八肽修饰的地塞米松、其制备、纳米结构和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及八肽Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松，八肽中的 AA为L-Val或L-Phe残基。涉及它们的制备方法，涉及它们的纳米结构，涉及它们对小鼠耳 后心肌移植免疫排斥反应的抑制作用，涉及它们对二甲苯导致炎症反应的抑制作用，进一 步涉及它们不像地塞米松那样会产生骨质疏松及血栓副作用。因而本发明涉及八肽修饰的 地塞米松在制备免疫抑制和抗炎药物的应用前景。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 通过器官移植替换废旧器官，已经成为临床外科的常规治疗手段。器官移植中免 疫排斥反应是器官移植失败的最主要因素。接受器官移植的患者，术后服用地塞米松类糖 皮质激素免疫抑制剂，是避免排斥反应和延长移植器官存活时间的重要措施之一。地塞米 松类糖皮质激素在临床的另外的重要应用是，治疗风湿性疾病，自身免疫病和严重感染或 炎性疾病。患者长期使用地塞米松类糖皮质激素，不可避免地诱发骨质疏松和血栓性疾病。 目前，降低地塞米松类糖皮质激素副作用风险的唯一办法，就是停药。停药的后果是，降低 疗效。改造地塞米松类糖皮质激素的结构，降低或规避副作用，是地塞米松类糖皮质激素研 究的热点。
[0003] 发明人曾经用R⑶四肽修饰皮质激素，制备了结构A的化合物。它们在1. 43 μ mol/ kg剂量下，可延长移植的乳鼠心肌存活时间。它们在25. 5 μ mol/kg剂量下，可抑制小鼠炎 症。它们在1. 43 μ mol/kg剂量下，不会诱发小鼠患骨质疏松症。它们在L 43 μ mol/kg剂 量下，是否不存在血栓形成风险，当时没有定论。
[0005] 结构A.发明人曾经公开的RGD四肽修饰的皮质激素
[0006] 发明人还曾经用尿毒素三肽修饰氢化可的松和泼尼松龙，制备了结构B的化合 物。它们分别在7. 5mmol/kg和2. Ommol/kg剂量下，可延长移植的乳鼠心肌存活时间。没 有发现它们的抗炎活性。它们在7. 5mmol/kg和2. Ommol/kg剂量下，是否不存在骨质疏松 和血栓形成风险，当时没有定论。
[0008] 结构B.发明人还曾经公开的尿毒素三肽修饰的氢化可的松和泼尼松龙
[0009] 采用新方法改造地塞米松的结构，进一步降低用药剂量，不仅消除骨质疏松副作 用，而且消除血栓形成副作用，是发明人一直努力发展的新技术。经过各种组合，发明人认 识到肽与留体五元环被五个以上原子隔离是问题之一。于是发明人用乙酰基代替丁二酰 基，制备了下式的化合物。疗效没有明显改进。
[0011] 接着，发明人采取R⑶四肽逆转连接到L-Lys的侧链氨基上的策略，制备了下式的 化合物。虽然疗效没有明显改进，但是骨质疏松和血栓形成副作用都不再发生。
[0013] 最后，发明人采取尿毒素三肽Glu-Asp-Gly逆转连接到上面化合物的L-Lys的 α-氨基上的策略，制备了本发明的化合物，达到了降低用药剂量，消除骨质疏松副作用和 消除血栓形成副作用三重目标。根据这些研究，发明人提出了本发明。
【发明内容】
[0014] 本发明要解决的第一个技术问题是，提出下式的八肽修饰的地塞米松结构。式中 AA 为 L-Val 和 L-Phe 残基。
[0016] 本发明要解决的第二个技术问题是，提供制备八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松的方法，该化合物包括三大步骤：
[0017] 1)在DMSO中，NaH催化地塞米松17位羟乙酰基的羟基与溴乙酸乙酯脱HBr，将17 位羟乙酰基转化为乙氧羰基甲氧乙酰基。再在NaOH溶液中将17位乙氧羰基甲氧乙酰基转 化为17位羧甲氧乙酰基；
[0018] 2)按照标准的液相接肽法，逐步接肽，将L-Boc-Lys的侧链氨基与羧端游离的全 保护的RGDV或RGDF的羧端偶联，将L-Lys的羧端与α -氨基游离的全保护的Glu-Asp-Gly 的 N 端偶联，制备全保护的八肽 Fmoc-Lys [AA-Asp (OMe) -Gly-Arg (Tos) -Boc) ] -Glu (OBzl)-Asp (OBzl) -Gly-OBzl，然后在20%哌啶的DMF溶液中脱Fmoc制备N游离的全保护八肽Lys [AA-Asp (OMe) -Gly-Arg (Tos) -Boc) ] -Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OBzl，式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe残基；
[0019] 3)在HATU，H0Bt和NMM存在下，在无水DMF中，先将步骤1得到的地塞米松-17-羧 酸与步骤 2 得到的 Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp (OBzl)-G Iy-OBzl偶联，再在三氟乙酸中用三氟甲磺酸脱去全部保护基，制得权利要求1的八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe 残基）。
[0020] 本发明要解决的第三个技术问题是，评价八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe 残基）延 长小鼠耳后移植心肌存活时间。
[0021] 本发明要解决的第四个技术问题是，评价八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe 残基）抑 制小鼠炎症的活性。
[0022] 本发明要解决的第五个技术问题是，评价八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe 残基）抑 制大鼠血栓形成的活性。
[0023] 本发明要解决的第六个技术问题是，评价八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe 残基）抑 制小鼠骨质疏松的活性。
【附图说明】
[0024] 图 1 八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 L-Val 或 L-Phe 残基）的合成路线· i)DMS0,BrCH2CO2C2H5,NaH ;ii)MeOH，NaOH ;iii)DCC，H0Bt，NMM ; iV)4N HCl/EtOAc，v/v)H2，Pt/C ;vi)HATU，HOBt，NMM ;vii)20%哌啶/DMF ;viii)TFMSA，TFA。
[0025] 图 2 浓度为 I. 43 X 10 6M 的八肽 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞 米松（式中AA为L-Val或L-Phe残基）在水溶液中的透射电镜照片。
[0026] 图3化合物对小鼠耳后心肌移植心肌存活的影响，η = 10, 口服给药，0. 1 μ mol/ kg/day，连续给药15天。
【具体实施方式】
[0027] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0028] 实施例 1 制备 Boc-Asp (OBzl)-Gly-OBzl
[0029] 称取 17. 6g (54. 2mmol) Boc-Asp (OBzl), 7. 3g (53. 9mmol) HOBt，干燥四氧咲喃 (THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加 THF溶解的13. 4g(65. Ommol)DCC，搅拌活化30分钟 后，加入 12. 0g(59. 6mmol)HCl · Gly-OBzl，NMM 调 pH = 8,室温反应 12 小时，TLC(CH2C12/ MeOH = 20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用200mL乙酸乙酯溶 解，得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL 饱和硫酸氢钾水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液,50mL饱和碳酸氢钠水溶液,50mL饱和氯化 钠水溶液各洗3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得24. Og(93. 8% ) 标题化合物。
[0030] 实施例 2 制备 HCl · Asp (OBzl) -Gly-OBzl
[0031] 冰浴下向 24. Og (50. 8mmol) Boc-Asp (OBzl) Gly-OBzl 加入 200mL 浓度为 4M 的氯化 氢的乙酸乙酯溶液，反应2小时后，TLC(CH2Cl2/MeOH = 20/1)显示原料点消失。减压浓缩。 残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水乙醚溶解，减压浓 缩。该操作也重复3次。得19. 6g(93. 3% )标题化合物。
[0032] 实施例 3 制备 Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OBzl
[0033] 称取 3. 9g(11. 6mmol)Boc-Glu (OBzl)，I. 65g(12. 2mmol)H0Bt，干燥四氧咲喃 (THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加 THF溶解的2. 86g(13. 9mmol)DCC，搅拌活化30分 钟后加入 5. 7g(13. 9mmol)HCl · Asp(OBzl)Gly-OBzl, NMM 调 pH = 8,室温反应 12 小时， TLC(CH2Cl2/MeOH= 20/1)，显示原料点消失。过滤除去ECU，滤液减压浓缩，残留物用200mL 乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液，饱和50mL氯化钠水 溶液，50mL饱和硫酸氢钾水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL 饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，过滤，滤液减压浓缩， 得6. 3g(78. 8% )标题化合物。
[0034] 实施例 4 制备 HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-OBzl
[0035] 冰浴下向 6. 3g (9. lmmol) Boc-Glu (OBzl) Asp (OBzl) Gly-OBzl 加入 IOOmL浓度为 4M 的氯化氢的乙酸乙酯溶液，反应2小时后，TLC(CH2Cl2/MeOH = 20/1)显示原料点消失。减 压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水乙醚溶 解，减压浓缩。该操作也重复3次，得5. 5g(96. 5% )标题化合物。
[0036] 实施例 5 制备 Fmoc-Lys (Boc) -Glu (OBzl)