专利名称：纯化gla结构域凝血蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域，特别涉及纯化GLA结构域凝血蛋白的领域。
现有技术一般而言，GLA结构域蛋白形成具有共同结构-GLA结构域-的蛋白质家族，GLA结构域由位于这些蛋白质N末端的区域组成，并且包含多个谷氨酰胺残基，它们特别羧化产生羧基谷氨酸或“GLA”残基。GLA结构域蛋白一般包括被称为前肽的N端部分，该部分被维生素K依赖性的羧化酶识别。在GLA结构域的谷氨酰胺残基羧化后，前肽被蛋白水解切割，释放出成熟和活性的GLA结构域蛋白。根据考虑的蛋白质，GLA结构域由约45个氨基酸组成，其中包括9至12个谷氨酰胺残基，它们通常被羧化而产生Gla。GLA结构域蛋白由“维生素K依赖性”的蛋白质组成。GLA结构域蛋白涵盖了凝血因子、骨组织蛋白和芋螺毒素(conopeptides)。GLA结构域凝血因子涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、C蛋白和S蛋白。GLA结构域蛋白，包括维生素K依赖性GLA结构域蛋白，在Furie等人(1999，Blood，Vol. 93 :1798-1808)的文章中特别介绍。维生素K依赖性的GLA结构域凝血蛋白由目的治疗性蛋白组成。在所述蛋白质中，因子II、因子VII、因子IX和因子X代表具有极大治疗性目的的蛋白质，被施用用于预防和治疗多种内稳态功能障碍。可以从天然的人体液中，一般是从人血浆中纯化人GLA结构域凝血蛋白。此外，为了开发出生产和纯化重组人GLA结构域凝血蛋白的方法，已进行了大量研究。例如可提及已作为药物销售的重组人因子VII。关于获得从生物液体中纯化的GLA结构域蛋白(其中这些蛋白质是天然生产的或以重组蛋白的形式生产的)，合适的纯化方法是现有技术中已知的。这些方法一般包括一系列的选择性分离步骤，所述选择性分离是基于蛋白质沉淀和通过层析支持体的步骤，再通过顺序洗脱步骤、深层过滤步骤、超滤或者浓缩步骤。用于纯化目前用于生产药物的GLA结构域凝血蛋白的方法不包括亲和层析步骤。此类技术选择的一个原因是存在这样的缺陷，所述缺陷是由于一部分移植到亲和支持体上的配体分子脱落造成的，脱落的配体分子发现在层析洗脱液体积中与纯化的治疗性蛋白质相结合。作为示例，可提及产品Mononine ,这是基于纯化的人因子IX的药物组合物，所述人因子IX是通过使用固定了小鼠抗fix单克隆抗体的免疫亲和支持体的方法获得的。然而，Mononine 产品的专题文章明确说明在最终产品中存在微量的小鼠抗人Fix单克隆抗体，所述抗体能够在治疗患者体内导致免疫原性问题，因为患者变得对“可滤去物”(小鼠抗体和抗体片段)免疫。Mononiiie 产品的专题文章明确说明对小鼠蛋白质过敏的患者的禁忌症。一般现有技术需要改善的或替代的方法，用于纯化维生素K依赖性GLA结构域凝血蛋白。这涵盖了对替代或改善的方法的需求，所述方法用于获得包括单一的纯化蛋白质例如因子VII或因子IX的组合物，以及用于获得包含GLA结构域蛋白的组合的组合物，例如包括因子II、因子VII、因子IX和因子X的组合的组合物的备选或改进方法。这涵盖了对备选或改进的方法的需求，所述方法用于纯化非重组的GLA结构域蛋白或重组的GLA结构域蛋白。发明概述本发明涉及用于纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，包括下列步骤a)使含有一种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触,所述亲和支持体上固定了特异性结合GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，以便在(i)所述核酸适配体和Qi)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)形成的复合体中释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述生物学GLA结构域凝血蛋白。在上述方法中，所述适配体优选是脱氧核糖核酸适配体。在上述方法中，所述GLA结构域蛋白可以是维生素K依赖性的凝血因子，例如选自因子II、因子VII、因子IX、和因子X。在这些方法的某些实施方案中，所述核酸适配体由SEQ ID NO. 4的序列的适配体组成。
附图简介图I是包含通过使用亲和支持体层析纯化血浆因子IX期间获得的连续级分中所含的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像。泳道I :起始材料；泳道2 :没有保留的级分(NR)；泳道3 :洗脱级分(El);泳道4 :再生级分(E2);泳道5 :纯化的因子IX参考对照；泳道6 已知分子量的参考蛋白质。图2显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，(i)在各种组合物中存在的因子VII、因子IX或因子X，分别与(ii)特异性针对固定在支持体上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。I号曲线人重组因子IX的制品(BeneFIX ) ;2号曲线人血浆因子Vll的制品；3号曲线人血浆因子X的制品；4号曲线阴性对照制品。图3显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，本发明的多种核酸与固定在支持体上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。曲线“I”:低亲和力核酸；曲线“2”中等亲和力核酸；曲线“3”高亲和力核酸；曲线“4” 非常高亲和力核酸。图4显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，核酸适配体“Mapt-1. 2. -CS”和“Mapt-1. 2. -CS0”与固定在支持体上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿y轴共振信号，按任意共振单位表示。I号曲线是用Mapt-L 2. -CS适配体获得的结合曲线；2号曲线是用Mapt-1. 2. -CSO适配体获得的结合曲线。图5显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析图，所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体生产的。沿X轴时间；沿y轴254纳米的吸光值(0. D.)。(I):注射人血浆FIX浓缩液的时刻；⑵非滞留级分的消除峰；(3):纯化的FIX的洗脱峰；(4):在层析支持体再生步骤的过程中产生的峰。 图6是包含在人血浆因子IX的纯化级分中的蛋白质，在不含还原剂的、具有4%至12%双丙烯酰胺梯度的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右泳道1( “SM”)起始组合物，人血浆因子IX浓缩液；泳道2 ( “NR”)包含在不滞留在亲和支持体上的级分中的蛋白质；泳道3(“E1”)包含在洗脱级分El中的蛋白质；泳道4( “E2”)包含在亲和支持体输出的、再生缓冲液中的蛋白质；泳道5( “E3”)包含在亲和支持体输出的、再生缓冲液中的蛋白质；泳道6(“T FIX”)人血浆因子IX的纯化级分。图7显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析图，所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体生产的。沿X轴时间；沿y轴254纳米的吸光值(O.D.)。(I):非滞留级分；(2):纯化的人FIX洗脱峰；(3):层析支持体的再生峰。图8是包含在人血浆因子IX的纯化级分中的蛋白质，在不含还原剂的、具有4% 至12%双丙烯酰胺梯度的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右泳道I ( “Start”)起始组合物，人血浆因子IX浓缩液；泳道2 ( “Notretained”)包含在不滞留在亲和支持体上的级分中的蛋白质；泳道3( “Eluate”)包含在洗脱级分中的蛋白质。图9显示了当进行纯化转基因人血浆因子IX的方法时获得的层析图，所述人血浆因子IX是在转基因母猪的乳汁中生产的，其中纯化使用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体。沿X轴:时间；沿7轴254纳米的吸光值(O.D.)。(I):注射转基因FIX的时刻；(2)非滞留级分；(3):洗脱级分。
图10是包含在重组人因子IX的预纯化级分中的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像，所述重组人因子IX是在转基因母猪的乳汁中生产的，经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右泳道1( “E5”、“start”)起始组合物，在MEP HyperCel 上预纯化的转基因人因子IX;泳道2( “E6”、“Not retained”)包含在不滞留在亲和支持体上的级分中的蛋白质；泳道3( “E7”、“Eluate”):包含在洗脱级分中的蛋白质；泳道4( “E8”、“Regeneration”)包含在再生级分中的蛋白质；泳道5( “T FIX”、“Pure FIX control”)纯化的FIX对照。箭头FIX迁移的位置。图11显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，本发明的多种核酸与固定在支持体上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。曲线“I”:低亲和力核酸；曲线“2”中等亲和力核酸；曲线“3”高亲和力核酸；曲线“4” 非常高亲和力核酸。图12显示了当进行纯化转基因人因子VII的方法时获得的层析图，所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体生产的。沿X轴时间；沿丫轴254纳米的吸光值(0. D.)。(I):注射的时刻；⑵非滞留级分；(3):注射洗脱缓冲液的时刻；⑷洗脱级分。图13是包含在人血浆因子VII的预纯化级分中的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像，所述人血浆因子VII经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右(I):泳道I (“Start”)起始组合物，人血浆因子VII ; (2):泳道2 (“Eluate”):包含在洗脱级分中的蛋白质；(3) =Des-GlaFVII =FVII的低糖基化形式；(4) =FVII的其他难鉴别的形式。
图14显示了当进行纯化转基因人因子VII的方法时获得的层析图，所述人血浆因子VII是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持体生产的。沿X轴时间；沿y轴254纳米的吸光值(0. D.)。(I):非滞留级分；⑵洗脱级分；(3):再生级分。图15是包含在人血浆因子VII的预纯化级分中的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像，所述人血浆因子VII经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持体上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右(I):泳道I (“Start”)起始组合物，人血浆因子VII ; (2):泳道2(“NR”)非滞留蛋白质的级分；(3):泳道3 (“Eluate”)包含在洗脱级分中的蛋白质；(4) =Des-Gla FVII =FVII的低糖基化形式。图16显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线分别对应于血浆FVII在使用各种运行缓冲液的过程中的结合动力学，图16从下至上T3 :缓冲液3 ；T2 :缓冲液2 ；T1 :缓冲液I ;T4 :缓冲液4和T5 :缓冲液5。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。图从下至上曲线示例了增加亲和力的相互作用。图17显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线使得能够确定在使用缓冲液I (50mM Tris, 50mMNaCiaOmM CaCl2,4mM MgCl2, pH 7. 5)的过程中血浆FVII的结合动力学参数。沿x轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。图18显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用缓冲液5 (50mM Tris, IOmM CaCl2,pH 7. 5)的过程中血浆FVII的结合动力学。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。图19显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用多种洗涤缓冲液的过程中血浆FVII与Mapt-2的结合抗性，所述洗涤缓冲液是(I) =FVI注射液I ; (2):含IM NaClUOmMCaCl2、4mM MgCl2 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ； (3):含 2M NaCl、IOmM CaCl2、4mMMgCl2 的50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5，(4):含 3M NaCl、IOmM CaCl2、4mM MgCl2 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ;和(5):含IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间，按秒表示；沿y轴共振信号，按任意共振单位表示。图20显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用多种洗涤缓冲液的过程中血浆FVII与Mapt-2的结合抗性，所述洗涤缓冲液是(I) =FVII注射液；(2):含IOmM CaCl2、4mMMgCl2 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ； (3):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2UM NaCl 的 50mM Tris缓冲液，pH 7. 5，(4):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,2M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ;和(5):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ;和(6):含 IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间,按秒表示；沿y轴共振信号，按任意共振单位表示。图21显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于使用各种洗涤缓冲液时血浆FVII与Mapt-2的结合抗性，所述洗涤缓冲液是(I) :FVII注射液；(2) : 10 %乙醇缓冲液；(3):含IOmM CaCl2、4mM MgCl2UM NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ； (4):含 IOmM CaCl2、4mM、MgCl2,2M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ； (5):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的50mM Tris缓冲液，pH 7. 5 ;和(6):含IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间，按
秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。图22显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-I适配体与重组人因子VII的结合曲线。曲线对应于当使用多种洗涤缓冲液时重组FIX与Mapt-I的结合抗性，所述洗涤缓冲液是(I):重组FVII注射液；(2):含IOmM CaCl2、4mMMgCl2UM NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7.5，； (3):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2、2MNaCl 的50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ； (4):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH 7. 5 ;和(5):含IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间，按秒表示；沿y轴共振信号，按任意共振单位表示。图23显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，固定在支持体上的Mapt-2适配体与重组人因子IX的结合曲线。曲线对应于当使用下列洗涤缓冲液时重组FIX与 Mapt-I的结合抗性，所述洗涤缓冲液是50mM TrisUOmM CaCl2、50%丙二醇，pH 7.5。沿X轴时间，按秒表示；沿7轴共振信号，按任意共振单位表示。(I)注射在缓冲液5中的50%丙二醇。发明详述申请人:尝试设计用于纯化GLA结构域凝血蛋白的新方法，即，适用于从包括GLA结构域凝血蛋白或多种GLA结构域凝血蛋白的起始样品中获得纯化的GLA结构域凝血蛋白的新方法。换言之，申请人寻求开发出(i)对GLA结构域凝血蛋白具有选择性，和(ii)对特定GLA结构域凝血蛋白非选择性的富集或纯化的方法。为了开发出这些纯化方法，申请人分离并表征了新的配体，所述配体(i)具有特异性结合GLA结构域凝血蛋白的能力和(ii)对具体的一种GLA结构域凝血蛋白不特异。本说明书下文中将详述这类新配体的特征，所述新配体由核酸组成，也称为“核酸适配体”，其结合GLA结构域凝血蛋白并且对特定的GLA结构域凝血蛋白不是特异性的。本发明提供了纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，其中利用了这些核酸类型的新配体的结合特性。申请人:还尝试开发获得特异性结合GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体的方法，目标是在纯化方法中使用所述核酸适配体。根据本发明，已获得特异性结合GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体。更具体而言，申请人已获得并表征了专门结合多种GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，S卩，所述蛋白是具有GLA结构域的多种凝血蛋白，其中GLA结构域的特征性谷氨酰胺残基可以被Y羧基化。如实施例中所示，本发明的对GLA结构域凝血蛋白特异性的核酸适配体能够无差别的结合多种具有保守的共同特征的维生素K依赖性凝血蛋白，所述共同特征是GLA结构域。实施例中特别显示，对GLA结构域凝血蛋白特异性的适配体能够结合多种蛋白，例如因子IX、因子VII和因子X。特异且单独识别GLA结构域凝血蛋白(如因子II、因子VII、因子IX或因子X)的核酸适配体是现有技术已知的，包括结合凝血酶的适配体(Zhao等人,2008, Anal Chem, 80卷(19) :7586-7593)、结合因子 IX/IXa 的适配体(Subash 等人，2006, Thromb Haemost,第95卷:767-771 ；Howard 等人，2007，Atherioscl Thromb Vasc Biol，第 27 卷:722-727 ；PCT申请号WO 2002/096926 ;美国专利号US 7312325)、结合因子X/Xa的适配体(PCT申请号WO2002/096926 ;美国专利号US 7312325)或者结合人因子VII/VIIa的适配体(Rusconi等人，2000, Thromb Haemost, 84 卷(5) :841-848 ;Layzer 等人，2007, Spring,第 17 卷:1_11)。应说明的是上述适配体无一描述了用于纯化其结合的靶蛋白的用途。此外，上述适配体专门结合一种GLA结构域凝血蛋白，不与另一种GLA结构域凝血蛋白交叉结合。此类型适配体对给定的GLA结构域凝血蛋白是特异性的，不具有结合另一种蛋白质的能力，包括另一种GLA结构域凝血蛋白，由例如Layzer等人(2007,Oligonucleotides,第17卷1-11)所述。然而，就申请人所知，现有技术中尚未描述过这样的核酸适配体，所述核酸适配体的结合特异性是蛋白质的GLA结构域，且具有结合多种不同的GLA结构域凝血蛋白的能力。获得特异性结合GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体使得能够开发出纯化这些蛋白质的方法，特别是以获得可用作药物活性成分的纯化终产物为目标。本发明涉及纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，包括下列步骤a)使含有一种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触,所述亲和支持体上固定了特异性结合GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，从而在(i)所述核酸适配体和Qi)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)形成的复合体中释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述GLA结构域凝血蛋白。本发明还涉及纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，包括下列步骤a)使含有一种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触,所述亲和支持体上固定了特异性结合多种GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，从而在(i)所述核酸适配体和Qi)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)形成的复合体中释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述GLA结构域凝血蛋白。术语“GLA结构域凝血蛋白”涵盖了任何包含表示为GLA结构域的区域的凝血蛋白，所述区域包含多个在蛋白质合成期间被Y羧基化的谷氨酰胺残基。GLA结构域凝血蛋白涵盖了具有朝向N末端的GLA结构域的凝血蛋白，所述GLA结构域一般位于前肽的下游，即C端一侧，所述前肽在合成过程中被天然的水解。GLA结构域凝血蛋白涵盖了这样的凝血蛋白，所述凝血蛋白中的GLA结构域由约45个氨基酸的区域组成，包括9至12个谷氨酰胺残基，其中至少一部分在细胞中蛋白质合成过程中被正常的羧基化为给定的GLA残基。GLA结构域凝血因子由维生素K依赖性的蛋白质组成，涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。GLA结构域凝血蛋白涵盖了从天然来源例如血浆获得的非重组蛋白，以及可以在体外通过用编码所述凝血蛋白的DNA转染或转化细胞来生产的重组蛋白，或者可以在体内通过已导入编码所述凝血蛋白的转基因的动物来生产的重组蛋白。由转基因动物生产的GLA结构域凝血蛋白在本说明书中也被称为“转基因蛋白”。 根据本发明，术语“核酸适配体”意在表示特异性结合GLA结构域凝血蛋白的单链核酸，包括特异性结合多种GLA结构域蛋白的核酸，在本说明书中也可被称为“抗GLA适配体”。因而本发明的适配体涵盖了在使各个核酸和蛋白质配偶体接触的在先步骤之后，能够检测多种给定的GLA结构域凝血蛋白的复合体的适配体。本领域技术人员可以容易的检测在根据本发明的抗GLA适配体和GLA结构域凝血蛋白之间形成的复合体，例如，通过执行表面等离振子共振检测技术，包括Biaco re 技术，如实施例中示例的。本领域的技术人员还可以通过ELISA类型的常规技术，容易的检测在根据本发明的抗GLA适配体和GLA结构域凝血蛋白之间复合体的形成，如本领域技术人员已知的。实施例中已显示，根据本发明的抗GLA适配体能够分别结合多种不同的GLA结构域凝血蛋白，特别是结合多种人GLA结构域凝血蛋白。已特别显示，根据本发明的给定的抗GLA适配体能够分别与人因子VII、人因子IX和人因子X结合。在某些实施方案中，上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝血蛋白选自维生素K依赖性的凝血因子。在某些实施方案中，上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝血蛋白选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在某些实施方案中，上述纯化方法适合同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的GLA结构域凝血蛋白。在某些实施方案中，上述纯化方法适合同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的GLA结构域凝血蛋白。在某些实施方案中，上述纯化方法适合同时纯化因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在某些实施方案中，上述纯化方法适合同时纯化因子II、因子VII、因子IX、和因
子Xo在某些实施方案中，上述纯化方法适合同时纯化因子VII、因子IX和因子X。同时纯化一种以上的GLA结构域凝血蛋白特别取决于用于执行纯化方法的起始样品的类型。特别的，在方法结束时，以纯化形式获得的GLA结构域凝血蛋白的数量和身份，逻辑上受初始存在于起始样品中的GLA结构域凝血蛋白的数量和身份的限制。一般而言，抗GLA适配体可以由DNA (脱氧核糖核酸)或RNA (核糖核酸)分子组成，并具有结合GLA结构域蛋白的能力，该能力大于结合不包含任何GLA结构域的蛋白的能力。可以通过出于本发明的需要而特别开发的方法来获得抗GLA适配体，所述方法详细描述在本说明书的下文中。在某些实施方案中，根据本发明的抗GLA适配体具有多个共同的结构特征，包括这样的序列，所述序列从5’端至3’端顺序包括(i)长度约20个核苷酸的不变的特定核苷酸序列，后续为(ii)长度约40至50个核苷酸的可变核苷酸序列，后续为(iii)长度约20个核苷酸的不变的特定核苷酸序列。应说明，可变核苷酸序列(ii)可彼此具有非常强的核苷酸序列同一丨I"生。在本说明书中说明的选择抗GLA适配体的方法是这样的类型，其使得能够获得抗GLA适配体的家族,所述抗GLA适配体能够识别多种GLA结构域凝血蛋白，特别是人GLA结构域凝血蛋白。、
从结构的观点出发，特异性结合GLA结构域凝血蛋白的能够根据本发明获得的核酸或核酸适配体的家族的每个成员包含至少15个连续核苷酸的多核苷酸，与下列通式(I)的核酸具有至少40%核苷酸同一性5，-[SEQ ID NO. I] X-[SEQ ID NO. X]-[SEQ ID N0.2]y_3’ (I)，其中- “SEQ ID NO. X” 由序列 SEQ ID NO 3 的核酸组成，- “X”是等于0或I的整数，和- “Y”是等于0或I的整数。在某些实施方案中，序列SEQ ID勵.父的核酸具有长度15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在其他实施方案中，序列SEQ ID N0.X的核酸具有长度43、44、45、46、47、48或49个核苷酸。在某些其他优选的实施方案中，序列SEQ ID勵]的核酸具有长度43、44或45个核苷酸。如前已述，通式⑴的核酸长度至少是15个核苷酸。在某些实施方案中，通式(I)的核酸长度至少是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或81个核苷酸，从而涵盖了具有所述每个确切长度的核酸。当整数“X”等于0，并且整数“y”等于I时，本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸，所述核酸包含与下列通式(I-I)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸5，-[SEQ ID NO. X]-[SEQ ID N0.2]_3， (I-I)当整数“x”等于1，并且整数“y”等于0时，本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸，所述核酸包括与下列通式(1-2)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸5，-[SEQ ID NO. I]-[SEQ ID N0.X]_3， (1-2)当整数“x”等于0，并且整数“y”等于0时，本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸，所述核酸包括与下列通式(1-3)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸5，-[SEQ ID NO. X]-3， (1-3)因而，上述核酸适配体涵盖了包括与序列SEQ ID NO. 3的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸。—般而言，与第二多核苷酸或核酸具有至少40%核苷酸同一丨丨生的第一多核苷酸与所述第二多核苷酸或核酸具有至少41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%或100%的核苷酸同一性。在包含序列SEQ ID NO. X的本发明核酸的某些实施方案中，所述序列SEQ ID NO. X选自这样的核酸，所述核酸具有与选自序列SEQ IDN0S. 3、6至35、37和38的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15个连续的核苷酸。在包含序列SEQ ID NO. X的本发明核酸的某些实施方案中，所述序列SEQ ID NO. X选自这样的核酸，所述核酸与选自序列SEQ ID N0S. 3、6至35、37和38的序列具有至少41 42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 100% 的核苷酸同一性。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中，所述适配体选自这样的核酸，所述核酸包含与选自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15个连续核苷酸的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中，所述适配体选自这样的核酸，所述核酸包含选自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列的至少15个连续核苷酸的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中，所述适配体选自这样的核酸，所述核酸包含与选自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中，所述适配体选自这样的核酸，所述核酸包含选自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中，所述适配体选自这样的核酸，所述核酸由选自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列组成。由上述可得出，本发明涵盖了单链核酸家族，所述单链核酸家族具有上文定义的通式(I)系列的至少15个连续核苷酸。出于本发明的目的，两条核酸序列之间的“百分比同一性”是通过比较窗ロ，比较两条最佳比对的序列来确定的。因而，相比參照序列(不包含这些添加或这些缺失)，比较窗口中的核苷酸序列部分可以包括添加或缺失(例如空位)，从而获得两条序列间的最佳比对。百分比同一性如下计算通过确定在两条比较序列中都观察到的相同核酸碱基的位置数，之后用两条核酸碱基之间相同的位置数除以比较窗ロ中的位置总数，再将结果乘以ー百，从而获得两条序列相对于彼此的百分比核苷酸同一性。可以通过使用已知算法的计算机执行用于比较的序列的最佳比对。完全优选的，使用CLUSTAL W软件(I. 82版)确定百分比序列同一性，參数固定如下(I)CPU MODE = Clustalff mp ； (2) ALIGNMENT = “完全，，；(3) OUTPUT FORMAT = “aln w/ numbers” ； (4) OUTPUT ORDER = “ 比对的” ；(5) COLOR ALIGNMENT = “否”;(6)KTUP (字长)=“默认 ” ；(7) WINDOW LENGTH = “ 默认 ” ；(8) SCORE TYPE = “ 百分比 ” ；(9) TOPDIAG = “ 默认” ；(10)PAIRGAP = “默认” ；(II)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = “无” ；(12)MATRIX =“默认” ；(13) GAP OPEN = “默认” ；(14) END GAPS = “默认” ；(15) GAP EXTENSION = “默认”；(16) GAP DISTANCES = “默认”；(17) TREE TYPE =“进化树”和(18) TREE GRAPH DISTANCES=“隐藏”。通过阐明并且对于本发明的核酸适配体的某些实施方案，本领域技术人员基于上面式(I)的核酸适配体的结构定义，可以容易地自动产生所有可能序列SEQ ID N0.X，例如通过数字计算机，其内存加载一组合适的指令。适当时，本领域技术人员通过所述数字计算机可以自动分别确定(i)空间结构模型与具有序列SEQ ID NO. 4的抗-GLA核酸适配体相似或相同的那些序列，和(ii)核酸适配体结构与具有序列SEQ ID NO. 4的抗-GLA核酸适配体的不同的那些序列。空间结构与具有序列SEQ ID NO. 4 的抗-GLA核酸适配体相似或相同的核酸适配体包括包含与其相似或相同的一系列环和茎的那些核酸适配体。为了确定式(I)的核酸的二级空间结构，本领域技术人员可以尤其基于其核苷酸序列的描述使用 Zuker(2003, Nucleic Acids Research, Vol231 (13) :3406-3413)所述的mFold 计算机程序产生模型，所述程序也可以在以下网址使用http://mfold. bioinfo,rpi. edu/0优选地，根据下面的参数使用mFold计算机程序(i)具有线性序列的DNA，(ii)折叠温度25°C，(iii)离子条件[Na+] 150mM；[Mg++] 4mM, (iv)校正类型寡聚体，(v) “次优”数目百分比2，(vi)所计算的折叠数目的上限50，(vii)两个碱基对之间的最大距离无限制，和(viii)对其他参数使用默认值。本领域技术人员可以实施(i)适配体的结构模型和(ii)刚产生的式(I)的适配体的结构模型之间的比较步骤，并且如果刚产生的式(I)的适配体的结构模型与具有序列SEQ ID NO. 4的抗-GLA适配体的相同或相似，那么他们肯定选择刚产生的式(I)的适配体。在任何情况下，为了证实刚产生的式(I)的适配体的肯定选择，本领域技术人员可以例如根据本说明书、尤其实施例中描述的方法之一验证结合选自人因子VII/VIIa、人因子IX/IXa和人因子X/Xa的GLA-结构域凝血蛋白的性质。在本发明的抗GLA核酸适配体的某些优选的实施方案中，所述核酸适配体包括这样的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸，所述多核苷酸与通式(I)的核酸具有至少80%核苷酸同一性，从而涵盖了包括这样的多核苷酸的至少15个连续的适配体，所述多核苷酸与通式(I)的所述核酸具有至少 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 100%核苷酸同一性。根据本发明的核酸适配体涵盖了序列SEQ ID NO. 4的核酸适配体。记得序列SEQID NO. 4的适配体由通式(I)的适配体组成,其中序列SEQID NO. X由序列SEQ ID NO. 3组成。还记得序列SEQ ID NO. 3的适配体由通式(1-3)的适配体组成，其中缺少序列SEQ IDNO. I 和序列 SEQ IDN0. 2。申请人:显示序列SEQ ID NO. 3的适配体具有选择性结合活性GLA结构域凝血蛋白的能力，所述能力与序列SEQ ID NO. 4的适配体的能力相似。这些结果显示在序列SEQ IDNO. 4的适配体的特定结合特性中存在序列SEQ ID NO. 3的核酸的基本性质。一般而言，这些结果显示序列SEQ IDN0.X的核酸在通式(I)的适配体中的关键性质，序列SEQ ID NO. X的核酸赋予通式(I)的适配体选择性结合活性GLA结构域凝血蛋白的能力。本发明的核酸适配体因而也涵盖了序列SEQ ID NO. 3的适配体。实施例中还显示多种适配体,包括序列SEQ ID N0S. 6至35的适配体，具有选择性结合GLA结构域凝血蛋白的能力，适当时具有不同亲和力水平。作为示例，在序列SEQ IDNOS. 6至35的适配体中，具有与人因子IX最大结合能力的适配体是序列SEQ ID NO. 35的适配体，也可被表不为“Mapt-1. 2. -CS”。实施例中也鉴别了具有大于上述Mapt-1. 2. -CS适配体的结合GLA结构域凝血蛋白的能力的适配体。此类适配体的实例是序列SEQ ID NO. 36的适配体，也可被表示为“Mapt-1. 2. -CS0”。序列SEQ ID NO. 36的Mapt_l. 2. -CSO适配体是包括这样的多核苷酸的至少15个连续核苷酸的适配体，所述多核苷酸与下列通式(I)的长度为62个核苷酸的核酸具有至少40%的核苷酸同一性5’-[SEQ ID NO. I]-[SEQ ID NO. 35]-3’，并且由这样的核酸组成，所述核酸是所述通式(I)的核酸中从位置10的核苷酸至位置 49的核苷酸。实施例中还显示，序列SEQ ID N0S. 37至39的每种核酸都具有结合GLA结构域凝血蛋白的能力。序列SEQ ID N0S. 39的适配体还可表示为“Mapt-2”。序列SEQ IDN0S. 37的适配体还可表示为“Mapt-2-CS”。序列SEQ ID N0S. 38的适配体还可表示为“Mapt-2. 2-CS”。应说明的是Mapt-2-CS适配体的序列包括在Mapt-2适配体的序列内■ 它是Mapt-2适配体的“核心序列” SEQ ID NO. X。实施例中显示，本发明的抗GLA适配体可成功用于生产亲和层析支持体，所述支持体用于分离GLA结构域凝血蛋白和其他蛋白质的样品。特别是为了制备亲和层析支持体，本发明的抗GLA核酸适配体优选包括在化学结构中，在本说明书中也被称为“化合物”，所述化学结构具体包括间隔区手段，以及恰当时包括用于固定在固相支持体上的手段。在某些实施方案中，核酸适配体包括在下列通式(II)的化合物的结构中[IMM]x-[SPAC]y_[APT] (II)，其中-[IMM]表示固定在支持体上的化合物，-[SPAC]表示间隔区链，-[APT]表示本说明书中定义的抗GLA适配体，-X是等于0或I的整数，和_y是等于0或I的整数。在通式(II)的化合物的某些实施方案中，[APT]由序列是选自序列SEQ ID NO :3、4和6至39的脱氧核糖核酸组成。在通式(II)的化合物中表示为[SPAC]的“间隔区链”可以是任何已知的类型。所述间隔区链的功能是物理上分隔核酸与固相支持体的表面，所述表面上可以固定所述化合物，并允许核酸相对于其固定的固相支持体的表面的相对移动。间隔区链限制或防止了位阻影响在所述核酸和可与其产生接触的凝血蛋白分子之间的结合事件，其中所述位阻是由于在固相支持体和核酸之间太接近导致的。在通式(II)的化合物中，间隔区链优选与核酸适配体的5’端或3’端连接。有利的，间隔区链同时与适配体的一端和固相支持体连接。具有含间隔区的构造具有不将适配体直接固定在固相支持体上的优势。优选的，间隔区链是非特异性的寡核苷酸或聚乙二醇(PEG)，或另一种亲水性的基于烃的链。当间隔区链由非特异性的寡核苷酸组成时，所述寡核苷酸有利的包括至少5个核苷酸的长度,优选长度在5至15个核苷酸之间。在间隔区链由聚乙二醇组成的通式(II)的化合物的实施方案中，所述间隔区链涵盖了由例如Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)类型的聚乙二醇。如实施例所示，用包含间隔区链[SPAC]的通式(II)的化合物，和不具有间隔区链[SPAC]的通式(II)的化合物都可进行GLA结构域凝血蛋白的纯化。为了将适配体固定在间隔区链上，可以用多种化学基团化学修饰核酸，例如使得能够共价固定所述核酸的基团，例如巯基、胺或任何其他能够与固相支持体上存在的化学基团反应的基团。在通式(II)的化合物中，化合物[IMM]由这样的化合物组成，所述化合物选自(i) 能够与固相支持体材料形成一个或多个共价键的化合物，和(ii)能够通过弱的非共价键(包括氢键、静电力或范德华氏力)特异性结合在固相支持体上的化合物。在某些情况下，化合物[MM]由于是由通过共价键彼此连接的原子链组成，因而可以具有间隔区链的行为。然而，根据定义，，化合物[IMM]绝不可以表示在根据本发明的通式(II)的化合物中的[SPAC]链。换言之，在通式(II)的化合物中，当存在[SPAC]链时，其不可以通过共价键或弱的非共价键与层析支持体直接连接。第一种类型的化合物[I丽]涵盖了双功能偶联剂，例如戊二醛、SIAB或SMCC。SIAB 化合物，如 G. T. Hermanson(1996, Bioconjugate techniques, San Diego Academic Press,第239-242页)所述,是下列通式(A)的化合物
Na+ O-0
I //
O^=S. U
o
(A)SIAB化合物包含两个反应基，分别是碘乙酸基和硫代-NHS酯基，这些基团分别与
氣基和疏基反应。SMCC 化合物，如 M. K. Samoszuk 等人(1989，Antibody, ImmunoconjugatesRadiopharm.，2(1) :37_46)所述，是下列通式(B)的化合物
权利要求
1.纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，其包括下列步骤a)将含有ー种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触，所述亲和支持体上固定了特异性结合多种GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，以便在(i)所述核酸适配体和Qi)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)中形成的复合体释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述GLA结构域凝血蛋白。
2.权利要求I的方法，其特征是所述核酸适配体由脱氧核糖核酸适配体组成。
3.权利要求I和2之一的方法，其特征是所述核酸适配体包括在下列通式(I)的化合物的结构中[IMM]x-[SPAC]y-[APT] (I)，其中-[IMM]表示固定在支持体上的化合物，-[SPAC]表示间隔区链，-[APT]表示特异性结合GLA结构域蛋白的核酸，-X是等于O或I的整数，和-y是等于O或I的整数。
4.权利要求1-3之一的方法，其特征是所述GLA结构域凝血蛋白是维生素K依赖性的凝血因子。
5.权利要求1-4之一的方法，其特征是所述GLA结构域凝血蛋白选自因子II、因子 VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。
6.权利要求1-4之一的方法，用于同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、 因子X、蛋白C和蛋白S的GLA结构域凝血蛋白。
7.权利要求1-4之一的方法，用于同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、 因子X、蛋白C和蛋白S的GLA结构域凝血蛋白。
8.权利要求1-4之一的方法，用于同时纯化因子II、因子VII、因子IX和因子X。
9.权利要求1-8之一的方法，其特征是所述核酸适配体由具有选自序列SEQID NO 3, 4和6至39的序列的适配体组成。
10.特异性结合一种或多种GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，它结合靶GLA结构域蛋白的能力不受高离子强度环境的改变。
11.权利要求10的适配体，其特征是它结合靶GLA结构域蛋白的能力不受具有至少0.5M的最终NaCl浓度的高离子强度环境的改变。
12.特异性结合GLA结构域蛋白的核酸适配体，其包含选自具有序列SEQID NO :3、4和 6至39的序列的核酸的核酸。
13.权利要求10-12之一的核酸适配体，其特征是它由脱氧核糖核酸适配体组成。
14.亲和支持体,其上固定了权利要求10-13之一的核酸适配体。
全文摘要
本发明涉及纯化GLA结构域凝血蛋白的方法，包括下列步骤a)将含有一种或多种GLA结构域凝血蛋白的样品与亲和支持体接触，所述亲和支持体上固定了特异性结合多种GLA结构域凝血蛋白的核酸适配体，以便在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝血蛋白之间形成复合体，b)从步骤a)中形成的复合体释放GLA结构域凝血蛋白，和c)以纯化的形式回收所述GLA结构域凝血蛋白。
文档编号C07K14/745GK102639701SQ201080043629
公开日2012年8月15日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月31日
发明者G·佩雷, N·比霍罗, S·什图鲁 申请人:Lfb生物技术公司