结合pcsk9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质的制作方法

专利名称：结合pcsk9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新(kexin)9型(PCSK9)的基于纤连蛋白的支架域蛋白质。本发明还涉及该新蛋白质在治疗应用中用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的用途。本发明进一步涉及包含这些蛋白质、编码这些蛋白质或其片段的多核苷酸的细胞，且涉及包含编码这些新蛋白质的多核苷酸的载体。
现有技术动脉粥样硬化是导致造成工业化国家大多数死亡的冠心病(CHD)的动脉疾病(Lusis (2000))。现已充分确定CHD的若干风险因素血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、不良饮食、不活动及紧张。在临床上最相关且常见的血脂异常以高甘油三酯血症存在或不存在下伴随高胆固醇血症的·低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白(LDL及VLDL)的增加为特征(Fredrickson等人(1967))。LDL胆固醇的单独升高是CHD的最常见风险因素之一。PCSK9 (亦称作HCH0LA3、NARC-1或 3)系属于分泌性枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚家族的蛋白酶(Naureckiene 等人,Arch. Biochem. Biophy.，420:55-57 (2003))。已显不，PCSK9是胆固醇稳态及循环低密度脂蛋白浓度的关键调节者。循环PCSK9蛋白通过直接结合LDL受体并促进其在肝细胞中的降解来控制LDL代谢。PCSK9介导的LDL受体蛋白质及活性的下调可减少LDL从循环中的清除并提高LDL浓度。已知PCSK9的若干突变形式，包括 S127R、N157K、F216L、R218S 及 D374Y，其中 S127R、F216L 及 D374Y 与常染色体显性高胆固醇血症(ADH)关联。人们相信野生型PCSK9可增加LDL受体的更换速率，从而导致LDL 清除降低(Maxwell 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. , 102(6) : 2069-2074 (2005) ；Benjannet等人及Lalanne等人)，而PCSK9的功能丧失突变会导致低密度脂蛋白受体(LDLR)浓度增加、循环LDL清除增加及血衆胆固醇水平的相应降低(Rashid等人，Proc. Natl. Acad.Sc1.，102(15) : 5374-5379 (2005))。因此，PCSK9是治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的潜在靶标。基于纤连蛋白的支架(fibronectin based scaffolds)是一个蛋白质家族，这些蛋白质能够进化而结合任何感兴趣的化合物。这些蛋白质通常利用源自纤连蛋白III型(Fn3)或Fn3-样结构域的支架，以具有天然或工程化抗体(亦即，多克隆、单克隆或单链抗体)的特征的方式作用，且另外具有结构优势。具体而言，这些抗体模拟物的结构已经设计而具有最优的折叠、稳定性及溶解性，甚至在通常导致抗体结构及功能损失的条件下亦如此。基于纤连蛋白的支架蛋白质的一个实例是阿德奈汀(Adnectin)(Adnexus, Bristol-Myers Squibb R&D 公司)。
纤连蛋白III型(Fn3)结构域自N末端至C末端按顺序包含β或β样链A ;环AB ；β或β样链B ;环BC ; β或β样链C ;环CD ; β或β样链D ;环DE ; β或β样链E ；环EF^或β样链F ;环FG;及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF及FG中的任一者或全部皆可参与靶物结合。BC、DE及FG环在结构与功能两方面皆与免疫球蛋白的互补决定区(OTR)类似。美国专利第7，115，396号描述了 Fn3结构域蛋白质，其中改变BC、DE及FG环可获得高亲和力TNFa结合物。美国专利申请公开第2007/0148126号描述了 Fn3结构域蛋白质，其中改变BC、DE及FG环可获得高亲和力VEGFR2结合物。获得结合PCSK9的经改良的纤连蛋白域支架蛋白质对于治疗性处理动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病将是有利的。

发明内容
本申请提供针对人类PCSK9的阿德奈汀。本发明的一个方面提供包含Fn3结构域的多肽，其中一或多个溶剂可及(solvent accessible)环已经过随机化或突变。在一些实施方案中，Fn3结构域是源自人类纤连蛋白III型结构域的野生型第10模块C°Fn3)的Fn3结构域。在一些实施方案中，本发明的kiFM多肽与人类uiFr^结构域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85% 或 90% 同一。在一些实施方案 中，一或多个选自BC、DE及FG的环的长度可相对于相应的人类纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，本发明多肽包含纤连蛋白III型第10C°Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域包含环AB ;环此；环CD ^DE ^EF ;及环FG ;且选自环BC、DE及FG中的至少一个环具有相对于人类wFM结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明多肽包含含有与非环区至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列的Fn3结构域。在一些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自由SEQ ID NO:2_17、106-135及301-303组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含如表3中所展示的SEQ ID N0:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，BC 环包含序列 PPPSHGYG(SEQ ID NO: 2 的残基 3_10)、DAPAHAYG (SEQ ID NO: 5的残基 3-10)、EPFSRLPGGGE (SEQ ID NO: 106 的残基 3-13)或 DAPADGGYG(SEQ ID NO: 107 的残基3_11)。在一些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自SEQ ID NO: 18-27及136-141的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含如表3中所示的SEQ IDNO: 18-27及136-141中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，DE环包含序列PGKG(SEQ ID NO: 18 的残基 2-5)、VGVG(SEQ ID NO: 27 的残基 2-5)或 VSKS (SEQ ID NO: 137的残基2-5)。在一些实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自SEQ ID NO:28-38及142-172的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含如表3中所示的SEQ IDNO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，FG环包含序列 EYPYKHSGYYHR(SEQ ID N0:28 中的残基 1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO: 142 中的残基
1-12)或 EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO: 167 中的残基 1-12)。
在一些实施方案中，kiFM结构域可以以氨基酸取代、插入或缺失开始及/或结束。在一些实施方案中，本发明蛋白质包含SEQ ID NO:2-17、106-135及301-303中所示的BC环序列中的一个环序列；SEQ ID N0:18-27及136-141中所示的一个DE环序列；及SEQ ID NO:28-38及142-172中所示的一个FG环序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质包含一个BC环序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO: 2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分；一个DE环序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO: 18-27及136-141中任一者的阴影部分；及一个FG环序列，其包含如表3中所示的SEQ ID NO: 28-38及142-172中任一者的阴影部分。在一些实施方案中，本发明蛋白质包含与SEQ ID NO:2-38、106-172及301-303中的任一者至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一的 BC、DE 及 FG 环氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明蛋白质包含与如上文所述表3中所示的BC、DE及FG环的阴影部分中的任一者至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一的 BC、DE 及 FG 环
氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO: 39-76、173-290及304-309
中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO: 39-76、173-290及304-309中任一者的第3至96位的Fn3结构域氨基酸序列。在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)zX2GGEQ IDNO: 323)的BC环，其中X1为任意氨基酸，Z为6至9的数值，且X2SY或H。在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列PX1X1X1X3I^SEQ IDNO: 324)的DE环，其中X1为任意氨基酸且X3为G或S。

在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325)的 FG 环，其中 X1 为任意氨基酸;X4 为 Y 或 F ；X5 为 Y、F或W;且&系3或A。在某些实施方案中，X4及X5系各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SW(X1)ZX2G(SEQID NO:323)的BC环、具有序列PX1X1X1X3I^SEQ ID NO:324)的DE环及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325)的 FG 环，如本文所定义。在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列SWEPFSRLPGGGE (SEQID NO: 106)的BC环、具有序列PX1X1X1X3I^SEQId NO:324)的DE环、及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ ID NO: 325)的 FG 环，如本文所定义。在一个方面，本公开提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列(X1)zX2GGEQ IDNO:449)的BC环，其中X1为任意氨基酸，Z为6至9的数值，且X2SY或H。在一个方面，本公开提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列PX1X1X1X3I^SEQ IDNO:450)的DE环，其中X1为任意氨基酸，且X3SG或S。在一个方面，本公开提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID N0:451)的 FG 环，其中 X1 为任意氨基酸;X4 为 Y 或 F ；X5 为 Y、F或W;且X6 SS或A。在某些实施方案中，X4及X5为各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。
在一个方面，本发明提供抗PCSK9阿德奈汀，其包含具有序列(X1)ZX2GGEQID NO:449)的BC环、具有序列X1X1X1XjSEQ ID NO:450)的DE环及具有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID N0:451)的 FG 环，如本文所定义。在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀的N末端存在至少一个氨基酸缺失。在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀的C末端存在至少一个氨基酸缺失、插入或取代。在一些实施方案中，将接头添加至PCSK9阿德奈汀的C末端。在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀可与非1QFn3部分(例如人类血清白蛋白(HSA))偶联，如 PCT 公开第 W02009/133208 号及第 W02009/083804 中所述。在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀在AB、⑶及EF环氨基酸序列中可具有突变，如PCT公开第W02009/133208号及第W02009/083804号中所述。在一个方面中，抗PCSK9阿德奈汀进一步包含药动学(PK)部分。在一个实施方案中，PK部分包含聚乙二醇(PEG)。在某些实施方案中，PK部分包含Fe区域。在一些实施方案中，PK包含一或多个结合血清白蛋白的阿德奈汀。例示性抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合蛋白质展示于表I中。例示性结合抗PCSK9-血清白蛋白的阿德奈汀包含SEQ ID N0:618或619。在某些实施方案中，具有PK部分的抗PCSK9阿德奈汀包含如SEQ IDNO: 322中所述的序列。在另一方面中，抗PCSK9阿德奈汀不包含任何PK部分(即，“裸露的”抗PCSK9阿德奈汀)。在某些实施方案中，可以利用可充分达成期望治疗效果的频率施用裸露的抗PCSK9阿德奈汀。在另一实施方案中 ，可使用延长释放制剂(例如，皮下制剂)施用裸露抗PCSK9阿德奈汀。在一些实施方案中，延长释放制剂增加吸收期的长度、或延长该药效学效应、或二者。仅仅为了举例说明，延长释放制剂包含丙二醇/PBS溶液。在一个方面，本申请提供可用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的抗PCSK9阿德奈汀。在一个方面，本发明提供融合多肽，其包含结合血清白蛋白的纤连蛋白III型第
10(10Fn3)结构域及抗PCSK9阿德奈汀，其中所述结合血清白蛋白的1QFn3结构域以ΙμΜ或更低的Kd结合至血清白蛋白(例如，HSA)。在某些实施方案中，结合至血清白蛋白的uiFr^结构域包含与SEQ ID NO:330至少70%同一的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合至血清白蛋白的1QFn3结构域包含具有SEQ ID NO: 331中所述氨基酸序列的BC环、具有SEQ IDNO: 332中所述氨基酸序列的DE环、及具有SEQ ID NO: 333中所述氨基酸序列的FG环。在另一实施方案中，结合至血清白蛋白的kiFM结构域包含以下中的一或多者具有SEQ IDN0:331中所述氨基酸序列的BC环、具有SEQID NO:332中所述氨基酸序列的DE环及具有SEQ ID NO: 333中所述氨基酸序列的FG环。在一个实施方案中，融合多肽的结合血清白蛋白的uiFr^结构域亦结合至以下中的一或多者称猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)或鼠血清白蛋白(MuSA)。在其他实施方案中，结合至血清白蛋白的kiFM结构域不与RhSA、CySA或MuSA中的一或多者交叉反应。在某些实施方案中，融合多肽的结合血清白蛋白的uiFr^结构域以I μ M或更低的Kd结合至HSA。在一些实施方案中，结合血清白蛋白的wFM结构域以500nM或更低的Kd结合至HSA。在其他实施方案中，结合血清白蛋白的1QFn3结构域以至少200nM、100nM、50nM、20nM、IOnM 或 5nM 的 Kd 结合至 HSA。在其他实施方案中，融合多肽的结合血清白蛋白的uiFr^结构域结合至HSA的结构域I或II。在一个实施方案中，结合血清白蛋白的uiFr^结构域结合至HSA的结构域I与
II二者。在一些实施方案中，结合血清白蛋白的kiFM结构域在5. 5至7. 4的pH范围结合至HSA。在其他实施方案中，结合血清白蛋白的1QFn3结构域在pH5. 5以200nM或更低的Kd结合至HSA。在另一实施方案中，结合血清白蛋白的wFM结构域在5. 5至7. 4的pH范围以至少 500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、10nM*5nM 的 Kd 结合至 HSA。在一个实施方案中，结合血清白蛋白的1QFn3结构域在pH5. 5以至少500nM、200nM、100nM、50nM、20nM、IOnM或5nM的Kd结合至HSA。在一些实施方案中，融合多肽在血清白蛋白存在下的血清半衰期为融合多肽在血清白蛋白不存在下的血清半衰期的至少5倍。在某些实施方案中，融合多肽在血清白蛋白存在下的血清半衰期为融合多肽在血清白蛋白不存在下的血清半衰期的至少2倍、5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍或30倍。在一些实施方案中，血清白蛋白是HSA、RhSA、CySA 或 MuSA 中的任一者。在某些实施方案中，在血清白蛋白存在下融合多肽的血清半衰期为至少20小时。在某些实施方案中，在血清白蛋·白存在下融合多肽的血清半衰期系至少10小时、12小时、15小时、20小时、25小时、30小时、40小时、50小时、75小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、150小时、170小时或200小时。在一些实施方案中，融合多肽的半衰期是在灵长类动物(例如，人类或猴)或小鼠中观察到的。在上述的任一方面及实施方案中，结合血清白蛋白的呷113结构域包含选自SEQID NO:334、338、342、346 及 348-370 的序列。


图1展示例示性抗PCSK9阿德奈汀氨基酸序列的比对。BC、DE及FG环氨基酸序列分别通过下划线、斜体/下划线或粗体/下划线来标识。图2是描绘PCSK9 :表皮生长因子前体同源结构域(EGFA结构域)荧光共振能量转移(FRET)测定的示意图，使用该测定来测量抑制PCSK9:LDLR的PCSK9阿德奈汀的效能，如实施例2中所述。图3展示自FRET测定生成的曲线，使用该测定来测量PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04 及 1923B02(小图 A)及克隆 1459D05、2012A04、2011H05及2013E01 (小图B)对人PCSK9:EGFA的抑制，如实施例2中所述。图4展示自FRET测定生成的曲线，使用该测定来测量PCSK9阿德奈汀克隆1459D05、1784F03、1813E02、1922G04 及 1923B02(小图 A)及克隆 2011H05.2012A04 及2013E01 (小图B)对人类PCSK9:ATI000972相互作用的抑制，如实施例2中所述。图5 展示 PCSK9 阿德奈汀克隆 1459D05、1784R)3、1813E02、1922G04 及 1923B02 (小图A)及克隆2011H05、2012A04及2013E01 (小图B)在直接结合人PCSK9FRET测定中的活性，如实施例2中所述。
图6展示通过Di1-LDL摄取法测定的H印G2细胞中对PCSK9活性的抑制，如实施例2中所述。图7 展示 PCSK9 阿德奈汀克隆 1459D05、1784F03、2012A04 及 2011H05(小图 A)及克隆ID2011H05.2012A04及2013E01 (小图B)对由PCSK9诱导的H印G2细胞表面LDLR消耗的抑制，如实施例2中所述。1784F03、2012A04、2011H05及2013E01的EC50 (nM)分别为 15. 98,7. 78,8. 85 及 12. 41 ；75nM 的 PCSK9 阿德奈汀克隆 1459D05、1784F03、2012A04、2011H05 及 2013E01 对 PCSK9 抑制的百分比分别为 66. 8,150. 2,190. 1,177. 4 及 152. 2。图8展示在过表达hPCSK9的转基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI000959 (IOOmg/kg)对血浆胆固醇(小图A)及血浆未结合hPCSK9(小图B)的体内效应，如实施例3中所述。ATI000959 含有 40kDa 的带支链 N0FPEG。图9展示在过表达hPCSK9的转基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATI001114(10或60mg/kg)对血浆胆固醇水平(小图A)及血浆未结合hPCSK9水平(小图B)的体内效应，如实施例3中所述。图10展示在正常表达者hPCSK9转基因小鼠中，以5mg/kg经腹膜内(1. p.)单剂量施用的PCSK9阿德奈汀ATI000959 (小图A)或ATIOOl 114 (小图B)对未结合血浆hPCSK9的体内效应(平均值+/-SD)，如实施例3中所述。图11展示在正常表达者hPCSK9转基因小鼠中，PCSK9阿德奈汀ATIOOl114对未结合hPCSK9的剂量依赖性效应，如实施例3中所述。图12展示在食蟹猴中，单剂量PCSK9阿德奈汀ATI001114 (5mg/kg，经静脉内)对LDL-C降低的效应(平均值+/-SEM，n=3)，如实施例3中所述。图13. PCSK9阿德奈 汀结合hPCSK9的亲和力及化学计量的ITC测定。PCSK9阿德奈汀以1:1化学计量结合诎051(9。左图展示PCSK9阿德奈汀ATI001081的数据。左图展示PCSK9阿德奈汀ATIOOl 174的数据。图 14. PCSK9 阿德奈汀对 PCSK9:EGFA FRET 测定(左图)及 PCSK9:AT1-972FRET测定(右图)的抑制。图15.抗PCSK9阿德奈汀对由PCSK9诱导的!fepG2细胞表面LDLR消耗的抑制。图16.在H印G2细胞中对PCSK9-AF647细胞进入的抑制。图17.经PRD460处理(经腹膜内给予)的转基因小鼠中血浆未结合hPCSK9的水平。图18.在食蟹猴中，PRD460 (15mg/kg,经静脉内)对LDL-C及游离PCSK9的效应(平均值 +/-SEM，n=3)。图19.在食蟹猴中，AT1-1081 (亦称作ATI001081)对未结合PCSK9水平的效应。图20.在食蟹猴中，AT1-1081对LDL-C水平的效应。图21.存于PBS媒介中的AT1-1081在转基因小鼠中的效应。该图说明了转基因小鼠中未结合血浆hPCSK9的水平。图22.在PG媒介中经皮下给予的AT1-1081在转基因小鼠中的效应。该图说明了转基因小鼠中未结合hPCSK9的水平。图23.小鼠中的体内HSA半衰期。以20mg/kg (小图A)或50mg/kg (小图B)将HSA注射至裸小鼠中。
图 24. SABA1.1 (小图 A)、SABA2.1 (小图 B)、SABA3.1 (图 C)及 SABA4.1 (图 D)在
小鼠中的半衰期测定。图25.展示SABA1-4在与HSA共注射时在小鼠中的半衰期延长的总结的线图。图26. SABA1.1 (小图A)及SABA5.1 (小图B)在食蟹猴中的半衰期测定。图27.通过直接结合ELISA测定测得的SABA1. 2与人、小鼠及大鼠的白蛋白的结
合图28. SABA1.1与HSA的化学计量的测定。SABA1.1与HSA以1:1的化学计量结
合图29. SABA1. 2对HSA的重组结构域片段的结合的Biacore货分析。图30.以Impk及IOmpk给予的SABA1. 2在食蟹猴中的药动学概貌。图31.经静脉内或皮下以Impk给予的SABA1. 2在猴中的药动学概貌。发明详述定义“多肽”意指任何两个或更多个氨基酸的序列，无论其长度、翻译后修饰或功能。在本文中，”多肽”、”肽”与”蛋白质”可互换使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如阐述于美国专利第6，559，126号中者，该专利以引用方式并入本文中。多肽亦可以多种标准化学方式中的任一者来修饰(例如，氨基酸可用保护基团修饰；羧基末端氨基酸可变成末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰以(例如)增强亲脂性；或多肽可经化学糖基化或以其他方式修饰以增加稳定性或体内半衰期)。多肽的修饰可包括另一结构(例如环状化合物或其他分子)与多肽的附接，亦可包括含有一或多个构型改变(即，R或S ;或L或D)的氨基酸的多肽。本发明的肽为源自纤连蛋白的第10III型结构域的蛋白质，它们已经过修饰而特异性结合至PCSK9，并且在本文中被称作”抗PCSK9阿德奈汀”或”PCSK9阿德奈汀”。术语”PK”是”药动学”的缩写，且涵盖化合物的包括(例如)被受试者吸收、分布、代谢及消除的性质。” PK调节蛋白质”或” PK部分”指任何当与生物活性分子融合或一起施用时影响生物活性分子的药动学性质的蛋白质、肽或部分。PK调节蛋白质或PK部分的实例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合物(如美国专利申请公开第2005/0287153号及第2007/0003549号、PCT专利申请公开第W02009/083804号及第W02009/133208号中所公开的、及如本文中所述的SABA分子)、人血清白蛋白、Fe或Fe片段及其变体、及糖(例如，唾液酸)。本文中的”氨基酸 序列百分比同一性(%) ”定义为在比对各序列及(若需要)引入缺口以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分的条件下，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以通过本领域现有技术之内的多种方式来达成，例如，使用可公开获得的电脑软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNAStar)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较序列全长范围内达到最大比对所需要的任何算法。“分离”的多肽是已经被鉴定并与其天然环境的成分分离和/或从其天然环境的成分回收的多肽。其天然环境的污染性成分是会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素及其他蛋白质性溶质或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，可将多肽纯化至(I)含有95重量％以上的多肽，且最优选含有99重量％以上的多肽，如通过Lowry方法测定的；(2)可通过使用旋杯式序列分析仪至少获得N末端或内部氨基酸序列残基的程度；或(3)均一，如通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色所测量的。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为至少有一种多肽天然环境的成分不会存在。不过，通常来说，分离的多肽会通过至少一个纯化步骤来制备。符号”mpk”、”mg/kg”或”mg/kg”指毫克每千克。所有符号在本公开通篇中可互换使用。氨基酸序列或化合物的”半衰期”通常可定义为在活体内多肽血清浓度降低50%(例如由于天然机制而导致的序列或化合物的降解及/或序列或化合物的清除或螯合)所耗费的时间。半衰期可以本身已知的任意方式(例如藉由药动学分析)来确定。本领域技术人员容易想到适宜的技术，适宜的技术通常可涉及例如以下步骤向灵长类动物适宜地施用适宜剂量的本发明的氨基酸序列或化合物；以规律的间隔收集来自该灵长类动物的血样或其他试样；测定本发明的氨基酸序列或化合物在该血样中的水平或浓度；并根据由此获得的数据(的作图)计算到本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度相对于给予时的初始水平降低50%为止所经过的时间。可参照例如标准手册，例如Kenneth，A等人Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996)。亦可参照 Gibaldi, M.等人，Pharmacokinetics,第 2 修订版，MarcelDekker (1982)。半衰期可使用诸如t1/2_a、 1/2-β、HL_A_z及曲线下面积(AUC)等参数来表示。在本说明书中，”半衰期的增加”系指这些参数中的任一个、这些参数中的任两个、这些参数中的任三个或这些参数中的所有四个的增加。”半衰期的延长”尤其系指t1/2_i3及/或HL_λ_ζ的增加，同时有或无t1/2_a及/或AUC或二者的增加。概述本申请提供 针对人类PCSK9的阿德奈汀。为了鉴定PCSK9特异性的拮抗剂，将PCSK9提交至大型阿德奈汀合成文库。对结合至PCSK9的阿德奈汀筛选PCSK9结合、生物物理学性质及PCSK9抑制活性。将抗PCSK9阿德奈汀突变，并通过降低靶物浓度将它们置于进一步选择压力下，选择具有缓慢解离速率(off-rate)的抗PCSK9阿德奈汀。通过此优化过程，将一个阿德奈汀家族鉴定为具有有利的生物化学及生物物理学性质的PCSK9特异性抑制剂。基于纤连蛋白的支架本申请的一个方面提供包含Fn3结构域的多肽，其中一或多个溶剂可及环已被随机化或突变。在一些实施方案中，Fn3结构域源自人纤连蛋白III型结构域C°Fn3)的野生型第 10 模块的 Fn3 结构域VSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO:1) 在 lclFn3 序列中，BC、DE 及FG环带下划线。如本文所述，可改变kiFM的非配体结合序列，即“％113支架”，前提为kiFM保持配体结合功能及/或结构稳定性。已报导多种突变型kiFM支架。在一个方面中，Asp7、Glu9及Asp23中的一或多者被替换成另一氨基酸(例如非带负电荷的氨基酸残基(例如，Asn,Lys等))。已报导与野生型形式相比，这些突变在中性pH下具有促进突变kiFM的更大稳定性的效应(参见，PCT专利申请公开第W002/04523号)。以公开了多种其他的uiFr^支架中有益的或中性的改变。例如，参见Batori等人，Protein Eng. 15 (12) : 1015-1020 (2002年 12 月)；Koide 等人，Biochemistry40 (34) : 10326-10333 (2001 年 8 月 28 日)。10Fn3蛋白质的变体与野生型二者都具有相同的结构特征，即命名为A至G的7个β链结构域序列及连结该7个β链结构域序列的6个环区(AB环、BC环、⑶环、DE环、EF环及FG环)。位于最靠近N-及C末端处的β链在溶液中可采取β样构象。在SEQ IDNO:1中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基60-66，且FG环对应于残基76-87 (Xu等人，Chemistry&Biology9:933-942(2002))ο在一些实施方案中，1QFn3多肽可与展示于SEQ ID NO:1中的人1QFn3结构域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一。大部分变化通常会发生在一或多个这些环中。uiFr^多肽的每一个β或β样链均可基本上由与SEQ ID NO:1的相应β或β样链的序列至少80%、85%、90%、95%或100%同一的氨基酸序列组成，前提为此变化不会破坏多肽在生理条件下的稳定性。在一些实施方案中，本公开提供包含纤连蛋白III型第10C°Fn3)结构域的多肽，其中该uiFr^结构域包含环AB ;环BC ;环CD ;环DE ;环EF ;及环FG ;且至少一个选自环BC、DE及FG的环具有相对于人kiFM结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，BC及FG环是经改变的，且在一些实施方案中，BC、DE及FG环是经改变的，S卩，Fn3结构域包含非天然存在的环。在一些实施方案中，AB、⑶及/或EF环是经改变的。”经改变的”意指相对于模板序列(相应人类纤连蛋白结构域)的一处或多处氨基酸序列改变，包括氨基酸添加、缺失及取代。氨基酸序列的改变可以通过有意的、盲目的或自发的序列变化，通常是核酸编码序列的序列变化来达成，并且可以通过任何技术(例如PCR、易错PCR或化学DNA合成)来进行。

在一些实施方案中，选自BC、DE及FG的一或多个环的长度可相对于相应人类纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，环的长度可延长2至25个氨基酸。在一些实施方案中，环的长度可减少I至11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，可改变kiFM环的长度以及序列以获得最大可能的抗原结合灵活性及亲和力。在一些实施方案中，多肽包含Fn3结构域，所述结构域包含与SEQ IDN0:1的非环区至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一的氨基酸序列，其中选自BC、DE及FG的至少一个环是经改变的。在一些实施方案中，经改变的BC环具有最多10个氨基酸取代、最多4个氨基酸缺失、最多10个氨基酸插入，或其组合。在一些实施方案中，经改变的DE环具有最多6个氨基酸取代、最多4个氨基酸缺失、最多13个氨基酸插入，或其组合。在一些实施方案中，FG环具有最多12个氨基酸取代、最多11个氨基酸缺失、最多25个氨基酸插入，或其组合。如上文所述，对应于SEQ ID NO:1的残基21_30、51_56及76-87的氨基酸残基分别界定BC、DE及FG环。然而，应了解，为了实现对期望的靶物(例如，PCSK9)具有强亲和力的kiFM结合物，并非环区域内的每一个残基都需要进行修饰。举例而言，如SEQ ID NO:1中所示的BC环的残基21⑶及22 (W)无需为了结合PCSK9而进行修饰。亦即，以高亲和力结合PCSK9的1QFn3结构域可通过仅修饰如SEQ IDNO:1所示的环BC的残基23-30来获得。这一点显示于表3中例示的BC环中，其表明仅有跨越阴影位置的残基被改变。因此，在一些实施方案中，根据该指定的BC环包含表3中所示的SEQ ID N0:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，BC 环可包含序列 PPPSHGYG(SEQ ID NO: 2 的残基 3_10)、DAPAHAYG (SEQ ID NO:5 的残基 3-10)、EPFSRLPGGGE(SEQ ID NO: 106 的残基 3-13)或 DAPADGGYG (SEQ ID N0:107 的残基3-11)。同样，如SEQ ID NO:1中所示的环DE的位置51 (P)及56⑴无需进行修饰以结合PCSK9。亦即，以高亲和力结合PCSK9的1QFn3结构域可通过仅修饰如SEQ ID NO:1所示的环DE的残基52-55来获得。这一点显示于表3中例示的DE环中，其显示仅有跨越阴影位置的残基被改变。因此，在一些实施方案中，根据该指定的DE环包含如表3中所示的SEQID NO: 18-27及136-141中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，DE环可包含序列 PGKG(SEQ ID NO: 18 的残基 2-5)、VGVG(SEQ ID N0:27 的残基 2-5)或 VSKS(SEQ IDNO: 137 的残基 2-5)。同样，如SEQ ID NO:1中所示的FG环的位置87⑵无需为了结合PCSK9而进行修饰。亦即，以高亲和力结合PCSK9的1QFn3结构域可通过仅修饰如SEQ ID NO:1所示的环FG的残基76-86来获得。这一点显示于表3中例示的FG环中，其指示仅有跨越阴影位置的残基被改变。因此，在一些实施方案中，根据该指定的FG环包含如表3中所示的SEQ IDNO: 28-38及142-172中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，FG环可包含序列 EYPYKHSGYYHR(SEQ ID N0:28 中的残基 1-12)、EYPYDYSGYYHR(SEQ ID NO: 142 中的残基
1-12)或 EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO: 167 中的残基 1-12)。在一些实施方案中，本申请揭示，BC、DE及FG环区域可以根据共有序列来概括性地描述。举例而言，BC环可由共有序列SW(X1) ZX2G (SEQ IDNO: 323)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸，Z系6至9的数值 ，且X2SY或H。表3中所示的BC环，除由SEQ ID NO: 106所界定BC环以外，是此共有序列的实例。在其他实施方案中，Z为选自2至5的数值。在某些实施方案中，Z为选自10至15的数值。在一些实施方案中，X2为任意芳香族残基(即，Y、F、W 或 H)。在另一实施方案中，DE环可由共有序列PX1X1X1X3I^SEQ ID NO: 324)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸，且X3为G或S。表3中所示的DE环是此共有序列的实例。在另一实施方案中，FG环可由共有序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQID NO: 325)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F ;X5为Y、F或W ;且X6为S或A。在某些实施方案中，X4及X5为各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。表3中所示的FG环是此共有序列的实例。。因此，在某些实施方案中，本公开提供结合PCSK9的阿德奈汀，其包含具有序列Sff (X1) ZX2G(SEQ ID NO: 323)的 BC 环、具有序列 PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324)的 DE 环、及具有序列 EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ IDNO: 325)的 FG 环，如上文所定义。在另一实施方案中，本发明提供结合PCSK9的阿德奈汀，其包含具有序列SWEPFSRLPGGGE (SEQ ID NO: 106)的 BC 环、具有序列 PX1X1X1X3T (SEQ ID NO: 324)的 DE 环及具有序列 EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP (SEQ IDNO: 325)的 FG 环，如上文所定义。
在某些实施方案中，BC环可由共有序列(X1)zX2GGEQ ID NO:449)来概括性地定义，其中X1S任意氨基酸，Z为6至9的数值，且X2SY或H。表3中所示的BC环，除由SEQID NO: 106所界定的BC环以外，是此共有序列的实例。在其他实施方案中，Z为选自2至5的数值。在某些实施方案中，Z为选自10至15的数值。在一些实施方案中，X2为任何芳香族残基(即，Y、F、W或H)。在某些实施方案中，DE环可由共有序列X1X1X1XJSEQ ID NO:450)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸且X3为G或S。此共有序列由表3中所示的DE环来展示。在某些实施方案中，FG环可由共有序列Ex4X1X5X1X1X6Gyx4HiUSEQID NO:451)来概括性地定义，其中X1为任意氨基酸；X4为Y或F ;X5为Y、F或W ;且X6为S或A。在一些实施方案中，X4及X5为各自独立选自Y、F、W或H的芳香族残基。此共有序列由表3中所示的FG环来展示。因此，在一个实施方案中，本公开提供结合PCSK9的阿德奈汀，其具有包含序列(X1) ZX2G的BC环、包含序列X1X1X1X3的DE环、及包含序列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR的FG环，如上文所定义。在某些实施方案中，以基于kiFM支架的抗体样蛋白质可由以下序列来概括性地定义EVVAAT (X) aSLLI (X) JYRITYGE (X) bQEFTV (X) yATI (X) CDYTITVYAV (X) JSINYRT (SEQID NO:328)。·在SEQ ID NO: 328中，AB环由Xa表示，CD环由Xb表示，EF环由X。表示，BC环由Xx表示，DE环由Xy表示,且FG环由Xz表示。X表示任意氨基酸,且X后的下标表示氨基酸数目的整数。具体而言，a 可为 1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2个氨基酸的范围内的任意值；且b、C、X、y及z可各自独立为2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7 或 6-7 个氨基酸的范围内的任意值。在优选的实施方案中，a为2个氨基酸，b为7个氨基酸，c为7个氨基酸，X为9个氨基酸，y为6个氨基酸，且z为12个氨基酸。β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ IDNO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个取代、缺失或添加0至10个、O至8个、O至6个、O至5个、O至4个、O至3个、O至2个或O至I个。在例示性实施方案中，β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个保守取代0至10个、O至8个、O至6个、O至5个、O至4个、O至3个、O至2个或O至I个。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸残基以外的残基处发生。在例示性实施方案中，分别由(X)x、(X)y、及(X)z表示的Be、DE及FG环被用多肽替代，所述多肽包含来自表3中所示的任意PCSK9结合物的BC、DE及FG环序列，或其阴影部分，或共有序列323-325或449-451。在某些实施方案中，基于kiFM支架的抗体样蛋白质可由以下序列来概括性地定乂 EVVAATPTSLLI (X) JYRITYGETGGNSPVQEFTV (X) yATISGLKPGVDYTITVYAV (X)JSINYRT(SEQ ID NO:329)在SEQ ID NO: 329中，BC环由Xx表示，DE环由Xy表示，且FG环由Xz表示。X表示任意氨基酸，且X后的下标表示氨基酸数目的整数。具体而言，X、y及Z可各自独立为2-20、
2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7 或 6-7 个氨基酸的范围内的任何值。在优选的实施方案中，X为9个氨基酸，y为6个氨基酸，且z为12个氨基酸。β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个取代、缺失或添加0至10个、O至8、0至6个、O至5个、O至4个、O至3个、O至2个或O至I个。在例示性实施方案中，β链的序列在所有7个支架区域中相对于SEQ ID NO:1中所展示的相应氨基酸可具有以下范围中的任意个保守取代0至10个、O至8个、O至6个、O至5个、O至4个、O至3个、O至2个或O至I个。在某些实施方案中，核心氨基酸残基是固定的，任何取代、保守取代、缺失或添加均在核心氨基酸残基以外的残基处发生。在例示性实施方案中，分别由(X)x、(X)y、及(X)z表示的BC、DE及FG环被多肽替代，所述多肽包含来自表3中所示的任意PCSK9结合物的BC、DE及FG环序列，或其阴影部分，或共有序列323-325或449-451。在某些实施方案中，本文所述抗PCSK9阿德奈汀可包含如SEQ ID Ν0:328或329中所述的序列，其中分别由》x、(X)y& (幻2所表示的BC、DE及FG环被替代为来自表3中任意克隆的指定BC、DE及FG环的相应集合或与表3中所列出的克隆的BC、DE或FG环序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一的序列。在例示性实施方案中，本文所述抗PCSK9阿德奈汀由SEQ ID NO: 329来定义，且具有来自表3中所列出的任意克隆的BC、DE及FG环序列的相应集合。举例而言，表3中的克隆1459D05包含分别如SEQ ID N0:2、18及28所述的BC、DE及FG环。因此，基于这些环的抗PCSK9阿德奈汀可包含SEQ ID NO: 328或 329，其中(X)x 包含 SEQ ID NO: 2, (X)y 包含 SEQ ID NO: 18，且(X)z 包含 SEQ ID NO: 28。涵盖利用表3中其他克隆的BC、DE及FG环的集合、或共有序列323-325或449-451的相似构建体。此类抗PCSK9阿德奈汀的支架区域可相对于SEQID NO:1的支架氨基酸残基包含下列范围中的任意个取代、保守取代、缺失或添加0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或O至I。只要抗PCSK9阿德奈汀能够以期望KD结合PCSK9即可作出这些支架修饰。在一些实施方 案中，本发明蛋白质的BC环包含选自下组的氨基酸序列SffPPPSHGYG (SEQ ID NO: 2)、SWRPPIHAYG (SEQ ID NO: 3)、SWDAPIHAYG (SEQ ID NO:4)、SffDAPAHAYG(SEQ ID NO:5)及 SWDAPAVTYG(SEQ ID NO:6)、SWSPPANGYG(SEQ ID NO:7)、SffTPPPKGYG(SEQ ID NO:8)、SWRPPSHAYG(SEQ ID N0:9), SffDPPSHAYG(SEQ ID NO: 10)、SffEPPSHAYG(SEQ ID NO: 11), SffSPPSHAYG(SEQ ID NO: 12), SffRPPSNGHG(SEQ ID NO: 13)、SffVPPSDDYG(SEQ ID NO:14), SffVPSSHAYG(SEQ ID NO:15),SffDPSSHAYG(SEQ ID NO:16)、及SffEPSSHAYG(SEQ ID N0:17)。在其他实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自SEQ IDNO: 106-135及301-303的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含如表3中所示的SEQ ID N0:2-17、106-135及301-303中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，BC 环包含序列 PPPSHGYG(SEQ ID NO: 2 的残基 3_10)、DAPAHAYG (SEQ ID NO: 5的残基 3-10)、EPFSRLPGGGE (SEQID NO: 106 的残基 3-13)或 DAPADGGYG (SEQ ID NO: 107 的残基3_11)。在一些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自下组的氨基酸序列PPGKGT (SEQ ID NO: 18)、PIVEGT (SEQ ID NO: 19)、PGSEGT (SEQ IDNO: 20)、PGSKGT (SEQID NO: 21)、PGSKST (SEQ ID NO: 22)、PVGRGT (SEQID NO: 23)、PVGEGT (SEQ ID NO: 24)、PIGKGT(SEQ ID NO:25)、PVNEGT(SEQ ID NO:26)、及 PVGVGT(SEQ ID NO:27) 在其他实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自SEQ ID NO: 136-141的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含如表3中所示的SEQ ID NO: 18-27及136-141中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，DE环包含序列PGKG(SEQ ID NO: 18的残基2_5)、VGVG(SEQ ID N0:27 的残基 2-5)或 VSKS(SEQ ID NO: 137 的残基 2-5)。在一些实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自下组的氨基酸序列EYPYKHSGYYHRP (SEQ ID NO: 28)、EYTFKHSGYYHRP (SEQ ID NO: 29)、EYTYKGSGYYHRP (SEQID NO:30), EYTYNGAGYYHRP (SEQ ID NO:31)、EYTYIGAGYYHRP (SEQ ID NO:32)、EYTYEGAGYYHRP (SEQ ID NO: 33)、EYAYNGAGYYHRP (SEQ ID NO: 34), EYPffKGSGYYHRP (SEQIDNO:35), EFPFKffSGYYHRP (SEQ ID NO:36), EFPffPHAGYYHRP(SEQ IDN0:37)及EYAFEGAGYYHRP(SEQ ID N0:38)。在其他实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自SEQID NO: 142-172的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含如表3中所示的SEQ ID N0:28-38及142-172中任一者的阴影部分。举例而言，在一个实施方案中，FG环包含序列 EYPYKHSGYYHR(SEQ ID NO: 28 中的残基 1-12)、EYPYDYSGYYHR (SEQ ID NO: 142中的残基 1-12)或 EFDFVGAGYYHR(SEQ ID NO: 167 的残基 1-12)。在一些实施方案中，本发明蛋白质包含一个BC环序列，其选自具有SEQIDNO: 2-17、106-135 及 301-303、或如表 3 中所展示的 SEQ ID NO: 2-17、106-135 及 301-303 中任一者的阴影部分的BC环序列；一个DE环序列，其选自具有SEQ ID NO: 18-27及136-141、或如表3中所展示的SEQ IDN0:18-27及136-141中任一者的阴影部分的DE环序列；及一个FG环序列，其选自SEQ ID NO: 28-38及142-172、或具有如表3中所展示的SEQ ID NO: 28-38及142-172中任一者的阴影部分的FG环序列。在一些实施方案中，本发明蛋白质包含与SEQ ID 勵2-38、106-172、301-303中的任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一的BC、DE及FG环氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明的蛋白质包含与如表3中所示的 SEQ ID NO:2-38,106-172,301-303 中任一者的阴影部分至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100% 同一的BC、DE及FG环氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO: 39-76、173-290及304-309中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含SEQ ID NO:39-76,173-290及304-309中任一者的位置3_96的Fn3结构域氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含与SEQ IDN0:39-76、173-290及304-309中的任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一的氨基酸序列。纤连蛋白天然地经由其整联蛋白结合基序”精氨酸-甘氨酸 天冬氨酸”(RGD)结合某些类型的整联蛋白。在一些实施方案中，多肽包含缺乏(RGD)整联蛋白结合基序的10Fn3结构域。可通过氨基酸取代、缺失或插入改变RGD序列来去除整联蛋白结合结构域。在某些实施方案中，本发明的抗PCSK9阿德奈汀分子可经修饰以包含N末端延伸序列及/或C末端延伸。举例而言，MG序列可位于由SEQ ID NO:1所界定kiFM的N末端处。通常M将被切除，在N末端处留下G。或者，可用如表6中所展示的备选N末端序列(在本文中称作N末端延伸)(即，SEQID NO: 371-379)来替代表4中所示的抗PCSK9阿德奈汀的前10个氨基酸。另外，M、G或MG亦可位于任何具有SEQ ID NO: 371-379的N末端延伸的N末端侧。本文所述抗PCSK9阿德奈汀亦可包含备选C末端尾序列(在本文中称作C末端延伸序列)。举例而言，表4中所展示的抗PCSK9阿德奈汀序列可在对应于SEQ ID NO:1的T94的苏氨酸处截短(S卩，在该序列的INYRT部分之后截短)。可使用此截短形式作为呈截短形式的治疗分子，或可在苏氨酸残基后添加备选的C末端延伸。例示性C末端延伸序列作为SEQID NO: 380-395展示于表6中。包含C末端延伸序列的例示性抗PCSK9阿德奈汀展示于表4中。举例而言，SEQ ID N0:49(克隆1813E02)依次包含天然存在的C末端延伸EIDKPSQ(SEQ ID NO:380)及His6标签。然而，应了解，His6标签完全是可选的。在某些实施方案中，C末端延伸序列(亦称为”尾”)包含E及D残基，且长度可为介于8个与50个氨基酸之间、10个与30个氨基酸之间、10个与20个氨基酸之间、5个与10个氨基酸之间、及2个与4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾序列包括基于ED的接头，其中该序列包含ED的串联重复。在例示性实施方案中，尾序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、
3-7、3-5、3、4或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾序列亦可包括额外氨基酸残基，例如E1、EID、ES、EC、EGS及EGC。这些序列部分基于已知的阿德奈汀 尾序列，例如EIDKPSQ(SEQ ID NO: 380)，其中残基D及K已被去除。在例示性实施方案中，基于ED的尾在ED重复前包含E、I或EI残基。在其他实施方案中，当设计抗PCSK9阿德奈汀融合分子时，N或C末端序列可视需要与其他已知接头序列(例如，表6中的SEQ ID NO:396-419)组合。包含接头序列的例示性抗PCSK9阿德奈汀展示于表4中(例如，SEQ IDN0:53、55及57)。在一些实施方案中，可在kiFM结构域的C末端处放置序列以便于药动学部分的附接。举例而言，可将诸如GSGC(SEQ ID NO: 77)等含有半胱氨酸的接头添加至C末端，以便于对半胱氨酸残基进行定点聚乙二醇化。药动学部分在一个方面中，本 申请提供进一步包含药动学(PK)部分的抗PCSK9阿德奈汀。改善的药动学可根据认识到的治疗需要来评估。通常，增加生物利用度及/或延长剂量间隔时间是理想的，这可能通过增加蛋白质给药后在血清中保持可用的时间来实现。在一些情况下，提高蛋白质血清浓度随时间的连续性(例如，减小刚施用后与即将施用前蛋白质血清浓度的差异)是理想的。可以将抗PCSK9阿德奈汀可附接至这样的部分，该部分将该多肽在哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人类)中的清除率降低至相对于未经修饰的抗PCSK9阿德奈汀小于1/3。改善的药动学的其他量度可包括血清半衰期，血清半衰期通常分为α阶段及β阶段。此两个阶段中的任一个或二者可通过添加合适的部分来显著改善。倾向于延缓蛋白质自血液清除的部分(本文中称为”PK部分”)包括聚氧化烯部分(例如，聚乙二醇、糖(例如唾液酸))及耐受良好的蛋白质部分(例如，Fe及其片段及变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。抗PCSK9阿德奈汀可融合至白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体，如美国专利申请公开第20070048282号中所述。在一些实施方案中，PCSK9阿德奈汀可融合至一或多个如本文所述的结合血清白蛋白的阿德奈汀(serum albumin bindingAdnectin)。在一些实施方案中，PK部分是血清白蛋白结合蛋白(serum albumin bindingprotein)，例如美国专利申请公开第2007/0178082号及第2007/0269422号中记载者。在一些实施方案中，PK部分是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如美国专利申请公开第2007/0178082号中记载者。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀包含聚乙二醇(PEG)。一或多个PEG分子可附接于蛋白质上的不同位置，并且这样的附接可通过与胺、硫醇或其他适宜的反应基团反应来达成。胺部分可以是例如存在于多肽的N末端、或诸如赖氨酸或精氨酸等氨基酸中的胺基团处的一级胺。在一些实施方案中，PEG部分附接于多肽上选自下组的位置a)N末端；b)介于N末端与最靠N末端的β链或β样链之间；c)位于多肽上与祀结合位点对置的面上的环；d)介于C末端与最靠C末端的β链或β样链之间 ’及e)在C末端。聚乙二醇化可通过定点聚乙二醇化来达成，其中将适宜反应基团引入蛋白质中以产生优先发生聚乙二醇化的位点。在一些实施方案中，对蛋白质进行修饰以在期望位置处引入半胱氨酸残基，从而允许对该半胱氨酸进行定点聚乙二醇化。PEG的分子量可大幅度变化，且可具支链或为直链。在一个实施方案中，PEG具有两条支链。在另一实施方案中，PEG具有4条支链。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀融合至免疫球蛋白Fe结构域、或其片段或变体。在例示性实施方案中，Fe结构域源自IgGl亚类，然而，亦可使用其他亚类(例如，IgG2、IgG3及IgG4)。下文所示的是人类IgGl免疫球蛋白Fe结构域的序列，且根据EU编号格式标明了 Fe结构域内每一区域的相对位置ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:315)核心铰链序列加下划线，且CHl区域为斜体；CH2及CH3区域为普通文本。应理解的是，C末端的赖氨酸是可选的。

所述融合物可通过将抗PCSK9阿德奈汀附接至Fe分子的任一端来形成，即，Fe-抗PCSK9阿德奈汀或抗PCSK9-阿德奈汀-Fe排列。在某些实施方案中，Fe与抗PCSK9阿德奈汀经由接头融合。例示性接头序列包括AGGGGSG(SEQ ID NO: 310)、GSGSGSGSGSGS (SEQID NO:311), QPDEPGGS(SEQ ID NO:312)、ELQLEESAAEAQDGELD(SEQ ID N0:313)、TVAAPS(SEQ ID NO:314)、KAGGGGSG(SEQ ID NO:620)、KGSGSGSGSGSGS(SEQ ID N0:621)、KQPDEPGGS (SEQ ID N0:622)、KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 623)、KTVAAPS (SEQ IDNO:624)、KAGGGGSGG(SEQ ID NO:625)、KGSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO:626)、KQPDEPGGSG(SEQID NO: 627)、KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQID NO: 628)、KTVAAPSG (SEQ ID NO: 629)、AGGGGSGG(SEQ ID N0:630)、GSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO:631)、QPDEPGGSG(SEQ ID NO:632),ELQLEESAAEAQDGELDG(SEQ ID NO:633)及 TVAAPSG(SEQ IDNO:634)。在一些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀融合物中所用Fe区域包含Fe分子的铰链区域。本文所用”铰链”区域包含跨越IgGl的SEQ ID N0:315中位置104-119的核心铰链残基(DKTHTCPPCPAPELLG;SEQ ID NO: 316)，其对应于按照EU编号法的位置221-236。在某些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合物采取多聚体结构(例如，二聚体)，此部分地是由于SEQ ID NO: 315在铰链区域内的位置109及112 (EU编号分别为226及229)处具有半胱氨酸残基。在其他实施方案中，本文所用的铰链区域可进一步包括源自位于核心铰链序列两侧的CHl及CH2区域的残基，如SEQ ID NO:315中所示的。在一些实施方案中，铰链序列可包括赋予的期望药动学性质、生物物理学性质及/或生物学性质的取代。一些例示性铰链序列包括EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQID NO: 317 :核心铰链区域带下划线)、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 318;核心铰链区域带下划线)、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 319 ;核心铰链区域带下划线)、DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 320 ;核心铰链区域带下划线)、及DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 321 ;核心铰链区域带下划线)。在一个实施方案中，SEQID NO: 315的位置122 (EU编号238)处的残基P已被S替代以消除Fe效应物功能；具有SEQ ID N0:318、319及321中的任一者的铰链中示例了该替代。在另一实施方案中，SEQ IDNO: 315的位置104-105 (EU编号221-222)处的残基DK已被GS替代以去除潜在的回形针(clip)位点；SEQ ID N0:319中示例了此替代。在另一实施方案中，SEQ ID N0:315的位置103 (EU编号220)处的C已被S替代以防止在不存在轻链时形成不适当的胱氨酸键；SEQ IDNO:317-319中示例了此替代。在某些实施方案中，抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合物可具有以下构型1)抗PCSK9阿德奈汀-铰链-Fe或2)铰链-Fe-抗PCSK9阿德奈汀。因此，任何本发明的抗PCSK9阿德奈汀皆可融合至包含根据这些构型的铰链序列的Fe区域。在一些实施方案中，可使用接头将抗PCSK9阿德奈汀与铰链-Fe部分接合，举例而言，一种例示性融合蛋白质可具有构型铰链-抗PCSK9阿德奈汀-接头-Fe。另外，依赖于产生融合多肽的系统，融合多肽的N末端处可以放置前导序列。举例而言，若在哺乳动物系统中产生融合物，则可将诸如METDTLLLffVLLLffVPGSTG (·SEQ ID NO: 326)等前导序列添加至融合分子的N末端。若在大肠杆菌(E.coli)中产生融合物，则融合序列的前端将为甲硫氨酸。以下序列例示哺乳动物系统中产生的抗PCSK9阿德奈汀-铰链-Fe构建体METDTLLLWVLLLWVPGSTGGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFPffPHAGYYHRPISINYRTEIEPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 322)。此处，Fe 结构域包含如下人类 IgGlCH2 及 CH3 区域VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:448)及 SEQ ID N0:319 的铰链序列。在 SEQ IDN0:322 中，前导序列以粗体表示，抗PCSK9阿德奈汀序列以斜体表示，且铰链区域带下划线。应理解，SEQ IDN0:322末端处的赖氨酸是可选的。如SEQ ID NO:322中所示的多肽融合物(本文中亦称为PRD460)的效力展示于实施例4中。表I中展示了例示性PCSK9阿德奈汀-Fe融合物。所有序列皆可以甲硫氨酸或哺乳动物前导序列(例如，SEQ ID NO:326)起始。表1.例示性抗PCSK9阿德奈汀-Fe融合蛋白质
权利要求
1.一种多肽，其包含纤连蛋白III型第10结构域C°Fn3)，其中该uiFr^的选自环BC、DE及FG的至少一个环具有相对于人wFnS结构域中相应环的序列经改变的氨基酸序列，且其中该多肽结合(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型)PCSK9。
2.权利要求1所述的多肽，其中该多肽以小于500nM的Kd结合PCSK9。
3.权利要求1或2所述的多肽，其中该BC环包含根据式(X1)zX2GGEQID NO:449)的序列，其中X1为任意氨基酸，Z为6-9的数值，且X2为Y或H。
4.权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述BC环包含如表3中所示的SEQIDNO:2-17、107-135及301-303中任一者的阴影部分。
5.权利要求3或4所述的多肽，其中所述BC环选自SEQID NO: 2_17、107-135及301-303。
6.权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述DE环包含根据式X1X1X1XJSEQIDNO:450)的序列，其中X1为任意氨基酸；且&为6或S。
7.权利要求1、2或6中任一项所述的多肽，其中所述DE环包含如表3中所示的SEQIDNO: 18-27及136-141中任一者的阴影部分。
8.权利要求6或7所述的多肽，其中所述DE环选自SEQID NO: 18-27及136-141。
9.权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述FG环包含根据式EX4X1X5X1X1X6GYX4HR(SEQ ID NO:451)的序列，其中 X1 为任意氨基酸;X4 为 Y 或 F ；X5 为 Y、F或W ;且X6为S或A。
10.权利要求1、2或9中任一项所述的多肽，其中所述FG环包含如表3中所示的SEQID NO:28-38及142-172中任一者的阴影部分。
11.权利要求9或10所述的多肽，其中所述FG环选自SEQID NO: 28-38及142-172。
12.权利要求1、2、3、6或9中任一项所述的多肽，其中所述BC、DE或FG环氨基酸序列与 SEQ ID NO:2-38、106-172 及 301-303 中任一者至少 80% 同一。
13.权利要求1-12中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与SEQID NO:39-76,173-290及304-309中任一者至少80%同一的氨基酸序列。
14.权利要求1-10中任一项所述的多肽，其进一步包含一个或多个选自下组的药动学(PK)部分聚乙二醇、唾液酸、Fe、Fe片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白、及血清免疫球蛋白结合蛋白。
15.权利要求14所述的多肽，其中所述血清白蛋白结合蛋白包含纤连蛋白III型第10结构域C°Fn3)。
16.权利要求15所述的多肽，其中所述uiFr^结构域结合HSA。
17.权利要求14所述的多肽，其中所述PK部分是聚乙二醇。
18.—种可药用的组合物，其包含权利要求1-17中任一项所述的多肽，其中该组合物基本上不含内毒素。
全文摘要
本发明涉及结合PCSK9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质。本发明还涉及新蛋白质在治疗应用中用于治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症及其他胆固醇相关疾病的用途。本发明进一步涉及包含这些蛋白质、编码这些蛋白质或其片段的多核苷酸的细胞，且涉及包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。
文档编号C07K14/78GK103068843SQ201180029216
公开日2013年4月24日 申请日期2011年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者R.坎普豪森, S.T.克洛德, J.H.戴维斯, F.M.丹赫兹, A.赛埃德-科西, D.利波夫塞克, 罗志鸣, T.S.米切尔, G.C.雷克斯特劳, K.A.拉索, 罗景雄, B.米奥, R.A.帕克, D.F.西特科夫 申请人:百时美施贵宝公司