专利名称：高效表达人α1－胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
人α1-胸腺肽(α1-thymosin，Tα1)在体内主要存在于胸腺细胞、T-淋巴细胞以及胸腺组织中，在肝、肾、心、肺、脾等器官也有分布。成熟的人α1-胸腺肽由28个氨基酸组成，分子量3.108KD，其序列为Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。体内由111个氨基酸组成的前体α1-胸腺肽原(prothymosin)经酶解加工产生。人α1-胸腺肽在人体血清中的正常浓度大约为540-670pg/mL，其主要生理功能为调节机体的免疫活性，包括刺激多能干细胞分化为胸腺细胞，促进T-细胞的分化和成熟，增强T细胞的功能，并使CD3+和CD4+等细胞的数量升高。人α1-胸腺肽可促进白介素α(IL-1α)、白介素2(IL-2)、白介素(IL-3)，干扰素α及γ(IFN-α，IFN-γ)以及迁移抑制因子(migratory inhibitory factor)的表达。淋巴细胞在受有丝分裂原或抗原刺激后，人α1-胸腺肽可使其产生的IL-2高亲和力受体数量增加。此外人α1-胸腺肽还与细胞周期的调控，血管生长，细胞迁移，组织修复以及精子的穿透能力等相关。
做为一种广谱免疫调节剂，人α1-胸腺肽可能临床用途有如下几个方面(1)用于治疗乙型、丙型肝炎。(2)作为免疫辅助药物。(3)用于肿瘤治疗。(4)用于艾滋病治疗。(5)促进血管生长及组织修复和伤口愈合剂等。国内胸腺肽制备大多是从动物胸腺中提取，由于提取物为混合物，有效成分浓度低，疗效不够理想，且混合物中含动物蛋白，注射时可能会引起过敏反应。近年国外人α1-胸腺肽药品，采用化学合成方法制备，商品名为“日达仙”，治疗乙型、丙型肝炎以及肿瘤等疾病效果显著。但每支“日达仙”含量为1.6mg，价格为800元以上，一个疗程为5万多元，价格昂贵，普通病人难以承受。仅以乙型肝炎为例，全球约有20亿人曾经感染过乙型肝炎病毒，其中有3.5亿患者转化为乙型肝炎病人。中国为乙型肝炎高发病率国家之一，估计约有1.2亿乙型肝炎病人。要治疗这些病人，全靠进口人α1-胸腺肽药品，将会给国家和个人带来沉重的经济损失和精神负担。因此迫切需要研制国产化的高效低价的人α1-胸腺肽样品。
发明内容
为生产成本低的人α1-胸腺肽样品，首先得找到并构建一种高效表达人α1-胸腺肽，即能生产人α1-胸腺肽的基因工程菌。
本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。该基因工程菌具有以下结构该基因工程菌为大肠杆菌，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因。
本发明的进一步特征在于，大肠杆菌为DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)。
本发明的进一步特征在于，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数。
本发明的进一步特征在于，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或PT7。
本发明的进一步特征在于，大肠杆菌为DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或PT7。。含此类启动子的质粒为质粒pET系列，pGEX系列，pQE系列等。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题，其特征在于，在DNA水平上，将含有人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联为多串体，构建成一系列表达载体，转化大肠杆菌，获得一系列高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。
现详细说明本发明的技术方案。
一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤如下第一步 碱基序列合成将人α1-胸腺肽基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，然后按照SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点/化学裂解位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子的碱基序列进行化学合成，将该片段克隆至大肠杆菌pMD18-T载体中，所述的纯化标签为His·Tag或GST，所述的蛋白酶为肠激酶(EK)或凝血酶(thrombin)或Xa因子(Factor Xa)，所述的化学裂解试剂为溴化氰；第二步 构建含单个人α1-胸腺肽基因的DNA序列的基因工程菌将含人α1-胸腺肽基因的DNA序列克隆到合适的大肠杆菌质粒载体上，得到含有单串人α1-胸腺肽基因的DNA序列的质粒，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或PT7。
第三步 构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌利用同尾酶的特性或限制性内切酶粘末端补平后与限制性内切酶平末端相连接的方法，将单串含α1-胸腺肽基因的DNA序列定向克隆为多聚体，至此，构建成了高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点/化学裂解位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第三步中所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是启动子-SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点/化学裂解位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第三步中所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是SD序列—纯化标签—硫氧还蛋白—蛋白酶切位点/化学裂解位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第三步中所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是启动子—SD序列—纯化标签—硫氧还蛋白—蛋白酶切位点/化学裂解位点—人α1-胸腺肽基因—终止密码子。
在上述的构建过程中，所有质粒、大肠杆菌均可从市场购得。
本发明要解决的另一个技术问题是提出一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人α1-胸腺肽样品。
本发明通过以下的技术方案解决上述技术问题。其特征在于，具体操作步骤如下
第一步 液体培养将上述构建好的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌在液体培养基中培养至OD600nm＝0.4-0.8时，加入终浓度a为0.4-1mM的IPTG进行诱导表达3-5小时，产生和积累可溶性表达的人α1-胸腺肽融合蛋白，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数；第二步 纯化制备人α1-胸腺肽融合蛋白离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人α1-胸腺肽融合蛋白组分，用截留分子量为1KD-5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL以上；第三步 制备人α1-胸腺肽样品用蛋白酶或化学试剂裂解人α1-胸腺肽融合蛋白，在4-37℃裂解2-16小时，终止反应，然后再次进行亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人α1-胸腺肽样品，所述的蛋白酶为肠激酶EK、凝血酶、Xa因子，所述的化学试剂为溴化氰。
通过本发明所制备的人α1-胸腺肽按文献(“合成胸腺素α1的生物活性研究”，药物生物技术，1998，5(2)103或按文献“牛胸腺肽的提取及活性检测”，动物医学进展，2002，23(5)66-69)进行活性测定，与化学合成的α1-胸腺肽具有相同的生物学活力。
本发明的优点在于(1)通过基因工程技术的方法生产人α1-胸腺肽，比化学合成方法成本低；(2)通过基因工程技术的方法构建含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的基因工程菌，大大提高了人α1-胸腺肽的表达量；(3)通过在人α1-胸腺肽基因的DNA序列的N端加入纯化标签，只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人α1-胸腺肽融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层析更易于操作。(4)通过在人α1-胸腺肽基因的DNA序列的N端加入蛋白酶酶切位点或化学裂解位点，C端加入终止密码子，只要进行一次酶解或化学裂解便能得到人α1-胸腺肽样品，纯化极为简便，得率高。
因而用本发明提供的基因工程菌及利用该菌生产人α1-胸腺肽，产量高，纯化工艺简化，生产成本较低。
下面的附图用于说明本发明的具体实施方案。
图1质粒pET-32a-Tα1-2c的构建，其中该质粒含n＝2个人α1-胸腺肽基因。
图2质粒pET-32a-Tα1-8c的构建，其中该质粒含n＝8个人α1-胸腺肽基因。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步详述本发明。说明书及以下实施例中所用质粒、菌体等，以及未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1 构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌含有1-16个SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联单位的基因工程菌。下述的pET32a(+)质粒购自Novagen公司。
第一步 碱基序列合成按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，合成以下长度为206bp的片断XbaI SD-Sequence5’-CCtctagaAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTGGAMet Ser GlyHis·Tag KpnITCAGGTCATCATCATCATCATCATTCTTCTggtaccGATGACGACGACAAGSer Gly His His His His His His Ser Ser Gly ThrAsp Asp Asp Asp LysEKAGCGATGCCGCCGTGGATACCAGCAGCGAAATTACCACCAAAGATCTGAAASer AspAla Ala ValAsp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu LysSpeI EcoRIGAAAAAAAAGAAGTGGTGGAAGAAGCCGAAAACTAAGactagtgaattcAC-3’Glu Lys Lys Glu Val Val Glu GluAla Glu Asn End将该片段克隆至大肠杆菌pMD18-T载体中(上海博雅生物技术有限公司合成)。该片断含有SD序列、纯化标签His·Tag、肠激酶EK位点、人α1-胸腺肽(Tα1)基因、终止密码子TAA以及限制性内切酶XbaI、KpnI、SpeI和EcoRI位点，其中XbaI、SpeI是一对同尾酶。
第二步 构建含单个SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA DNA序列的基因工程菌提取pMD18-T质粒，用XbaI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用XbaI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。得到含有单串SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步 构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌利用XbalI和SpeI同尾酶，将质粒pET-32a-Tα1-1c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的二聚体质粒pET-32a-Tα1-2c(图1)。将pET-32a-Tα1-2c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到Tα1基因的四聚体质粒pET-32a-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体质粒pET-32a-Tα1-8c(图2)。将质粒pET-32a-Tα1-8c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的十六聚体质粒pET-32a-Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例2 构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌含有1-16个P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联单位的基因工程菌。所述的P为启动子(Promotor，P)。
第一步 碱基序列合成同实施例1。
第二步 构建含单个P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA DNA序列的基因工程菌提取pMD18-T质粒，用XbaI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用XbaI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。得到含有单串P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步 构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌利用质粒pET-32a(+)上的T7启动子前的限制性内切酶ClaI以及多克隆位点上的限制性内切酶HindIII和SalI完成。将质粒pET-32a-Tα1-1c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用HindIII酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-Tα1-1c用SalI/HindIII双酶切，回收大片段。ClaI酶切后补平的平末端和SalI酶切的平末端可以连接，从而得到P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的二聚体质粒pET-32a-P-Tα1-2c。将质粒pET-32a-P-Tα1-2c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用HindIII酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-Tα1-2c用SalI/HindIII双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联基因的四聚体质粒pET-32a-P-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体质粒pET-32a-P-Tα1-8c。将质粒pET-32a-P-Tα1-8c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用HindIII酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-Tα1-8c用SalI/HindIII双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P-SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联基因的十六聚体质粒pET-32a-P-Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例3 构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌含有1-16个SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联单位的基因工程菌。所述的TrxA为硫氧还蛋白。
第一步 碱基序列合成同实施例1。
第二步 构建含单个SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA DNA序列的基因工程菌提取pMD18-T质粒，用KpnI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用KpnI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。由于质粒pET-32a(+)为一硫氧还蛋白融合蛋白表达系统，故可得到含有单串SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步 构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌利用XbalI和SpeI是同尾酶，将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的二聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-2c。将pET-32a-TrxA-Tα1-2c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的四聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-8c。将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-8c分别用HindIII/XbalI和HindIII/SpeI酶切，将HindIII/SpeI酶切回收的大片段和HindIII/XbalI酶切回收的小片段连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的十六聚体质粒pET-32a-TrxA-Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例4 构建一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌含有1-16个P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联单位的基因工程菌。
第一步 碱基序列合成同实施例1。
第二步 构建含单个P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA序列的基因工程菌提取pMD18-T质粒，用KpnI/EcoRI双酶切后纯化回收小片断；同时将质粒pET-32a(+)用KpnI/EcoRI双酶切，回收大片段。连接上述回收产物并转化到大肠杆菌DH5α中扩增。得到含有单串P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c(1c代表融合基因单体，2c代表融合基因的双体，以此类推)。
第三步 构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用HindIII酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-TrxA-Tα1-1c用SalI/HindIII双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA串联基因的二聚体质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-2c。将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-2c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用HindIII酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-2c用SalI/HindIII双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的四聚体质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-4c。重复上述步骤，可以得到P-SD-TrxA-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因的八聚体基因质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-8c。将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-8c用ClaI酶切后，Klenow片段补平，然后再用HindIII酶切，纯化回收小片段。同时将质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-8c用SalI/HindIII双酶切，回收大片段。将两段回收产物连接后转化到大肠杆菌DH5α中扩增，此时可以得到P-SD-TrxA-His·Tag-EK--Tα1-TAA基因的十六聚体质粒pET-32a-P-TrxA-Tα1-16c。将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，-70℃保藏。
以上第二步所述的质粒也可以用质粒pET41a(+)代替，得到相同的结果。
实施例5 一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人α1-胸腺肽样品。下述的亲和层析介质为NTAO树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶EK，购自NEB公司。
第一步 液体培养将构建好的实施例1中含有1-16串SD-His·Tag-EK-Tα1-TAA基因多聚体的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4-0.8时，加入终浓度为0.4-1mM的IPTG进行诱导表达3-5小时，产生和积累可溶性表达的人α1-胸腺肽融合蛋白。
第二步 纯化制备人α1-胸腺肽融合蛋白离心收集菌体，用NTAO缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行NTAO树脂亲和层析，收集α1-胸腺肽融合蛋白组分，用截留分子量为1KD-5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL以上；第三步 制备人α1-胸腺肽样品用肠激酶酶解解人α1-胸腺肽融合蛋白，在4-37℃裂解2-16小时，终止反应，然后再次进行NTAO树脂亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人α1-胸腺肽样品。
以上第二步所述的NTA亲和层析介质，也可以用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析介质代替，得到相同的结果。Glutathione-Sepharose 4B可购自Novagen公司。
以上第三步所述的肠激酶也可用凝血酶、Xa因子或溴化氰代替，得到相同的结果。若采用凝血酶，实施例1-4中第一步的DNA序列GACGACGACAAG，可换为CTGGTGCCACGCGGTAGT；若采用Xa因子，实施例1-4中第一步的DNA序列GACGACGACAAG，可换为ATCGAAGGTCGT；若采用溴化氰，实施例1-4中第一步的DNA序列GACGACGACAAG，可换为ATG，经过这样的变动，可以得到相似的结果。
凝血酶、Xa因子可购自Novagen公司，溴化氰可购自Merck公司。
以上描述的具体实施方式
旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请权利要求的范围内。
权利要求
1.一种高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌具有以下结构该基因工程菌为大肠杆菌，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因。
2.根据权利要求1所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，其特征在于，大肠杆菌为DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)。
3.根据权利要求1所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，其特征在于，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数。
4.根据权利要求1所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，其特征在于，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或P17。
5.根据权利要求1所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌，其特征在于，大肠杆菌为DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，其携带的质粒中含有表达人α1-胸腺肽的基因的个数为n，n为1到16的整数，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或PT7。。
6.权利要求1所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤如下第一步碱基序列合成将人α1-胸腺肽基因根据大肠杆菌基因翻译的偏爱密码子进行改造，然后按照SD序列-纯化标签-蛋白酶切位点/化学裂解位点-人α1-胸腺肽基因-终止密码子的碱基序列进行化学合成，将该片段克隆至大肠杆菌pMD18-T载体中，所述的纯化标签为His·Tag或GST，所述的蛋白酶为肠激酶(EK)或凝血酶(thrombin)或Xa因子(Factor Xa)，所述的化学裂解试剂为溴化氰；第二步构建含单个人α1-胸腺肽基因的DNA序列的基因工程菌将含人α1-胸腺肽基因的DNA序列克隆到合适的大肠杆菌质粒载体上，得到含有单串人α1-胸腺肽基因的DNA序列的质粒，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或PT7；第三步构建多串高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌利用同尾酶的特性或限制性内切酶粘末端补平后与限制性内切酶平末端相连接的方法，将单串含α1-胸腺肽基因的DNA序列定向克隆为多聚体，所述的基因工程菌为大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位是SD序列-纯化标签-蛋白酶切位点/化学裂解位点-人α1-胸腺肽基因-终止密码子，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数，至此，构建成了高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建，其特征在于，在第三步中所述的含α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位为启动子-SD序列-纯化标签-蛋白酶切位点/化学裂解位点-α1-胸腺肽基因-终止密码子。
8.根据权利要求6所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建，其特征在于，在第三步中所述的含α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位为SD序列-纯化标签-硫氧还蛋白-蛋白酶切位点/化学裂解位点-α1-胸腺肽基因-终止密码子。
9.根据权利要求6所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的构建，其特征在于，在第三步中所述的含α1-胸腺肽基因的DNA序列串联单位为启动子-SD序列-纯化标签-硫氧还蛋白-蛋白酶切位点/化学裂解位点-α1-胸腺肽基因-终止密码子。
10.权利要求1所述的高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人α1-胸腺肽药品，其特征在于，具体操作步骤如下第一步液体培养将构建好的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的基因工程菌在液体培养基中培养至OD600nm＝0.4-0.8时，加入终浓度为0.4-1mM的IPTG进行诱导表达3-5小时，产生和积累可溶性表达的人α1-胸腺肽融合蛋白，所述的基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的含人α1-胸腺肽基因的DNA序列多聚体的数目为1到16的整数；第二步纯化制备人α1-胸腺肽融合蛋白离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人α1-胸腺肽融合蛋白组分，用截留分子量为1KD-5KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL以上；第三步制备人α1-胸腺肽样品用蛋白酶或化学试剂裂解人α1-胸腺肽融合蛋白，在4-37℃裂解2-16小时，终止反应，然后再次进行亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人α1-胸腺肽样品，所述的蛋白酶为肠激酶EK、凝血酶、Xa因子，所述的化学试剂为溴化氰。
全文摘要
一种高效表达人α1－胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该基因工程菌为大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，其携带的质粒中含有n个表达人α1－胸腺肽的基因，其中，n为1到16的整数，质粒的启动子为IPTG诱导启动子Lac、Tac或P
文档编号C12N15/63GK1616652SQ20041001854
公开日2005年5月18日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者徐伟东, 黄静, 吴自荣, 邹竹荣, 金明飞, 金丽, 王嘉 申请人:华东师范大学