[0074] 称取地塞米松-17-撰甲氧乙醜基-Lys [Phe-Asp (OMe) -Gly-Arg (Tos) -Boc] -Glu ( OBzD-Asp(OBzl)-Gly-OBzl 526mg(0. 28mmol)于 IOOmL茄瓶中，冰浴下加入三氟乙酸 3mL， 搅拌15分钟后加入三氟甲磺酸lmL，继续反应15分钟加入80mL无水乙醚，使产物析出，搅 拌5分钟后停止，静置、沉降析出物，小心倾倒出液体。残留物加乙醚洗涤，小心倾倒出液 体。残留物加乙醚洗涤，小心倾倒出液体。残留物减压除去溶剂，残留物加5mL蒸馏水溶 解，得到溶液稀氨水调pH至7,过滤，滤液用Sephdex GlO脱盐，冻干，得142mg (37. 8% )标 题化合物。Mp :96· 7-97·3，[α；β8=+54.1 (C = 0.03, H2O), ESI-MS(m/z) :1355. 27[M+H]+，1H NMR (300MHz，DMS0-d6) : δ /ppm = 8· 26 (m，1H)，7· 62 (m，4H)，7· 23 (m，9H)，6· 22-6. 19 (d，J =9Hz，1Η)，6· 01 (s，1Η)，5· 37 (s，1Η)，4· 58 (m，1Η)，4· 25 (m，3Η)，3· 76 (m，9Η)，3· 00 (m，10Η)， 2· 62 (m，3Η)，2· 34 (m，4Η)，2· 12 (m，6Η)，I. 65 (m，8Η)，I. 17 (m，3Η)，0· 91 (m，3Η)。
[0075] 实验例1测定5a，b的透射电镜照片
[0076] 将5a，b配成浓度为1. 43 X 10 6M的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂 后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米形态。测定表明，5a，b形成规则的纳米球。作 为代表性照片，图2是浓度为I. 43X 10 6M的5a，b的透射电镜照片。结果表明，5a，b的纳 米结构为直径小于IOOnm的纳米球。可见，5a，b的纳米结构非常有利于它们在体内输送。
[0077] 实验例2评价5a，b对小鼠耳后心肌组织移植的影响
[0078] 受体鼠（Balb/c小鼠，雄性，体重20±2g)经10%乌拉坦（10mg/10g体重）腹腔 注射麻醉。1 %新洁尔灭酊耳廓局部消毒，持眼科剪于耳廓背侧中线之前1/3处作一与耳廓 中线垂直处作一 3-4毫米长的切口，勿损伤耳廓静脉。持镊子向耳尖方向钝性分离皮下组 织，使之成一管腔。将新生供鼠（C57bl/6j24小时乳鼠）置于碎冰中一分钟，用75%酒精 皮肤消毒，剖胸摘取心脏。将心脏置于PBS液内搏动1-2次，排空心腔余血。移植时，用刀 片把供心纵向剖成为基本等大的两半，肌纤维成一斜面。将心肌组织移植填入受体鼠耳腔 内，心肌组织的离体时间不超过2分钟。用手指轻按局部，使移植物与受鼠之周围组织贴 紧。移植术后当天给药。空白对照为生理盐水，5a，b用生理盐水溶解，均口服给药，剂量为 0. 1 μ mol/kg/d，0. 2mL/20g体重，连续给药15天，共给药15次。术后第7日起每天记录移 植心肌组织的心电信号，测试异位心电图时，正负电极分别置于移植心脏两侧，接地极连接 在小鼠后肢。
[0079] 绘制移植心肌存活曲线图3。结果表明，在术后第17天5a，b组才出现移植心肌 死亡，心肌存活率比地塞米松大幅度提高。该结果说明，在0. 1 μ mol/kg/d的剂量下5a, b显著地抑制移植心肌组织的排斥反应。与发明人曾经公开结构A的化合物的有效剂量 (1.43ym〇l/kg)相比，本发明的有效剂量降低了 14倍。与发明人曾经公开结构B的化合 物的有效剂量（2. 0和7. Ommol/kg)相比，本发明的有效剂量降低了 2000倍和7500倍。显 然，本发明取得了意想不到的抑制移植心肌组织排斥反应的结果。
[0080] 实验例3用小鼠二甲苯致炎模型评价5a，b的抗炎活性
[0081] 使用小鼠二甲苯致炎模型评价5a，b抗炎活性。地塞米松和5a，b均一次给药，地 塞米松的口服剂量为25. 5ymol/kg，5a，b的口服剂量均为2. 55ymol/kg。生理盐水为空 白对照。ICR雄性小鼠（体重20±2g)随机分为空白对照组，阳性组及给药组，每组10只。 静息一天，操作间维持温度为22°C，实验开始，口服给药，单次给药30min后，往小鼠的左耳 廓均匀涂抹30 μ L二甲苯，2h后断白处死小鼠，剪下左右两耳，用7mm的打孔器在两耳的相 同位置取圆形耳片，称重，求出两耳肿胀差值，作为肿胀度，肿胀度=左耳圆片重量-右耳 圆片重量。
[0082] 表1数据说明，在2. 55 μ mol/kg剂量下5a，b有效地抑制小鼠的炎症反应。与发 明人曾经公开结构A的化合物的有效剂量（25.5ymol/kg)相比，本发明的有效剂量降低 了 10倍。发明人曾经公开结构B的化合物没有抗炎症活性。显然，本发明取得了意想不到 的抑制炎症的结果。
[0083] 表1本发明的化合物对小鼠耳肿胀度的影响
[0084]
[0085] η = 10, 口服给药，双样本等方差t检验；a)与生理盐水组相比P < 0. 01 ;b)与生 理盐水和地塞米松组相比P < 0. 01。
[0086] 实验例4评价5a，b对小鼠股骨的影响
[0087] 实验例2中小鼠待移植心肌全部死亡后断臼处死，取股骨称重并测定骨密度。表 3的数据说明，在0. 1 μ mol/kg剂量下5a，b不会引起小鼠产生骨质疏松症。与发明人曾经 公开结构A的化合物不引起骨质疏松的有效剂量（1. 43 μ mol/kg)相比，本发明的有效剂量 降低了 10倍。发明人曾经公开结构B的化合物没有抗骨质疏松活性。显然，本发明取得了 意想不到的抗骨质疏松的结果。
[0088] 表2本发明的化合物对股骨的重量和密度影响
[0089]
[0090] η = 10, 口服给药，连续给药15天，双样本等方差t检验：a)与生理盐水组相比，P < 0. 05 ;b)与生理盐水组相比P > 0. 05,与地塞米松相比P < 0. 05。
[0091] 实验例5评价5a，b对血栓形成的影响
[0092] 将雄性SD大鼠随机分为组：空白对照为生理盐水，阳性对照为阿司匹林，剂量 167 μ mol/kg ;给药组地塞米松及5a，b剂量均为0· 99 μ mol/kg。口服给药30分钟后，乌拉 坦（20 g/100mL，7mL/kg)麻醉。分离右颈动脉和左颈静脉，把一根6cm长的事先精密称重 的丝线放在聚乙烯管中，将插管充满抗凝剂肝素钠（0. 42mg/mL，0. 42mg/kg)的生理盐水溶 液后，一端插入左侧静脉，注射定量肝素钠抗凝，然后插入右侧动脉。血流从右侧动脉流经 聚乙烯管流入左侧静脉，循环15分钟。15min后取出丝线，精确称重，计算增重，统计化合物 的抗血栓活性。结果列入表3。表3的数据说明，在0. 99 μ mol/kg剂量下5a，b有效地抑 制大鼠形成血栓。发明人曾经公开结构A和B的化合物都没有抗血栓活性。显然，本发明 取得了意想不到的抗血栓的结果。
[0093] 表3本发明的化合物的抗血栓活性
[0095] η = 9，口服给药，0. 99 μ mol/kg，双样本等方差t检验· a)与生理盐水相比P < 0. 01 ;b)与生理盐水相比P < 0. 05 ;c)与生理盐水和地塞米松组相比P < 0. 01。
【主权项】
1. 下式的八肤Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松，式中AA为kVal或kPhe残基。2. 制备权利要求1的八肤Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松的方 法，该方法包括H大步骤： 1) 在DMSO中，N址催化地塞米松17位居己醜基的居基与漠己酸己醋脱皿r，将17位 居己醜基转化为己氧撰基甲氧己醜基。再在化OH溶液中将17位己氧撰基甲氧己醜基转化 为17位駿甲氧己醜基； 2) 按照标准的液相接肤法，逐步接肤，将kBoc-Lys的侧链氨基与駿端游离的全保护 的RGDV或RGDF的駿端偶联，将kLys的駿端与a -氨基游离的全保护的Glu-Asp-Gly的 N 端偶联，制备全保护的八肤 Fmoc-Lys [AA-Asp (OMe) -Gly-Arg (Tos) -Boc) ] -Glu (OBzl) -As P (OBzl)-Gly-OBzl,然后在20%脈巧的DMF溶液中脱Fmoc制备N游离的全保护八肤Lys [ AA-Asp (OMe)-Gly-Arg灯OS)-Boc)]-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-OBzl,式中 AA 为 kVal 或 L-Phe残基； 3) 在HATU，HCffit和NMM存在下，在无水DMF中，先将步骤1得到的地塞米松-17-駿 酸与步骤 2 得到的 Lys [AA-Asp (OMe)-Gly-Arg (Tos)-Boc)]-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gl y-OBzl偶联，再在H氣己酸中用H氣甲礙酸脱去全部保护基，制得权利要求1的八肤 Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly 修饰的地塞米松（式中 AA 为 kVal 或 kPhe 残基）。3. 权利要求1的八肤Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松的纳米结 构。4. 权利要求1的八肤Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松在制备免疫 抑制剂中的应用，其特征在于制得的免疫抑制剂克服了地塞米松引起的松骨质疏松和血栓 副作用。5. 权利要求1的八肤Lys (AA-Asp-Gly-Arg) -Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松在制备抗炎 剂中的应用，其特征在于制得的抗炎剂克服了地塞米松引起的松骨质疏松和血栓副作用。
【专利摘要】本发明公开了下式的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的地塞米松，八肽中的AA为L-Val或L-Phe。公开了它们的制备方法，公开了它们的纳米结构，公开了它们对小鼠耳后心肌移植免疫排斥反应的抑制作用，公开了它们对二甲苯导致炎症反应的抑制作用，进一步公开了它们不像地塞米松那样会产生骨质疏松及血栓副作用。
【IPC分类】A61K38/08, A61P37/06, C07K7/06, C07K1/02, A61P29/00, B82Y30/00, C07K1/06
【公开号】CN105504013
【申请号】CN201410562349
【发明人】彭师奇, 赵明, 王玉记, 吴建辉, 于化龙
【申请人】北京益生康华医药技术有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年10月20日