一种表面修饰的磁性纳米颗粒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及纳米材料领域，尤其涉及一种表面修饰的磁性纳米颗粒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是指自发或因诊疗操作脱落进入外周血循环的肿瘤细胞，通过采集外周血观察循环肿瘤细胞在血液中的存在或含量的高低，可用于诊断肿瘤的存在、发病过程、评估患者的预后、识别患者接受治疗后临床状况的改善情况等，同时循环肿瘤细胞的分子分析还可以反映患者肿瘤的基因信息，指导个体化用药。
[0003]对于循环肿瘤细胞来说，目前针对其的主要分析方法是蛋白分析方法(免疫荧光染色等)和基因分析方法(例如荧光原位杂交和定量RT-PCR等)，主要是进行循环肿瘤细胞的蛋白组学和基因组学的研究。而对于循环肿瘤细胞的代谢研究，目前仍缺少耦合的平台与技术来进行较好的分析。但是循环肿瘤细胞的代谢研究将为癌症转移和耐药机制提供新的见解，提出新的循环肿瘤细胞的代谢分子研究方法将具有很大的应用潜力，也将在肿瘤研究中起到非常重要的作用。
[0004]细胞的代谢是一个动态过程，它能够揭示细胞内在和外在的特性，并且能在生理和病理方面来研究细胞表现。此外，细胞的代谢，尤其是小分子的代谢，是其表型的多样性以及细胞应对不同环境的直接表现。然而由于低检测灵敏度、高样品复杂度和复杂的样品预处理过程使得细胞代谢的研究仍然面临着巨大的挑战，对于少量细胞例如循环肿瘤细胞的研究更是如此。
[0005]由于磁性微纳颗粒的物理性质、表面化学和磁性，其在生物医学方面的应用越来越普遍。在磁性分离方面，通过对颗粒材料表面化学进行调控，偶联多种靶标进行特异性的捕获来进行诊断和治疗的研究。此外，磁性微纳颗粒材料还能进行表面的功能化修饰，用其来特异性捕获细胞和进行分子分析和检测。同时，激光解析电离质谱技术(LDI MS)作为最基本的分子分析工具，它具有样品处理简单、分析速度快和能进行精准结构鉴定的特点。在LDI MS中，磁性颗粒材料不仅可以用来在样品预处理中特异性的富集蛋白和肽段还能够作为基质材料辅助电离过程。目前基于磁性微纳颗粒的LDI MS过程主要是用来检测诸如蛋白和肽段的生物大分子，在细胞代谢分析领域的小分子检测仍有待进一步拓展。对于耦合循环肿瘤细胞的捕获及其下游的代谢小分子分析则是一片空白，此类技术亟待开发。
【发明内容】
[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种表面修饰的磁性纳米颗粒及其制备方法，并提供了该磁性纳米颗粒在捕获循环肿瘤细胞以及在循环肿瘤细胞的代谢分子分析中的应用。
[0007]本发明所采用的技术方案如下:
[0008]本发明提供了一种表面修饰的磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤:
[0009]步骤I:制备磁性纳米颗粒；
[0010]其具体步骤还包括:
[0011 ]步骤1.1:将三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；
[0012]步骤1.2:在步骤1.1的混合溶液中加入乙酸钠，并超声直到溶液变成均相体系；
[0013]步骤1.3:反应在聚四氟乙烯衬底的高压反应釜中进行，150?195摄氏度条件下反应10小时以上，制得含铁氧化物的磁性纳米颗粒；
[0014]步骤2:使用抗体对步骤I中得到的磁性纳米颗粒进行表面修饰；
[0015]步骤3:加入过量的BSA溶液封闭磁性纳米颗粒表面修饰物的多余位点；
[0016]步骤4:清洗步骤3中得到的经表面修饰的磁性纳米颗粒。
[0017]进一步地，上述步骤2中的抗体能够特异性识别循环肿瘤细胞。
[0018]本发明还提供了另一种表面修饰的磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤:
[0019]步骤1:制备磁性纳米颗粒；
[0020]其具体步骤还包括:
[0021 ]步骤1.1:将三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中；
[0022]步骤1.2:在步骤1.1的混合溶液中加入乙酸钠，并超声直到溶液变成均相体系；
[0023]步骤1.3:反应在聚四氟乙烯衬底的高压反应釜中进行，150?195摄氏度条件下反应10小时以上，制得含铁氧化物的磁性纳米颗粒；
[0024]步骤2:在步骤I中得到的磁性纳米颗粒表面修饰链霉亲和素；
[0025]步骤3:使用生物素偶联的抗体或者适配体对步骤2中得到的磁性纳米颗粒进行表面修饰；
[0026]步骤4:加入过量的BSA溶液封闭磁性纳米颗粒表面修饰物的多余位点；
[0027]步骤5:清洗步骤4中得到的经表面修饰的磁性纳米颗粒。
[0028]进一步地，上述步骤3中的抗体或者适配体能够特异性识别循环肿瘤细胞。
[0029]本发明还提供了一种根据上述制备方法制备得到的表面修饰的磁性纳米颗粒。
[0030]本发明还提供了上述表面修饰的磁性纳米颗粒在捕获循环肿瘤细胞中的应用，包括以下步骤:
[0031]步骤1:将表面修饰的磁性纳米颗粒加入到含有循环肿瘤细胞的血液或者缓冲液中，充分混合；
[0032]步骤2:利用磁铁分离捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒；
[0033]步骤3:清洗步骤2中捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒。
[0034]本发明还提供了上述表面修饰的磁性纳米颗粒在循环肿瘤细胞的代谢分子分析中的应用，包括以下步骤:
[0035]步骤1:将表面修饰的磁性纳米颗粒加入到含有循环肿瘤细胞的血液或者缓冲液中，充分混合；
[0036]步骤2:利用磁铁分离捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒；
[0037]步骤3:清洗步骤2中捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒；
[0038]步骤4:将步骤3中得到的捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒加入到代谢分子溶液中处理0-24小时；
[0039]步骤5:将步骤4中得到的捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒在质谱靶板上制样，并在室温下干燥；
[0040]步骤6:利用激光解析电离质谱，对步骤5中制备的样品进行质谱分析；
[0041 ]步骤7:对质谱结果进行分析，得出结论。
[0042]进一步地，捕获了循环肿瘤细胞的表面修饰的磁性纳米颗粒可直接用作循环肿瘤细胞代谢分子质谱分析的基质。
[0043]进一步地，可利用内标法进行代谢分子的定量检测与分析。
[0044]进一步地，上述步骤4中的代谢分子包括糖类小分子和氨基酸小分子。
[0045]更进一步地，上述糖类小分子包括葡萄糖和蔗糖，氨基酸小分子包括苯丙氨酸和谷氨酸。
[0046]本发明通过采用磁性颗粒材料作为基质，将循环肿瘤细胞的捕获和下游分析有机耦合，弥补了目前循环肿瘤细胞基于蛋白和基因分析方法的不足，并且克能够对循环肿瘤细胞中的代谢分子的代谢情况进行监测。与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0047](I)磁性纳米颗粒制备成本低，可以大批量制作，合成步骤简单；
[0048](2)磁性纳米颗粒能够高效地捕获循环肿瘤细胞，并且具有快速磁响应和紫外吸收；
[0049](3)对于微量细胞也能获得高的捕获效率；
[0050](4)可直接耦合下游的代谢分析；
[0051](5)磁性纳米颗粒既可以作为捕获循环肿瘤细胞的材料，又可以作为质谱分子分析的基质；
[0052](6)能够检测循环肿瘤细胞对于代谢小分子的代谢速度。
[0053]以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的