专利名称：一种检测马铃薯病毒的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用PCR法检测病毒的试剂盒及检测病毒的方法。
背景技术：
马铃薯是全世界最重要的高产作物，它既是粮食作物又是经济作物，可用于人类消费、动物饲料及作为加工淀粉和生产乙醇的原料。但长期以来众多的马铃薯品种因病毒侵染急剧减产、品种退化，对作物的生产非常不利。迄今为止发现的马铃薯病毒已有20多种。因此，以可脱去病毒的组织培养法建立马铃薯脱毒种薯繁育体系是阻止病毒侵染、提高产量、发挥优良品种特性的有效途径，其中实现组培苗的全面脱毒是这一体系的中心环节，高效可靠的病毒检测手段则是确保种苗脱毒的前提和关键(仲乃琴ELISA技术检测马铃薯病毒的研究甘肃农业大学学报1998年第2期178～181)。除马铃薯外，茄科的其他作物如番茄、青椒等也会被马铃薯病毒所侵染。
目前应用于马铃薯病毒检测的诊断方法包括指示植物法、电镜观察法、酶联免疫吸附(ELISA)法、聚合酶链式反应(PCR)法和核酸杂交(NASH)法等(袁青等 马铃薯病毒分子检测技术研究进展 中国马铃薯 2003年第17卷第1期33～36)。
发明目的本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测马铃薯病毒的试剂盒；本发明的另一个目的是提供一种利用试剂盒检测马铃薯病毒的方法，该方法是随着PCR法衍生出的RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)法，是一种检测RNA病毒的行之有效的方法。
本发明的技术方案概述如下一种检测马铃薯病毒的试剂盒，该试剂盒由反应液、引物、酶液及阳性标准品组成，所述反应液中的组分及体积百分比为5×鼠源逆转录酶反应缓冲液6％～50％、10×PCR反应缓冲液3％～25％、25mmol/L Mg2+2.5％～15％、各25mmol/L dNTPs 0.7％～10％、灭菌水87.8％～0，所述引物为马铃薯X病毒引物、马铃薯Y病毒引物、马铃薯S病毒引物及马铃薯卷叶病毒引物中至少一种，所述马铃薯X病毒引物由序列表中SEQ ID NO.1表示的马铃薯X病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.2表示的马铃薯X病毒下游引物组成，所述马铃薯Y病毒引物由序列表中SEQ ID NO.3表示的马铃薯Y病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.4表示的马铃薯Y病毒下游引物组成，所述马铃薯S病毒引物由序列表中SEQ ID NO.5表示的马铃薯S病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.6表示的马铃薯S病毒下游引物组成，所述马铃薯卷叶病毒引物由序列表中SEQ ID NO.7表示的马铃薯卷叶病毒上游引物和由序列表中SEQ IDNO.8表示的马铃薯卷叶病毒下游引物组成，各上、下游引物的浓度为0.5～2μmol/L，所述酶液的组分及体积百分比为鼠源逆转录酶20％～50％、Taq DNA聚合酶20％～50％、灭菌水60％～0，所述阳性标准品为马铃薯X病毒克隆质粒、马铃薯Y病毒克隆质粒、马铃薯S病毒克隆质粒及马铃薯卷叶病毒克隆质粒中至少一种，并与马铃薯病毒引物相对应，每种病毒克隆质粒浓度均为107～1015copies/μl。
一种用检测马铃薯病毒的试剂盒检测马铃薯病毒的方法，该方法包括以下步骤(1)从新鲜的茄科植物组织中提取总RNA；(2)对提取的总RNA进行一步法逆转录-PCR反应取PCR管，加入反应液、待测病毒引物、酶液和总RNA，加水0～30μl，在41～4 3℃保温20～40分钟进行逆转录，然后进行PCR反应；(3)PCR产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据与阳性标准品相同的位置显现特异性条带的有无，判定标本中是否存在马铃薯病毒。
PCR反应条件是93～95℃3～7分钟——；93～95℃30～60秒——57～62℃30～60秒——70～72℃30～120秒，共25～40个循环；最后70～72℃延伸8～15分钟。
本发明的优点是本发明是通过一步法RT-PCR对马铃薯RNA病毒进行检测，通过凝胶电泳判断是否感染了病毒，省去了现有方法中，先逆转录再PCR的繁琐步骤，节省时间并降低了试剂成本。与其它几种马铃薯病毒检测方法相比具有特异性强，灵敏度高，结果准确，不需要大型设备仪器，操作简单，检测速度快，无放射性污染，价格低廉等优点。
图1显示了SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；图2显示了SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；图3显示了SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列；图4显示了SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列；图5显示了SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列；图6显示了SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列；图7显示了SEQ ID NO.7所述的核苷酸序列；图8显示了SEQ ID NO.8所述的核苷酸序列；
图9为四种马铃薯病毒PCR扩增产物电泳图；图10为实施例18PCR扩增产物电泳图；图11为实施例20PCR扩增产物电泳图。
具体实施例方式
利用试剂盒中的反应液、引物、酶液和阳性标准品可以对病毒进行检测。具体适用浓度如表1
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
在下面的实施例中，M-MLV RT Buffer为鼠源逆转录酶反应缓冲液，PCR Buffer为PCR反应缓冲液，Mg2+为MgCl2或MgSO4之一，dNTPs为dATP、dTTP、dGTP、dCTP，M-MLV RT为鼠源逆转录酶，Taq酶为Taq DNA聚合酶，马铃薯X病毒克隆质粒、马铃薯Y病毒克隆质粒、马铃薯S病毒克隆质粒和马铃薯卷叶病毒克隆质粒为病毒阳性标准品。
实施例1反应液的组成和体积百分含量(见表2)
表2
实施例2酶液的组成和体积百分含量(见表3)表3
实施例3～6为检测一种病毒的试剂盒(每个试剂盒供10次反应)(见表4)表4
表4中反应液的组成及体积百分含量可以选表2中任意一种，酶液的组成及体积百分含量可以选表3中任意一种，病毒引物为上、下游引物，选表1中范围内的值，上、下游引物浓度相同，例如，可以各选0.5μmol/L，也可以各选2μmol/L，还可以各选1μmol/L，病毒克隆质粒选表1中范围内的值可以选107copies/μl，也可以选1015copies/μl，还可以选1010copies/μl。
实施例7～12为检测两种病毒的试剂盒(每个试剂盒供10次反应)(见表5)表5
表5中反应液的组成及体积百分含量可以选表2中任意一种，酶液的组成及体积百分含量可以选表3中任意一种，病毒引物为上、下游引物，选表1中范围内的值，上、下游引物浓度相同，例如，可以各选0.5μmol/L，也可以各选2μmol/L，还可以各选1μmol/L，病毒克隆质粒选表1中范围内的值可以选107copies/μl，也可以选1015copies/μl，还可以选1010copies/μl。
实施例13～16为检测三种病毒的试剂盒(每个试剂盒供10次反应)(见表6)表6
表6中反应液的组成及体积百分含量可以选表2中任意一种，酶液的组成及体积百分含量可以选表3中任意一种，病毒引物为上、下游引物，选表1中范围内的值，上、下游引物浓度相同，例如，可以各选0.52μmol/L，也可以各选2μmol/L，还可以各选1μmol/L，病毒克隆质粒选表1中范围内的值可以选107copies/μl，也可以选1015copies/μl，还可以选1010copies/μl。
实施例17为检测四种病毒的试剂盒(每个试剂盒供10次反应)(见表7)表7
实施例18一种检测马铃薯病毒的方法，该方法包括以下步骤以马铃薯新品种“夏波地”二代田间采样为材料，使用新鲜叶片提取总RNA，用本发明一种检测马铃薯病毒的试剂盒实施例5进行马铃薯S病毒(PVS)的检测。
取三个薄壁PCR管，分别为表8中所示----样品检测管、阳性对照管和阴性对照管表8
混匀后稍加离心，并在液面上层覆盖灭菌石蜡油。
42℃保温30分钟进行逆转录；然后进行PCR反应94℃预变性5分钟；接下来94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在与阳性标准品相同的位置显现特异性条带的为阳性，而阴性对照未显带，证明该样品感染了马铃薯S病毒。(见图10)图10为实施例18PCR扩增产物，图中由左至右依次为Mraker、样品检测管PCR产物、阳性对照管PCR产物、阴性对照管PCR产物。
实施例19步骤同实施例18，不同点是以马铃薯的另一品种的田间采样为材料，用本发明的一种检测马铃薯病毒的试剂盒，进行马铃薯X、Y和卷叶病毒(PVX、PVY、PLRV)的检测。经电泳检测后在相应位置显带，则说明感染了该病毒。
实施例20
步骤同实施例18，不同点是以马铃薯的另一品种“克星”的田间采样为材料同时进行马铃薯Y和S病毒(PVY-PVS)的检测，PCR反应为35个循环。
取三个薄壁PCR管，分别为表9中所示----样品检测管、阳性对照管和阴性对照管表9
经检测该样品感染了PVY和PVS。(见图11)图11为实施例20PCR扩增产物，图中由左至右依次为PVY阳性对照管PCR产物、PVS阳性对照管PCR产物、样品检测管PCR产物。
实施例21步骤同实施例18，不同点是以马铃薯的另一品种为材料同时进行两种马铃薯病毒X-S和X-卷叶病毒(PVX-PVS、PVX-PLRV)的检测，PCR反应为35个循环。经电泳检测后在相应位置显带，则说明感染了相应病毒。
马铃薯X、Y、S、卷叶病毒(PVX、PVY、PVS、PLRV)PCR引物X病毒(PVX)上游引物5’-ACAGGCCACAGGGTCAACTAC-3’下游引物5’-CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT-3’扩增片段长度为620bpY病毒(PVY)上游引物5’-ACTCGGGCAACTCAATCACAG-3’下游引物5’-GCGGCCTTCATTTGAATGT-3’扩增片段长度为422bpS病毒(PVS)上游引物5’-GCCGCATTTGACACATTCGAT-3’下游引物5’-CAATCTCAGCGCCAAGCAT-3’扩增片段长度为199bp
卷叶病毒(PLRV)上游引物5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’下游引物5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3’扩增片段长度为336bp图9为四种病毒PCR扩增产物，图中由由左至右依次为Mraker、PYX阳性材料PCR产物、卷叶病毒阳性材料PCR产物、PVS阳性材料PCR产物、PVY阳性材料PCR产物序列表.txt马铃薯<110>南开大学<120>一种检测马铃薯病毒的试剂盒及方法<160>8<210>1<211>21<212>DNA<213>人工合成<220>
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序列表.txt马铃薯<222>(1)...(20)<400>1cgcgctaacagagttcagcc 20<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(20)<400>1gcaatgggggtccaactcat 20
权利要求
1.一种检测马铃薯病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由反应液、引物、酶液及阳性标准品组成，所述反应液中的组分及体积百分比为5×鼠源逆转录酶反应缓冲液6％～50％、10×PCR反应缓冲液3％～25％、25mmol/L Mg2+2.5％～15％、各25mmol/L dNTPs 0.7％～10％、灭菌水87.8％～0，所述引物为马铃薯X病毒引物、马铃薯Y病毒引物、马铃薯S病毒引物及马铃薯卷叶病毒引物中至少一种，所述马铃薯X病毒引物由序列表中SEQ ID NO.1表示的马铃薯X病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.2表示的马铃薯X病毒下游引物组成，所述马铃薯Y病毒引物由序列表中SEQ ID NO.3表示的马铃薯Y病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.4表示的马铃薯Y病毒下游引物组成，所述马铃薯S病毒引物由序列表中SEQ IDNO.5表示的马铃薯S病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.6表示的马铃薯S病毒下游引物组成，所述马铃薯卷叶病毒引物由序列表中SEQ ID NO.7表示的马铃薯卷叶病毒上游引物和由序列表中SEQ ID NO.8表示的马铃薯卷叶病毒下游引物组成，各上、下游引物的浓度为0.5～2μmol/L，所述酶液的组分及体积百分比为鼠源逆转录酶20％～50％、Taq DNA聚合酶20％～50％、灭菌水60％～0，所述阳性标准品为马铃薯X病毒克隆质粒、马铃薯Y病毒克隆质粒、马铃薯S病毒克隆质粒及马铃薯卷叶病毒克隆质粒中至少一种，并与马铃薯病毒引物相对应，每种病毒克隆质粒浓度均为107～1015copies/μl。
2.一种用权利要求1检测马铃薯病毒的试剂盒检测马铃薯病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)从新鲜的茄科植物组织中提取总RNA；(2)对提取的总RNA进行一步法逆转录-PCR反应取PCR管，加入反应液、待测病毒引物、酶液和总RNA，加水0～30μl，在41～43℃保温20～40分钟进行逆转录，然后进行PCR反应；(3)PCR产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据与阳性标准品相同的位置显现特异性条带的有无，判定标本中是否存在马铃薯病毒。
3.根据权利要求2所述的一种检测马铃薯病毒的方法，其特征在于，PCR反应条件是93～95℃3～7分钟——；93～95℃30～60秒——57～62℃30～60秒——70～72℃30～120秒，共25～40个循环；最后70～72℃延伸8～15分钟。
全文摘要
本发明公开了一种检测马铃薯病毒的试剂盒及检测方法，该试剂盒由反应液、引物、酶液及阳性标准品组成，反应液由鼠源逆转录酶反应缓冲液、PCR反应缓冲液、dNTPs及灭菌水组成，引物为马铃薯病毒引物，阳性标准品为马铃薯病毒克隆质粒，酶液由鼠源逆转录酶、TaqDNA聚合酶、灭菌水组成，该检测方法是从植物组织中提取总RNA；对总RNA进行一步法逆转录－PCR反应；PCR产物经电泳检测，本发明省去了现有方法中，先逆转录再PCR的步骤，节省时间并降低了试剂成本，并有特异性强，灵敏度高，结果准确，不需要大型设备仪器，操作简单，检测速度快，无放射性污染，价格低廉等优点。
文档编号C12Q1/04GK1570146SQ20041001909
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月28日 优先权日2004年4月28日
发明者杜荣骞, 祁骥, 俞健, 罗智敏, 李德森 申请人:南开大学, 天津科润农业科技股份有限公司, 天津市农业生物技术研究中心