Ets结构域转录因子fev蛋白单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是涉及针对ETS结 构域转录因子FEV蛋白单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系以及该抗体的应用。 技术背景
[0002] 前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。世界范围内，前列腺癌发病率在 男性所有恶性肿瘤中位居第二。在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害 男性健康的肿瘤，据美国癌症协会估计，2010年美国大约有217 730例新发前列腺癌，有32 050例将死于此病。在欧洲，每年得到确诊的新发前列腺癌病例大约有260万人，前列腺癌 占全部男性癌症的11%，占全部男性癌症死亡人数的9%。
[0003]调查发现大约30% -50%的前列腺患者在初诊时就已有转移发生。前列腺癌是否 发生转移是选择治疗方案的重要依据，对于进展性前列腺癌，往往抗雄激素、化疗等多种治 疗后仍然转移而治疗失败。因此早期预测前列腺癌的转移潜能及提供新的有效治疗手段， 对于改善病人预后及减少死亡率具有重要意义。
[0004] FEV与ERG、Fli-1/ErgB同属于ETS家族基因的ERG亚族，特异表达于脑组织、小 肠和正常前列腺。研宄发现，在小肠神经内分泌癌及类癌中，FEV与肿瘤的转移密切相关。 FEV在前列腺癌的研宄未见相关报道。根据前期结果，我们首次表明，FEV作为ETS家族一 员，可能作为抑癌基因，其低表达后可促进前列腺癌的发展进程。原因如下：运用基因芯片 检测210例前列腺癌组织及正常组织，发现FEV是表达下调最明显的mRNA分子，其表达在 细胞及组织水平达到验证；细胞实验表明，FEV过表达后可抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭 及转移；结合临床样本资料，FEV与前列腺癌的发展进程（侵袭、转移）密切相关，是独立的 临床预后靶标。因此制备FEV单克隆抗体检测FEV水平对其在临床监测中的应用具有重要 意义。
[0005] 国内外已有针对FEV的多克隆抗体，但其单克隆抗体少见。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供能与FEV蛋白专一结合的单克隆抗体。
[0007] 本发明所述单克隆抗体是以FEV蛋白为靶蛋白，设计合成多肽A序列，与载体蛋白 偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得；所述多肽A序列如SEQ ID NO. 1所示；所述载 体蛋白为KLH;所述单克隆抗体识别FEV蛋白的多肽A序列；所述单克隆抗体的轻链可变区 的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0008] 本发明使用可以诱发机体产生免疫反应并生成抗体的多肽序列，偶联至KLH作为 免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合，并筛选得到能持续、稳定分泌抗FEV蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。
[0009] 由这条多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够识别FEV 蛋白的多肽A序列，将这个单克隆抗体称之为clone6D9。
[0010] 间接ELISA表明clone 6D9可用于FEV蛋白的检测。免疫印迹法表明clone 6D9 可用于前列腺组织中FEV蛋白的检测。
[0011] 本发明还提供了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0012] 本发明提供的单克隆抗体可以准确检测样品中FEV蛋白的水平，在临床检测中将 会得到广泛应用。
【附图说明】
[0013] 图1是抗体的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准（kDa)，BSA为浓度 0. 5mg/ml的牛血清白蛋白，6D9为本发明获得的单克隆抗体；
[0014] 图2是6D9克隆的亚型鉴定图，其中clone 6D9显示IgGl信号最强，依据亚型鉴 定试剂盒说明中结果判定标准，clone 6D9的亚型为IgGl。
[0015] 图3是抗体免疫印迹分析图，其中M是蛋白分子量标准（kDa)，1 :6D9,2 :阳性对照 (心出血为主要抗体）
[0016] 图4是FEV在前列腺增生组织和前列腺癌中表达的免疫印迹分析图，其中pea指 前列腺癌组织，bph指前列腺增生组织。
[0017] 具体实施方法
[0018] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0019] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0020] 实施例1、杂交瘤细胞系的建立
[0021] -、实验材料
[0022] 1、免疫原：本例以FEV蛋白作为靶蛋白，从中选取一段多肽序列，序列如下：多肽 A:CPDPVGDGLFKDGKNPS(SEQ ID NO. 1)，采用化学合成的方式制备这条多肽，纯度要求大于 90%。这条多肽与KLH偶联制备成免疫原。
[0023] 2、培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma 公司。
[0024] 3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
[0025] 4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于 Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于Jacksonlmmune公司；其余试剂均为国产分析纯 产品。
[0026] 二、杂交瘤细胞系的建立
[0027] 1、动物免疫
[0028] 1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每 只Balb/c小鼠每次注射量为100 y g。
[0029] 2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前 3天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。
[0030] 2、杂交瘤细胞的制备
[0031] 按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000 进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10?15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌 抗FEV抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA 法的操作步骤如下：用200 yl的多肽A包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克 隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100 U 1，最后测定450nm OD值。凡0D450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳 性克隆。
[0032] 3、杂交瘤细胞系的建立
[0033] 重复步骤2,进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到1株针对 多肽A的，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
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