaa cctctttacg accatgccgg 300aagtaggtag caaatacccg gagctgatgt ttgatttcaa taagggtctt aacatgttta 360tcatgaataa ggcccagcaa aaagtcataa ctaatatgaa ccggcgtctt ttacaaactg 420aatttgcaaa aagtgagaat gaggcaaagc tctcatctgt tacgactgat ctttgcattt 480agtttgttta agaagtttgg tttaataaat aaaataaata gatagtgtgt tgtgtgttta 540atatttgcgt gaatatatgt ttgcatttaa tggacgaact cttgaaccca tgaaagagta 600taaagagtca tggtatttaa ttggagtgt 629<210>2<211>256<212>DNA<213>苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus)<400>2taggcagaac tctttgaacg aatgtacgtt cagaaagctt tgtgagcctt ttgctgactt 60ggctcgcgaa tttcttcatg agaggtggtc cagaggattg gccaccaaca tttataagaa 120atggcccaaa gcttttgaaa aaagcccatg ggtggcgttt gactttgcca ccggtctgaa 180aatgaatcgt ttaacacctg atgaaaaaca ggtgattgat agaatgacaa aaaggctttt 240tcgtactgaa ggacaa 256<210>3<211>346
<212>DNA<213>梨脉黄病毒(pear vein yellows virus)<400>3tggaacctca tgctgcaaac tcagagtcct cccgccaact gggttggaaa ggaattcaaa 60ttcgaaacca ggtatgccgc ctttgacttc ttctttggag ttgagagctc tgcatcgctg 120gaaccagctg atggcctcat tcgattgcca acccaggctg aacgagttgc caacgcaacg 180agcaaagaaa tccaaatgta ccggattcga tccatggagg gaactcaggc cgttaatttt 240ggtgaggtta cggggggcaa agtgggccct aagccagtgc tgtccattag gaagtaattg 300atcttaaatc ccataaacca acaagtattt atgcttttta gtaaag346<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4acactccaat taaataccat gactct26<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5tggaacagac actggatgcc20<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ttgtccttca gtacgaaaaa gcctt 25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7taggcagaac tctttgaacg aatgt 25<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctttactaaa aagcataaat acttgttggt 30<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9tggaacctca tgctgcaaac tc 2权利要求
1.一种梨树病毒杂交检测试剂盒，其特征在于包括梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列(<210>1)所示。苹果茎沟病毒探针序列如序列表中的序列(<210>2)所示。梨脉黄病毒探针序列如序列表中的序列(<210>3)所示。上述探针的用量为；0.005-0.03mg/mL DNA，1#液，预杂交液；含有50％去离子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸钠，5×SSC，20mmol/L磷酸钠，0.5mg/mL鲑精DNA，20mL，2#液，杂交液；含有，50％去离子甲酰胺，5×Denhardt′s，0.1％十二烷基硫酸钠，5×SSC，20mmol/L磷酸钠，0.5mg/mL鲑精DNA，20mL并含有0.005-0.030mg/mL DNA探针的预杂交液20mL，3#液，清洗液I#；；含有0.1％十二烷基硫酸钠的2× SSC，40mL，4#液，清洗液II；含有0.1％十二烷基硫酸钠的0.1×SSC，40mL，5#液，缓冲液I#；含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，150mmol/L氯化钠，100mL，6#液，缓冲液II#；含有100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，150mmol/L氯化钠，3％(w/v)牛血清白蛋白，40mL，7#液，抗体液；含有抗地高辛抗体结合蛋白750U/mL，0.005mL，8#液，含有缓冲液III#；100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100mmol/L氯化钠，50mmol/L氯化镁，40mL，9#液，含有氯化氮蓝四唑32.5mg/mL、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸17 5mg/mL，02mL，10#液，显色液病毒阳性对照(CK+)，0.010mL，11#液，病毒阴性对照(CK-)，0.010mL，杂交膜(4cm×10cm)1张，杂交管(5mL)10支。
2.梨树病毒杂交检测方法，其特征在于杂交检测方法及步骤如下A.点样预先将膜剪成1cm×4cm小条，用铅笔在膜上作好标记，以便区分，最多可每0.5cm点一个样(共7个样)。将提取的样品RNA及阳性对照、阴性对照分别取0.001mL点到膜上，B.固定用80℃，60分钟或120℃，30分钟固定样品，C.预杂交将固定好的膜放入一个5mL杂交管中，加入2mL1#液，42℃预杂交20分钟，D.探针处理2#液于沸水浴中变性10分钟，迅速移至冰上5分钟，E.杂交杂交管中加入2mL2#液，42℃轻摇1.5小时，F.洗膜用2mL3#室温洗膜2次，每次5分钟；再用2mLA#液42℃下洗膜2次，每次5分钟，G.封闭用2mL5#液洗膜1分钟，弃去，加适量2mL6#液轻摇封闭20分钟，H.结合抗体弃6#液，重新加入2mL6#液(其中加入0.0004mL7#液)，轻摇30分钟，I.显色将膜移入新管中，用3mL5#液洗涤两次，每次10分钟，再用2mL8#液浸泡2分钟倒出；重新加入2mL8#液(其中加入0.020mL9#液)后，将容器放入一个封闭的盒内，黑暗中静置显色1小时，J.终止反应待显色适当时，倒出显色液，加入2mL5#液浸泡5分钟终止反应。(3)结果观察与记录病毒在点样部位显现蓝紫色班点。所用的探针序列如下梨环纹花叶病毒探针序列如序列表中的序列(<210>1)所示。苹果茎沟病毒探针序列如序列表中的序列(<210>2)所示。梨脉黄病毒探针序列如序列表中的序列(<210>3)所示。上述探针的量为；0.005-0.03mg/mL DNA。
3.如权利要求2所说的梨树病毒杂交检测方法，其特征在于待测样品或为梨树组织总核酸，或为梨树组织RNA。
4.如权利要求2或3所说的梨树病毒杂交检测方法，其特征在于梨树病毒在点样部位显现蓝紫色斑点。
全文摘要
本发明涉及一种梨树病毒杂交检测试剂盒及其检测方法。用于检测梨树上梨环纹花叶、苹果茎沟、梨脉黄的三种病毒，该试剂盒包括预杂交液、杂交液、洗涤溶液Ⅰ、洗涤溶液Ⅱ、缓冲溶液Ⅰ、缓冲溶液Ⅱ、抗体液、缓冲溶液Ⅲ、引物序列、探针序列。该试剂盒配制方法简便，易于产业化生产，针对该试剂盒所提供的杂交检测方法，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、快捷、成本较低、易于操作等优点。可高效地应用于梨病毒种类及分布情况的调查研究及无病毒规范化。
文档编号C12Q1/00GK1841067SQ20051006530
公开日2006年10月4日 申请日期2005年4月1日 优先权日2005年4月1日
发明者牛建新, 马兵钢 申请人:石河子大学