一种快速检测转cp4-epsps基因植物及其衍生品的试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于免疫学和食品安全检测领域，具体涉及一种快速检测转CP4-EPSPS基 因植物及其衍生品的试纸条。
【背景技术】
[0002] 杂草危害是各类粮食作物减产的最主要原因之一。草甘膦是一种广谱灭生性、内 吸传导型、易被微生物分解、土壤中无残毒的除草剂，是目前世界上用量最大的除草剂，利 用基因工程将抗草甘膦CP4-EPSPS基因转入作物体内培育出抗草甘膦作物新品种，从而直 接在田间使用草甘膦来控制杂草是解决问题的根本之道。
[0003] 由于抗除草剂标记在商业化转基因植物应用广泛，而在转基因植物研制开发或对 转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源基因进行定性或半定量测 定。
[0004] 随着转CP4-EPSPS基因的农作物及相关产品的快速发展，配套的快速检测技术是 转基因研发及生产和食品安全性评价的重要技术平台，其研究具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种快速检测转CP4-EPSPS基因 植物及其衍生品的试纸条。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0007] 一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条，所述试纸条包括:PVC 底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸;硝酸纤维素膜黏贴在PVC底板的中部， 且硝酸纤维素膜上包被有相互分离的一条测试线和一条控制线;PVC底板一端黏贴样品垫 和胶体金垫，另一端黏贴吸水滤纸;其中，胶体金垫位于硝酸纤维素膜靠近测试线的一端， 压硝酸纤维素膜1-1.5mm，吸水滤纸位于硝酸纤维素膜靠近控制线的一端，压硝酸纤维素膜 2-2.5mm;样品垫贴于胶体金垫的上方，露出胶体金垫2-3mm;所述的胶体金垫上包含胶体金 标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108。
[0008] 所述的测试线为包被在硝酸纤维素膜上的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130。
[0009] 所述的控制线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠 IgG抗体。
[0010] 所述的样品垫由1层吸水玻璃纤维和1层无纺布组成。
[0011]所述的0?44?3?3蛋白单克隆抗体(：1108由保藏号为06110^〇.11292的杂交瘤细 胞株分泌。
[0012]所述的〇?44?3?3蛋白单克隆抗体(：1130由保藏号为06110^〇.11293的杂交瘤细 胞株分泌。
[0013] 所述试纸条在检测转CP4-EPSPS基因植物中的应用。
[0014] 所述试纸条在检测转CP4-EPSPS基因食品中的应用。
[0015] -种转基因检测试剂盒，所述转基因检测试剂盒包含上述的试纸条。
[0016] 所述的转基因为转CP4-EPSPS基因。
[0017] 本发明的有益效果为:所述纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备 而成，检测的特异性强，灵敏度高;使用所述试纸条检测时无需其他任何试剂和仪器，试纸 条加入被测样品液后，在5-10分钟内即可判定检测结果;检测结果形象、直观，当硝酸纤维 素膜上显示一条红色线控制线时，表示在被测样品中不含有被检物；显示两条红色的测试 线和控制线时，表示在被检样品中含有被检物；同时所述试纸条的适用范围广，可满足不 同层次人员需要，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
[0018] 生物材料保藏说明
[0019] 杂交瘤细胞株C1108、C1130保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号分别为CGMCC No. 11292与CGMCC No. 11293，分类命名均 为CP4-EPSPS单抗细胞株，保藏日期为：2015.10.23。中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
【附图说明】
[0020] 图1为一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的纸条结构示意图。
[0021] 图2为所述试纸条对阳性样品及阴性样品的检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1:鼠抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的制备。
[0023]用50yg纯化的CP4-EPSPS蛋白为免疫原，皮下多点注射BALB/C小白鼠，添加福氏完 全佐剂;21天后进行第二次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；14天后进行 第三次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射;7天后进行ELISA效价检测，血清 效价达1:243000; 7天后进行细胞融合前加强免疫，用相同剂量的纯蛋白不加佐剂，脾脏注 射;3天后取免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞进行融合。
[0024] 将免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:1的比例，在无 血清RPMI-1640培养基中混匀，1400rpm离心5min，去除培养基，相同方法洗涤细胞三次；用 50 %的PEG3350作为融合剂，在37 °C下，lmin内缓慢加入lml，搅拌1.5min，用14ml无血清 RPMI-1640培养基终止融合后，4min缓慢滴加完成;800rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬 浮，分装到96孔含有饲养细胞与HAT培养基的细胞板中，于37°C、5%C0 2的细胞培养箱中培 养。培养6天后，用HAT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，筛选得 至_阳性孔用HT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法进行复测，筛选阳性孔。
[0025] 筛选出的特异性强的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，共进行三次克隆，获得单 抗杂交瘤细胞株C1108、C1130。两株杂交瘤细胞进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮 冻存。
[0026] 取体重22g左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-10天后腹腔注入5X 105 个单抗杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，lOOOOrpm离心10min， 收集上清液，即为单克隆抗体腹水。采用ProteinA亲和层析法纯化鼠抗CP4-EPSPS蛋白单克 隆抗体C1108和C1130，-20°C保存。
[0027] 实施例2:CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的效价、亚型和亲和常数的鉴 测。
[0028] 1、CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130效价的测定。
[0029] (1)包被：将分离纯化的CP4-EPSPS蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中 (100ul/孔），CP4-EPSPS蛋白的包被浓度为lug/ml;4°C孵育过夜，然后用洗涤缓冲液冲洗酶 标板，共洗涤3次，拍干备用。
[0030] 向lg非转基因玉米粉加入10ml包被缓冲液，漩涡震荡溶解，得到阴性对照液，将阴 性对照加入酶标板中（lOOul/孔），即为阴性对照孔;4°C孵育过夜，然后用洗涤缓冲液冲洗 酶标板，拍干备用。
[0031] ⑵封闭：每孔加入130U1含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37°C孵育lh，然后用洗涤 缓冲液冲洗酶标板。
[0032] (3)加样:每孔加入100ul单克隆抗体C1108或C1130,初始浓度为lmg/ml，37°C孵育 0.5h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
[0033] (4)加二抗:每孔加入100ul酶标二抗工作液，37 °C孵育0.5h，然后用洗涤缓冲液冲 洗酶标板。
[0034] (5)显色:每孔加入100ul底物溶液，室温避光孵育10min后，每空加入50ul终止液 终止反应，用酶标仪测定450nm波长下的吸收值。
[0035]将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为阳性孔，CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体 C1108和C1130的效价见表1。
[0036] 2、CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130亚型的鉴定。
[0037]采用间接ELISA法鉴定抗体亚型，操作方法与效价检测相同，酶标二抗采用亚型鉴 定抗体，CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和Cl 130的亚型见表1。
[0038] 3、CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和Cl 130亲和常数的鉴定。
[0039] (1)包被:将分离纯化的CP4-EPSPS蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中，蛋 白浓度分别为l〇〇〇ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml;每个浓度包被 12个孔，100ul/孔， 4°C过夜，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
[0040] (2)封闭：每孔加入130ul含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37°C孵育lh，然后用洗涤 缓冲液冲洗酶标板。
[0041] (3)加样:将检测抗体用样品稀释液调节初始浓度至811^/1111，横向倍比稀释1:1-1:59049,加至不同包被量的反应孔中，最后一孔做阴性对照，37°C孵育0.5h，然后用洗涤缓 冲液冲洗酶标板。
[0042] (4)加二抗:每孔加入100ul酶标二抗工作液，37 °C孵育0.5h，然后用洗涤缓冲液冲 洗酶标板。
[0043] (5)显色:每孔加入100ul底物溶液，室温避光孵育10min后，每空加入50ul终止液 终止反应，用酶标仪测定450nm波长下的吸收值。
[0044]结果分析:根据0D值做相应的曲线，横坐标为抗体浓度的对数，纵坐标为读取的0D 值，在最大0D值一半的附近选取几个点做线，通过拟合方程求出不同抗原浓度下最大0D值 一半时对应的抗