一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和生殖发育调控领域，具体涉及青虾FoxL2蛋白及其编码基 因与应用。
【背景技术】
[0002] 青奸，学名日本沼奸（Macrobrachium nipponense)，俗称河奸，隶属十足目 (Decapoda)、长臂奸科（Palaemonidae)、沼奸属（Macrobrachium)，广泛分布于我国各地水 域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业 年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，是目前淡水养殖业中 最有发展前途的品种之一。近年来，随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大，养殖的青 虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况，其中虾个体小型化和"性早熟"的现象尤 为突出。"性早熟"即雌、雄性个体性腺提前发育，在生产中小虾性腺过早成熟，产卵导致个 体变小、池塘养殖密度过大、生长规格不齐、近亲交配等一系列问题，最终商品虾的规格降 低，繁殖性能下降，严重影响了青虾的品质和产值，成为青虾养殖业发展的一大瓶颈。为实 现青虾产业的可持续发展，寻找解决雌性青虾"性早熟"的解决方法变得刻不容缓。
[0003] Forkhead box protein L2 (FoxL2)基因是一种广泛存在于哺乳动物以及鱼类体 内的一种基因，其主要功能为促进卵巢分化以及卵巢的发育。FoxL2基因在小鼠卵巢分化的 开始既有表达。在成熟的雌性小鼠体内敲除FoxL2基因后，其卵巢逐渐退化并伴有精巢的 出现，但卵母细胞取始终存在于小鼠的体内。最近的研宄表明，FoxL2基因抑制精巢的发育 主要是通过抑制S0X9基因的表达。S0X9基因主要促进雄性特征的发育，并在小鼠中可导致 性逆转。FoxL2基因的研宄多见与哺乳动物和鱼类，但尚未见对甲壳动物中FoxL2基因的研 宄。
[0004] RAN干扰（RNA interference, RNAi)是一种快速有效的基因功能研宄方法，已广 泛用于动植物基因功能的研宄。RNAi是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，当细胞中 导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，mRNA发生降解从而阻碍特定基因的表达。 RNAi技术目前已应用于甲壳动物促雄腺中基因的功能研宄。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种青虾FOXL2蛋白及其编码基因与应用，通过 用FoxL2-dsRNA注入雄性或雌性青虾体内，研宄该基因在dsRNA刺激下的表达变化以及对 精巢或卵巢发育的影响，阐释FoxL2基因在青虾中的功能，推动FoxL2基因在甲壳类动物中 的研宄，为利用F 〇XL2-dsRNA干扰技术抗性早熟的实用化提供新思路和参考依据。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种青虾FoxL2蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列。
[0007] 本发明还提供了编码上述的青虾FoxL2蛋白的FoxL2基因，其具有SEQIDNO. 2 所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明还提供了一种扩增上述的FoxL2基因的引物，其正向外引物3FoxL2_Fl的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；正向内引物3FoxL2-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所 示；反向外引物5FoxL2-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；反向内引物5FoxL2-R2的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0009] 本发明还提供了一种上述FoxL2基因制备dsRNA所用的引物，引物序列如SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 4 所示。
[0010] 本发明还提供了一种延缓青虾精巢成熟的生物制剂，其含有以上所述的FoxL2基 因制备得到的dsRNA。
[0011] 本发明提供了一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用，利用FoxL2基因合成的 dsRNA可以特异性的干涉精巢和卵巢中FoxL2基因的表达，将dsRNA通过注射的方式注入青 虾围心腔内，可以有效地延缓青虾精巢成熟的时间，证明其能够显著的延缓青虾精巢的发 育，但对卵巢发育的影响并不明显，因此FoxL2基因在青虾中的功能与其在哺乳动物及鱼 类中相反，首次证明FoxL2基因可促进青虾精巢的发育，可用于调控雄性青虾精巢发育速 度，为解决青虾性早熟提供理论基础。
【附图说明】
[0012] 图1为外源性注射F〇xL2-dsRNA后，对雄性青虾精巢发育的影响图；
[0013] 其中 0d，4d，7d，10d 分别为注射后 0,4,7，10 天（N 彡 3)。
[0014] 图2.为在精巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾内源FoxL2基因的表 达量的影响图；
[0015] 其中0d，4d，7d，10d分别为注射后0,4,7,10天（N彡3)。对照组注射相同剂量的 生理盐水。
[0016] 图3.为外源性注射F〇xL2-dsRNA后，对雌性青虾卵巢发育的影响图；
[0017]其中0(1，4(1，7(1，10(1，14(1分别为注射后0,4,7，10，14天"彡3)。
[0018] 图4.为在卵巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾内源FoxL2基因的表 达量的影响图；
[0019] 其中0山4(1，7(1，10(1，14(1分别为注射后0,4,7，10，14天"彡3)。对照组注射相同 剂量的生理盐水。
【具体实施方式】[0020] 实施例1
[0021] 青虾FoxL2基因全长CDNA的获得，由以下步骤实现：
[0022] 步骤1:总RNA提取：
[0023] 选取5支成熟雄虾的精巢，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。使用 Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法提取精巢总RNA，提取方法参 照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品0D260/280 比值在1. 8-2. 0之间，并测定RNA的浓度。
[0024] 步骤2:青虾FoxL2基因全长cDNA序列的克隆：
[0025] 根据青虾促雄腺转录组文库中获得的FoxL2基因cDNA中间片段序列（SEQ ID NO. 9)，设计特异性正向外引物3FoxL2-Fl(SEQ ID NO. 5)、正向内引物3FoxL2-F2(SEQ ID 勵.6);和反向外引物5卩(《12-1?1(5￡〇10勵.7)、反向内引物5卩(《12-1?2(5￡〇10勵.8)分 别进行cDNA 3'和5'端快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3' -RACE和TaKaRa5' -RACE试剂盒 说明书进行。利用上海生工生物工程有限公司（Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目 的片段的回收，将产物连接到PMD18-T载体（Takara)，并转化入大肠杆菌DH5 a，进行蓝白 斑筛选（培养基为LB固体培养基含amp+，37°C培养12小时），挑取单克隆白斑扩增培养 (培养基为LB液体培养基含amp+，37°C培养6小时。）后，对挑选的克隆进行PCR验证（试 剂成份见表1，PCR反应程序为：94°C预变性3min，然后进入下列循环：94°C 30s，55°C 30s， 72°〇308,30个循环，最后72°〇延伸101^11，41：保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。），将插 入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的产物与青虾促雄 腺转录组文库中的FoxL2中间片段（SEQ ID N0.9)进行拼接，得到青虾FoxL2基因的cDNA 全长（SEQ ID NO. 2)。利用 NCBI 开放阅读框预测软件（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/ projects/gorf/)，得到青奸FoxL2基因编码的蛋白质的氨基酸序列（SEQ ID NO. 1)。
[0026] 经过序列比对显示，青虾FoxL2基因和其它鱼类FoxL2的同源性在70%以上。
[0027]表 1
[0028]
【主权项】
1. 一种青虾FoxL2蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
2. -种编码权利要求1所述的青虾FoxL2蛋白的FoxL2基因，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3. -种扩增权利要求2所述的FoxL2基因的引物，其特征在于，正向外引物3FoxL2-Fl 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；正向内引物3 FoxL2-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6 所示；反向外引物5 FoxL2-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；反向内引物5 FoxL2-R2 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
4. 一种权利要求2所述的FoxL2基因制备dsRNA所用的引物，其特征在于，引物序列如 SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 4 所示。
5. -种延缓青虾精巢成熟的生物制剂，其特征在于，含有权利要求2所述的FoxL2基因 制备得到的dsRNA。
【专利摘要】本发明公开了一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用。利用本发明提供的引物组从青虾精巢或卵巢中克隆到了Foxl2基因，通过利用FoxL2基因制备得到dsRNA，将其注入雄性或雌性青虾围心腔后，可以沉默精巢或卵巢中FoxL2基因的表达，使青虾精巢的发育延缓，但对青虾卵巢的发育影响不明显。因此，青虾FoxL2基因可促进精巢的发育，其功能与FoxL2基因在哺乳动物及鱼类中的作用相反。本发明为解决青虾性早熟现象，培育优良品种提供新的思路和有效手段。
【IPC分类】A61K31-713, C12N15-11, A61P15-08, C12N15-12, C07K14-435
【公开号】CN104592378
【申请号】CN201510021694
【发明人】金舒博, 傅洪拓, 熊贻伟, 蒋速飞, 龚永生, 乔慧, 张文宜
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月15日