专利名称：凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种临床实验室用体外诊断试剂盒及其制备，它用于人血浆标本凝血酶原时间的测定。更具体地说它是一种采用兔脑组织因子和重组人组织因子联合制备凝血酶原时间测定试剂盒及其其制备方法。
背景技术：
医院临床实验室常规凝血实验，即凝血常规四项包括凝血酶原时间测定(PT)、部分活化凝血活酶时间测定(APTT)、凝血酶时间测定(TT)、纤维蛋白原浓度测定(FIB)，主要用于出血性疾病的筛查与诊断、血栓性疾病与血栓前状态检查、各种抗凝治疗监测以及手术前检查。其中，PT为反应机体外源性凝血途径的主要检测指标，常用于1血液凝固异常可疑包括凝血酶原复合物多个因子(II、VII、X)，因子V，纤维蛋白原及去纤维蛋白原血症的筛选实验；2监测及调整维生素K拮抗剂，香豆素诱导剂的治疗；3监测维生素K缺乏及肝脏疾病；4术前筛选可能的止血异常疾病。目前PT的临床检测多采用Quick法，其原理为在缺乏血小板的血浆内加入组织促凝血酶原激酶(组织因子)和Ca2+后凝血酶原转变为凝血酶，通过产生的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT测定结果报告方式有三种 秒值、根据标准曲线计算的百分活度，国际标准化比率(international normalized ratio INR)。PT测定结果受众多因素的影响，其中凝血酶原试剂为最重要的影响因素。商品化的组织因子在敏感性上与WHO推荐的有所不同，因此生产商需要对每批试剂确定一个敏感因子，此即国际敏感指数ISI(international sensitivity index),它用来表示试剂中组织凝血活酶相对活性的指数。不同来源的组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同，为了使不同敏感性的组织凝血活酶在PT检测中得到同样的结果，必须要制定一个共同遵循的敏感指标。WHO先后制备或发出了凝血活酶的多种国际参考品(IRP)，用已知ISI值的国际参考试剂与待测组织活酶试剂检测同一标本，对结果进行比较分析，就可得出试剂的ISI数值。 目前用于生产和出售的组织凝血活酶试剂必须标有ISI数值[I] WT测定影响因素很多，其中最关键的是凝血酶原试剂，由于所用凝血酶原试剂的敏感度不同，即使在相同条件下对同一标本测得的结果也不同，而我国医生常用的凝血酶原百分活动度则因为标准血浆不统一而相差更大，甚至达到难以比较的程度。因此WHO于1981年提出PT标准化报告方式为 INR, INR = (PTR) ISI，其中ISI为国际敏感度指数，PTR为PT测定秒值(s)与PT标准对照秒值(s)的比值。经上述公式换算成INR值后，能克服试剂之间敏感度差异的影响，使INR 值报告方式具有可比性和可信度[2]。国内多数文献报告人工心脏瓣膜置换术后采用国际正常标准化比值对口服抗凝药物治疗的监测，结果稳定、可靠，具有可比性[3 5]。在口服抗凝药治疗中，华法林类药物是非常有效的抗凝药物，它在不同病人体内的新陈代谢率不同，因而它的剂量必须仔细监测，否则就会因超剂量而造成出血或因为剂量不足导致疾病复发，血栓形成。由此可见在凝血酶原时间的测定中，准确的INR结果对临床抗凝治疗药物的监测非常重要。但是不同ISI值的PT试剂测得的INR结果差异非常显著，而且当标本的INR值越高时，测定结果差异越显著。理论上，ISI值越接近1.0，表明试剂越敏感[I]。根据卫生部临床检验中心凝血试验的室间质控中INR的成绩也可以看出ISI值越接近I. O 的PT试剂，测得的结果越准确。所以，在日常工作为了确保口服抗凝药物治疗有效性和安全性，为了检验结果的准确性很多实验室都建议使用接近ISI值I. O的凝血酶原试剂。目前，医院临床实验室检测PT多用凝血分析仪进行检测。从方法学上讲，凝血分析仪可分为三大类光学法(代表厂家为Sysmex)、磁珠法(代表厂家为Stago)和光学磁珠法(代表厂家为Brink Electronik)。有别于传统的手工法，不同仪器的方法差异使各类仪器的敏感度指数不一样，这为PT试剂的最终检测灵敏度引入了新的影响因素。因此，为不同机型调配出ISI值趋近于I. O的试剂将有助于统一不同机型的检测结果，有利于PT检查项目的标准化。参考文献[I]丛玉隆，血液学体液学检验与临床释疑[M]，北京人民军医出版社，2004:173。[2] 丁焕民，门小平，蔡淑清，服用抗凝药时INR值的最佳选择[J]，长春中医学院学报，1999，12 (15) :40。[3]董力，石应康，邓承祺等，应用国际标准化比值监测心脏机械瓣膜替换术后抗凝治疗[J]，中华胸心血管外科杂志，1999，15 (4) ;167。[4]魏文宁，王林林，方峻等，机械瓣膜替换术后抗凝中血浆蛋白C含量改变的意义[J]，上海医学检验杂志， 2001,16(1) :15。[5]高辉，杨舒，朱雯梅等，人工心脏瓣膜替换术后342例患者应用国际正常标准化比率对口服抗凝药物的监测[J]，上海医学检验杂志，2002，17 (3) :159。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有背景技术的不足之处，而提供一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法。本发明的目的是通过如下措施来达到的凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，其特征在于所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为2500-3000U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为 8500-9500U/L。在上述技术方案中，所述每升缓冲液体系包括30-50mM的Tris-HCl，占缓冲液体系重量3 10%的甘氨酸，占缓冲液体系重量I 5%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量O. 6 I. 3%的氯化钠，6. 8 8. 4mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3，其余为水，缓冲液体系的PH值为6. 0-8. O。在上述技术方案中，所述重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为3000U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为9000U/L。在上述技术方案中，所述凝血活酶还包括兔脑磷脂O. 5-1. 5g/L。为了乳化凝血活酶，并提供催化表面。制备上述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，其特征在于它包括如下步骤首先将重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系采用不同的机型进行调试，调试所用的质控血浆为德灵INR标准血浆，通过此血浆测定出在在各种凝血分析仪上的ISI值即分析灵敏度；其次，将在不同的机型上的ISI值为I的重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系的配比固定并分装，并分别真空冷冻干燥，即配成为不同机型的凝血酶原时间测定试剂盒。本发明的设计一种PT测定试剂的新的制备技术。在此技术下，可以制备出一系列 PT体外诊断试剂盒，各试剂盒可用于不同方法学原理的凝血分析仪，而其ISI值均可趋近于I. O或等于I。本发明将高灵敏的人重组凝血活酶与低灵敏度的兔脑粉提取凝血活酶结合起来，通过一定的配比制备出能够满足不同方法学血凝仪的PT试剂，使其ISI值均能接近 I. O。
图I为本发明凝血酶原时间测定试剂制备方法的流程图。
具体实施例方式下面结合附图详细说明本发明的实施情况，但它们并不构成对本发明的限定，仅作举例而已。同时通过说明本发明的优点将变得更加清楚和容易理解。本发明的目的是通过如下措施来达到的凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为2500-3000U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为 8500-9500U/L。所述每升缓冲液体系包括30_50mM的Tris-HCl，占缓冲液体系重量3 10%的甘氨酸，占缓冲液体系重量I 5%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量O. 6
I.3%的氯化钠，6. 8 8. 4mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3,其余为水，缓冲液体系的PH值为6. 0-8.0。凝血活酶还包括兔脑磷脂O. 5-1. 5g/L。制备上述凝血酶原时间测定试剂盒的方法(如图I所示)，它包括如下步骤首先将重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系采用不同的机型进行调试，调试所用的质控血浆为德灵INR标准血浆，通过此血浆测定出在在各种凝血分析仪上的ISI值即分析灵敏度；其次，将在不同的机型上的ISI值为I的重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系的配比固定并分装，并分别真空冷冻干燥，即配成为不同机型的凝血酶原时间测定试剂盒。实施例I凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为2500U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为8500U/L，所述每升缓冲液体系包括30mM的Tris-HCl， 占缓冲液体系重量3%的甘氨酸，占缓冲液体系重量I %的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量O. 6%的氯化钠，6. 8mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3，其余为水，缓冲液体系的PH值为6.0。制备凝血酶原时间测定试剂盒的方法，它包括如下步骤首先将重组人组织因子、 兔脑组织因子和缓冲液体系采用不同的机型进行调试，调试所用的质控血浆为德灵INR标准血浆，通过此血浆测定出在在各种凝血分析仪上的ISI值即分析灵敏度；其次，将在不同的机型上的ISI值为I的重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系的配比固定并分装， 并分别真空冷冻干燥，即配成为不同机型的凝血酶原时间测定试剂盒。实施例2凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为3000U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为9500U/L。所述每升缓冲液体系包括50mM的Tris-HCl， 占缓冲液体系重量10%的甘氨酸，占缓冲液体系重量5%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量I. O %的氯化钠，8. 4mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3，其余为水，缓冲液体系的PH值为8.0。制备方法同实施例I。实施例3凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为2800U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为9000U/L。所述每升缓冲液体系包括40mM的Tris-HCl， 占缓冲液体系重量7%的甘氨酸，占缓冲液体系重量3%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量I. 3%的氯化钠，7. 6mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3，兔脑磷脂O. 5g/L， 其余为水，缓冲液体系的PH值为8. O。制备方法同实施例I。实施例4凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为2750U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为9200U/L。所述每升缓冲液体系包括43mM的Tris-HCl， 占缓冲液体系重量8%的甘氨酸，占缓冲液体系重量4%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量I. I %的氯化钠，7. 2mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3,兔脑磷脂I. 5g/L， 其余为水，缓冲液体系的PH值为8. O。制备方法同实施例I。实施例5凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为2700U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为9300U/L。所述每升缓冲液体系包括45mM的Tris-HCl， 占缓冲液体系重量9%的甘氨酸，占缓冲液体系重量5%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量I. 2%的氯化钠，7. 5mM的氯化钙，占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3，兔脑磷脂I. Og/L， 其余为水，缓冲液体系的PH值为8. O。制备方法同实施例I。实验I :试剂的检测灵敏度实验以BE compactX为测试机型，将不同配比的重组人组织因子和兔脑粉提取物组织因子制成PT冻干试剂。在测试前，用一定体积的蒸馏水复溶。重组人组织因子与兔脑粉提取物组织因子不同配比的灵敏度见表一。ISI值的校准用德灵公司INR标准血浆。表一重组人组织因子与兔脑粉提取物组织因子不同配比的灵敏度(BE CompactX)
权利要求
1.凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，其特征在于所述的凝血活酶包括兔脑组织因子和重组人组织因子，重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为 2500-3000U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为8500-9500U/L。
2.根据权利要求I所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于所述每升缓冲液体系包括30-50mM的Tris-HCl，占缓冲液体系重量3 10%的甘氨酸，占缓冲液体系重量I 5%的小牛血清白蛋白，占缓冲液体系重量O. 6 I. 3%的氯化钠，6. 8 8. 4mM的氯化钙， 占缓冲液体系重量O. 5%的NaN3，其余为水，缓冲液体系的PH值为6. 0-8. O。
3.根据权利要求I或2所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于所述重组人组织因子在缓冲液体系中的用量为3000U/L，兔脑组织因子在缓冲液体系中的用量为9000U/L。
4.根据权利要求3所述的凝血酶原时间测定试剂盒，其特征在于所述凝血活酶还包括兔脑磷脂O. 5-1. 5g/L。
5.制备上述任一权利要求所述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，其特征在于它包括如下步骤首先将重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系采用不同的机型进行调试，调试所用的质控血浆为德灵INR标准血浆，通过此血浆测定出在在各种凝血分析仪上的ISI 值即分析灵敏度；其次，将在不同的机型上的ISI值为I的重组人组织因子、兔脑组织因子和缓冲液体系的配比固定并分装，并分别真空冷冻干燥，即配成为不同机型的凝血酶原时间测定试剂盒。
全文摘要
凝血酶原时间测定试剂盒，它由凝血活酶、缓冲液体系构成，凝血活酶为兔脑组织因子和重组人组织因子。缓冲液体系包括30-50mMTris-HCl；甘氨酸3～10％；小牛血清白蛋白1～5％；氯化钠0.6～1.3％；氯化钙6.8～8.4mM；NaN30.5％；缓冲液体系的pH值为6.0-8.0。所述凝血活酶还包括兔脑磷脂。它克服了不同仪器的方法差异使各类仪器的敏感度指数不一样的缺点，本发明将高灵敏的人重组凝血活酶与低灵敏度的兔脑粉提取凝血活酶结合起来，通过一定的配比制备出能够满足不同方法学血凝仪的PT试剂，使其ISI值均能接近1.0。本发明还同时公开了凝血酶原时间测定试剂盒的制备方法。
文档编号G01N33/86GK102608337SQ20121003258
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月14日 优先权日2011年4月22日
发明者刘介, 田树伟, 鲁翌 申请人:武汉塞力斯生物科技有限公司