一种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工艺和食品加工领域，涉及一种具有Cupin结构功能域的IC藏蛋 白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法，具体涉及鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α-淀 粉酶抑制剂的生产和纯化方法。
【背景技术】
[0002] 碳水化合物、脂肪和蛋白质这三种营养元素为人体提供绝大部分的能量，其中碳 水化合物提供的热量约占全部的60% -70%，如果碳水化合物摄入量过多就会转化成脂肪 囤积在机体内，过多的摄入和剩余将会引发肥胖、高血糖、糖尿病等"富贵病"。
[0003] 鹰嘴豆，其籽粒尖如鹰嘴，又叫桃豆、羊头豆、诺胡提等，在我国新疆已有2500多 年的栽培历史。鹰嘴豆为维吾尔族常用药材，具有很高的药用价值，中医用于调湿止泻，解 毒消炎，强骨健胃等，此外，通过大量临床经验证明鹰嘴豆对70多种严重营养不良有明显 的疗效，因此鹰嘴豆成为开发对人类健康有益营养成分的重要植物材料。α -淀粉酶能将多 聚糖淀粉水解为单糖葡萄糖，进而作为机体吸收的能量来源，在人们生活膳食中发挥着重 要的作用。α-淀粉酶抑制剂能够有效地与人体口腔、胃肠道唾液α-淀粉酶及胰脏分泌 的α-淀粉酶结合形成酶-抑制剂的复合物，使α-淀粉酶活性丧失或降低来阻碍食物中 碳水化合物的水解和消化。基于α-淀粉酶抑制剂自身的特点，α-淀粉酶抑制剂在医学 和农业生产中有广泛的应用前景，一方面α -淀粉酶抑制剂可以作为防治和治疗高血糖、 糖尿病及高血脂等疾病的药物，另一方面也可以应用于日常生活中保健，控制饮食，减少肥 胖；同时α -淀粉酶抑制剂基因及产物对农业昆虫防治和减少杀虫剂使用、保护生态环境 有重要的应用价值。
[0004] 我们前期对鹰嘴豆种子α -淀粉酶抑制剂粗提液经硫酸铵分级沉淀、离子交换色 谱和反相色谱的分离纯化后获得一个具有抑制α -淀粉酶活性的蛋白，它属于贮藏蛋白类 型（其在NCBI中编号为Q9SMJ4)，受Q9SMJ4基因控制，完全不同于已知的α -淀粉酶抑制 剂类型，是一种新的类型。该蛋白由alpha亚基（或蛋白链）和beta亚基（或蛋白链）2 个亚基组成，为蛋白前体，其在生物体内最终将剪切生成alpha链和beta链。alpha肽链和 beta肽链蛋白空间结构中各含有一个Cupin结构（如图1)。我们进一步研宄发现凡具有 Cupin结构（功能域）的蛋白普遍具有α-淀粉酶抑制活性，Cupin结构为关键的功能域。 由于鹰嘴豆籽粒中该贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂含量很少，采用天然鹰嘴豆籽粒材料 进行提取纯化，过程复杂，成本昂贵，不适于此类蛋白的提取分离和开发利用。采用生物技 术，运用合理的生物工艺流程可为鹰嘴豆中α-淀粉酶抑制剂的生产及纯化提供新途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种具有Cupin结构功能域的贮 藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的生产和纯化方法。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] -种具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂的生产和纯化方 法，包括以下步骤（1)和选自步骤（2)和步骤（3)中的一项或两项：
[0008] (1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达：
[0009] 将目的蛋白的ORF克隆至原核表达载体，并构建Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体 系；培养Q9SMJ4蛋白大肠杆菌原核表达体系，并诱导目的蛋白表达；其中所述的原核表达 载体含有His标签蛋白编码基因；
[0010] ⑵原核表达可溶性蛋白纯化：
[0011] a.每50mL培养菌液收集的菌体用IOmL缓冲液1重悬菌体，，并加入150~200 μ L 35% 的 TritonX-IOO 和 50 ~100 μ L IOOmM 的 PMSF ;
[0012] b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体；
[0013] c.将超声破碎过的菌液离心，收集上清，弃沉淀；
[0014] d.将含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速0. 5-1. OmL/min，直至上 清液完全流过Ni柱；
[0015] e.用6~10倍柱体积的缓冲液2冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定；
[0016] f.洗脱His标签表达蛋白采用梯度洗脱方式，每一梯度洗脱体积为4~5个柱体 积，收集各个梯度洗脱蛋白；
[0017] g.通过SDS-PAGE电泳检测上一步中各洗脱梯度洗脱蛋白纯度，确定适合收集的 洗脱组分；
[0018] h.将收集的洗脱蛋白液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中透 析20~24h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；
[0019] i.将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达并纯化收集的目的可溶性蛋白溶液；
[0020] (3)原核表达包涵体蛋白纯化及蛋白复性：
[0021] a.每50mL培养菌液收集的菌体用0.1 M磷酸缓冲液IOmL重悬菌体；
[0022] b.将重悬菌液置于冰上，超声破碎菌体；
[0023] c.将超声破碎过的菌液离心，收集沉淀，弃上清；
[0024] d.用0. 1~0. 3M磷酸缓冲液洗涤沉淀，离心，收集沉淀；
[0025] e.用IOmL溶解液溶解沉淀，在室温下孵育l_2h ;
[0026] f.离心30~40min，收集上清液，弃沉淀不溶物；
[0027] g.用8~10倍柱体积缓冲液3平衡Ni柱，控制流速为0. 5-1. OmL/min ;
[0028] h.将步骤f中收集到的含有His标签蛋白的上清液加入Ni柱中，控制流速 0. 5-1. OmL/min，直至上清液完全流过Ni柱，上样体积：柱体积比例最大为15:1 ;i.用4~ 6倍柱体积缓冲液3再次平衡Ni柱，控制流速0. 5-1. OmL/min ;
[0029] j.用2~3倍柱体积的缓冲液4冲洗Ni柱或直至A28tl值达到稳定，流速控制为 1. OmL/min ；
[0030] k.用5~7倍柱体积的缓冲液5洗脱包涵体蛋白流速控制为1.0 mL/min ;
[0031] I. SDS-PAGE电泳检测上一步洗脱蛋白纯度及纯化效果；
[0032] m.在4°C条件下将洗脱收集到的包涵体蛋白自然复性，向溶液中慢慢加入超纯 水，使溶液中脲浓度进行梯度稀释；
[0033] η.将复性结束的蛋白溶液装入截留分子量为3600Da的透析袋中，放入超纯水中 透析20~25h除盐，期间晃动透析袋并更换超纯水；
[0034] 〇·将透析结束的透析袋放入40% (w/v)的PEG 6000溶液中浓缩至适当体积，即 为原核表达纯化收集并复性的目的包涵体蛋白溶液。
[0035] cupin结构是指由至少6个β-折叠片形成的桶状结构，cupin结构域由两个保守 的基本区域组成，每个区域中个含有两个β折叠二级结构，两个基本保守区域之间通过一 段可变化的环状结构相连接；一个保守区域的基本构成为G(X) 5HXH(X)mE(X)6G，另一个保 守区域基本构成为G (X) 5PXG (X) 2H(X) 3Ν，但保守区域中的氨基酸在一些cupin家族蛋白中 表现出非保守性。
[0036] 所述的cupin蛋白结构域来源于高等绿色植物、芽孢杆菌、子囊菌中，含有cupin 结构域蛋白家族包括种子IlS和7S贮藏蛋白、萌发素以及多种功能性蛋白。
[0037] 作为本发明方法的一种优选，所述的具有Cupin结构功能域的贮藏蛋白类型 α -淀粉酶抑制剂为鹰嘴豆籽粒中贮藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂，该抑制剂在NCBI中编 号为Q9SMJ4,命名为Q9SMJ4蛋白。所述的鹰嘴豆贮藏蛋白Q9SMJ4蛋白含有2个cupin结 构域，分别位于其α和β亚基链上。
[0038] 作为本发明方法的一种优选，所述的（1)原核表达体系构建及菌液培养诱导表达 进一步优选包括：
[0039] a.以鹰嘴豆发育种子的cDNA为模板，通过PCR方法获得编码贮藏蛋白类型α -淀 粉酶抑制剂的ORF序列；
[0040] b.利用PCR技术在编码Q9SMJ4蛋白ORF序列的5'和3'端分别添加限制性酶切 位点序列EcoR I和Not I，获得目的基因片段；其中Q9SMJ4蛋白ORF序列去除编码蛋白 信号肽序列；
[0041] c.利用限制性内切酶EcoR I和Not I对步骤b中获得的目的基因片段以及 pET-28a(+)原核表达载体质粒分别进行酶切，胶回收处理过的目的基因片段和质粒DNA片 段；
[0042] d.将上一步获得的已用限制性内切酶处理过的DNA片段用1\连接酶在16°C条件 下连接，获得重组原核表达载体；
[0043] e.将获