癌胚抗原的n-结构域及其组合物、方法和用途的制作方法

专利名称：癌胚抗原的n-结构域及其组合物、方法和用途的制作方法
技术领域：
本公开涉及癌胚抗原(CEA) N-结构域及其方法和用途。具体而言，本公开涉及CEA的N-结构域用于治疗癌症的组合物、方法和用途。
背景技术：
人癌胚抗原(CEA，CEACAM5，⑶66e)是最初作为胃肠道癌胚抗原描述的GP1-锚定糖蛋白[Gold和Freedman，1965]。该细胞表面抗原时常在肠道和呼吸道的上皮癌以及乳腺、胰脏、胃和卵巢的癌症上过表达[Goldenberg等，1976 ；Shively等，1985 ；Thompson等，1991 ;Gold 和 Goldenberg, 1997 ；Hammarstrom, 1999]。从临床角度看，癌症患者血液中 CEA的术前水平高与无病生存期负相关。已经将CEA参与的细胞间粘附事件与癌症侵袭和转移相联系[Jessup 和 Thomas, 1998 ；Yoshioka 等，1998 ；Thomas 等，1995]。照此,干扰 CEA-特异性功能和CEA-依赖性细胞相互作用的策略会阻断或延缓在体内建立转移肿瘤病灶。 CEA在结构上由7个细胞外Ig-样结构域(NapBpAyByA3和B3)组成并且主要通过涉及其N和A3B3 Ig-样模块的相互作用而自我结合(定义为同型结合和嗜同性细胞相互作用)[Zhou等，1993]。已经通过实验显示,加入针对CEA N结构域中发现的表位的单克隆抗体(mAbs) [Jessup等，1993 ；Yamanka等，1996]以及从CEA N结构域内序列衍生的环肽[Taheri等，2000]抑制体外CEA-特异性细胞粘附事件。类似地，已经证明施用识别位于CEA的N结构域和邻近的A1B1结构域内的表位的Fab'增加具有表达CEA的肺微转移灶的裸鼠的存活[Blumenthal等，2005]。这些发现表明特别是集中于阻断CEA N结构域参与的相互作用的免疫应答会停止或限制患者中肿瘤转移灶的形成。先前对开发基于CEA抗肿瘤疫苗的尝试集中于基于预装有预测的T-细胞表位的树突细胞或者递送全长分子的重组病毒的疫苗制剂[Curigliano等,2006 ；Berinstein, 2002 ;Zimmer 和 Thomas,2001 ;Crosti 等，2006;Shen 等，2004 ;Kobayashi等,2002 ;Matsuda等,2004]。大多数推定的T-细胞表位是位于该分子中心区域的短序列[Curigliano 等，2006 ；Berinstein,2002 ；Zimmer 和 Thomas,2001 ；Crosti 等，2006 ；Shen等,2004 ;Kobayashi等,2002 ;Matsuda等，2004]。在另一情况中，预测的T细胞(CTL)表位被改变，使其包括一个Val残基作为最后残基，以尝试改善肽与HLA-A2的结合并因此激发CEA-特异性CTL应答[W02009002418]。不幸地是，发现这些表位缺乏免疫原性加上肿瘤微环境中存在免疫抑制性调节性T(Treg)细胞使得基于CEA的抗肿瘤疫苗的有效性大打折扣[Morse等，2008 ;Bos等，2008]。已经尝试通过使免疫抑制性Treg细胞耗竭[Morse等，2008 ；Bos等，2008]或者通过共施用TAA与共刺激性分子的组合[Gulley等，2008 ；Dai等，2008]来克服这些局限性。
着眼于阻断CEA依赖性粘附事件和肿瘤病灶的形成的治疗性疫苗也许代表着更加适当和可实现的目标。重要的是，CEA在转移中的作用与它的过表达和结合相联系，而这与推测通过其PELPK基序(CEA的N结构域的残基108-112)直接结合TRAIL-R2 (DR5)[Samara等，2007]所导致的早期半胱天冬蛋白酶_9失活和PI3_K/Akt存活途径的活化以及半胱天冬蛋白酶-8失活有关[Camacho-Leal和Stanners, 2008]。该肽基序负责介导正在转移的细胞进入到肝实质中，通过促进细胞间聚集导致发生转移病灶，这种细胞间聚集是通过涉及IgV-样N-和IgC-样A3结构域的嗜同性细胞相互作用进行的[Berinstein,2002 ；Benchimol 等，1989 ；Taheri 等，2000 ；Zimmer 和 Thomas, 2001]。

发明内容
本发明人已经证明施用野生型和去糖基化突变体形式的癌胚抗原(CEA)的N-结构域连同佐剂能够克服免疫耐受和加强免疫应答，所述免疫应答能够明显干扰肿瘤在表达人CEA的转基因小鼠中的生长。因此，本公开提供免疫原性组合物，其包含癌胚抗原(CEA)N-结构域或者编码N-结构域的核酸。在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂，例如poly 1:(，和/或药用载体。在一个实施方案中，CEA N-结构域包含如SEQ ID NO :1、2或7中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，CEA N-结构域由如SEQ ID NO :1、2或7中所示氨基酸序列组成。在又一实施方案中，核酸分子包含如SEQ ID NO :3、4或14中所示的核酸序列。在另一实施方案中，免疫原性组合物还包含第二 CEA结构域。在一个实施方案中，第二 CEA结构域是A3B3结构域。在再一实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。在一个实施方案中，佐剂是poly IiC0本文还提供诱导或增强抗癌胚抗原(CEA)的免疫应答的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本文还提供诱导或增强抗CEA免疫应答的 方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEAN-结构域特异性血清或者CEA N-结构域特异性抗体。还提供抑制表达癌胚抗原(CEA)的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本文还提供抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEAN-结构域特异性血清或者CEA N-结构域特异性抗体。甚至还提供治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者具有增加的所述癌症风险的受试者的方法，该方法包括施用有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本文还提供治疗具有CEA-相关癌症或者具有增加的所述癌症风险的受试者的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域特异性血清或者CEA N-结构域特异性抗体。在一个实施方案中，癌症是上皮癌，例如胃肠道、乳腺、肺或胰脏的癌症。在另一实施方案中，本公开的方法还包括施用第二 CEA结构域。在一个实施方案中，第二 CEA结构域是A3B3结构域。在再一实施方案中，本公开的方法还包括施用佐剂。在一个实施方案中，佐剂是poly IiC0本文还提供用于鉴定CEA-介导的嗜同性相互作用的抑制剂的体外筛选测定法，该测定法包括在测试化合物存在下将MC38. CEAluc细胞与不发光的MC38. CEA细胞的单层孵育；和通过定量由粘附的MC38. CEAuig细胞所发射的生物发光信号来评价细胞粘附，其中与对照相比生物发光降低指示测试化合物是CEA-介导的嗜同性相互作用的抑制剂。根据下列详细描述，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。然而应当理解，详细描述和表示本公开实施方案的特定实施例仅以例证方式给出，因为根据本详细描述，出于本公开精神和范围之内的多种改变和修饰对本领域技术人员而言是显而易见的。


现结合附图描述本公开，其中图1显示人癌胚抗原(CEA)及其表达的重组模块的示意图。A.人CEA结构域结构的示意图[根据Conaghan等,2008修改]。B.所产生的rCEA结构域以及以千道尔顿计的它们的预期分子量(KDa)的示意性描述。C.考马斯染色的SDS-PAGE描述所纯化的rCEA构建体的纯度和分子量。图2显示保留了它们的细胞粘附特性的纯化的人重组CEA。A.使用基于ELISA的蛋白质结合测定法证明同型rCEA相互作用。96孔聚苯乙烯板用非标签化的rCEA N-结构域(Img每孔)包被并且与His-标签化的rCEA模块或非特异性蛋白质(BSA和TNF- a )孵育。使用HRPO-偶联抗-His mAb(Hisl ；1 5000稀释)确定结合的His-标签化蛋白质的存在。B.使用磁性N1-NTA珠的钓饵(Pull-down)，显示非标签化的WT rCEA N结构域与His-标签化的rCEA模块的特异性相互作用。TNF-a用作对照蛋白质，其没有钓饵(pulldown)非标签化的rCEA N结构域。C. CEA介导的细胞聚集动力学的逆转。将表达CEA的人结直肠腺癌细胞-(HT-29)以及表达CEA的鼠结直肠和胃腺癌细胞系(分别为MC38. CEA和mGC4. CEA)从其基质上分离 并且与rCEA模块(N、A3/B3*A3)或无关蛋白质(TNF-a )以Img蛋白质每IO6个细胞每mL的比率悬浮孵育。图3显示WT和突变体rCEA N结构域的工程学和免疫反应性。A. CEA N-结构域的一级序列(WT SEQ ID NO :1和突变体SEQ ID NO 2)，已知的免疫显性表位(加下划线)，负责粘附和转移的序列(斜体)，和工程化0-糖基化位点(粗体)。B.所表达的rCEA N结构域模块的纯度和免疫反应性。考马斯染色SDS-PAGE描述所纯化WT和突变体rCEA构建体的纯度和分子量。C.使用一组对亲和性标签(PentaHis mAb ;Qiagen)、野生型CEA N结构域(CollmAb ;Invitrogen)具有特异性的抗体或者对多个CEA表位具有特异性的多克隆抗体(pan CEA P20 ；Santa-Cruz Biotechnology),对所表达 rCEA 野生型(WT)和突变体(MUT)N结构域的免疫反应性的Western印迹分析。图4显示施用作为治疗疫苗的无内毒素rCEA WT或突变体N结构域之后对侵袭性肿瘤生长的控制。A.施用rCEA N结构域之后CEA. Tg小鼠(每组8只)中的肿瘤生长。每一条上升线代表一只小鼠。向8至12周龄CEA. Tg小鼠右后足内皮下植入5X IO5个MC38. CEA细胞。治疗小鼠在异种移植物植入后第6天时接受IP注射与IOOmg poly1:C(Sigma-Aldrich)混合的 IOOmg rCEA。一周以后在第 13 天用与 IOOmg poly1:C 混合的IOOmg rCEA对动物的加强免疫。B. Kaplan-Meier曲线描述来自不同组CEA. Tg的小鼠的存活率。尽管MC38. CEA肿瘤异种移植物具有侵袭性生长，但是它没有杀死动物。然而，在肿瘤生长部位呈现溃疡和/或达到肿瘤直径> 15mm的动物按照机构动物管理伦理指导原则(institutional animal care ethics guidelines)处以安乐死。图5显示预防性施用无内毒素rCEA WT或Mut N结构域导致肿瘤在免疫的CEA.Tg小鼠中生长迟延。A.实验方案概图。8至12周龄CEA. Tg小鼠通过腹膜内注射与IOOmgpoly1:C (Sigma-Aldrich)混合的IOOmg rCEA初次免疫并且在第3和10天用与IOOmgpoly1:C混合的50mg rCEA经IP加强免疫。在最后一次免疫后4天,小鼠以向右后足内皮下植入5X IO5 MC38. CEA作为异种移植物来激发。B.预防性施用无内毒素rCEA N结构域后CEA. Tg小鼠内的肿瘤生长(每组8只)。每一上升线代表一只小鼠。C. Kaplan-Meier曲线描述来自不同组的CEA. Tg小鼠的存活率。尽管MC38. CEA肿瘤异种移植物具有侵袭性生长，但是它没有杀死动物。然而，在肿瘤生长部位呈现溃疡和/或达到肿瘤大小> 15mm的动物按照机构动物管理伦理指导原则处以安乐死。图6显示疫苗接种后对细胞因子产生的刺激。CEA-免疫和对照小鼠脾脏中CEA-特异性IL-4(A)、IL-1O(B)和IFN-Y (C)斑点形成单位(SFU)计数。在最后一次免疫后4天收集脾脏白细胞并且使用伴刀豆球蛋白A(Con A ；2. 5ug每mL ； Sigma-A I dr ich)、人CEA的全长肿瘤糖形(FL-CEA ;lug每mL ； Sigma-A I dr ich)或rCEA WT N-结构域(WT N-结构域；Iug每mL)体外刺激。使用自动ELISP0T平板计数仪(Cellular Technologies Inc)计数分泌Ag-特异性细胞因子的SFU的数量。数据表示为在Ag-/ConA-刺激的孔中观察到的斑点数量与非刺激孔中观察到的斑点数量之间的差异。数据表示为来自各个动物的平均DSFU土SD。图7显示腹膜内施用rCEA N结构域后对IgGl和IgG2a产生的刺激作用。在最后一次免疫后4天从CEA-免疫小鼠和对照小鼠收集血清并通过间接ELISA测试CEA N结构域-特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体的存在。结果表示观察到的1: 1000稀释的混合血清样品的抗-CEA WT N结构域的光密度。与未免疫的相比具有显著性，*P<0. 01 ;Student-t-检验。图8显示肿瘤细胞的补体依赖性溶解作用。MC38. CEA细胞以I X IO5个细胞每mL的密度悬浮于仅PBS中或者补充有兔补体(1 100最终稀释度；Cedarlanelabs)的PBS中，并用来自免疫小鼠或者对照小鼠(1 100最终稀释度)的血清处理。将细胞悬浮液于37°C孵育I小时，并通过台盼蓝染料排除评价溶解细胞的百分数。NS ;与未处理细胞相比没有统计学显著性。与用补体和来自未免疫CEA. Tg小鼠的血清处理的细胞相比具有显著性，*P ^ 0. 01 ；Student-t-检验。图9显示对所产生rCEA N模块的折叠和同型结合活性的分析。A.重组CEAN和A3B3结构域的免疫共沉淀。将以mAb ColK识别CEA N结构域；泳道I)或同种型对照mAb (泳道2)预包被的磁性蛋白A珠加入到包含Iii M每种重组蛋白的悬浮液中。回收的蛋白质复合体通过SDS-PAGE分离并且通过考马斯染色将蛋白质条带显色。B.如通过ELISA所确定的rCEA N结构域与CEA的全长肿瘤糖形(▲ )、rCEA N结构域( )或rCEA A3B3结构域(■)的相对结合亲和性。每一数据点代表来自一式三份开展的实验的平均吸光度值(士SEM)。图10显示以rCEA N结构域作为免疫原对CEA. Tg小鼠进行腹膜内疫苗接种导致肿瘤在免疫小鼠内的生长稳定。A.实验设计和免疫方案。B.皮下植入到未免疫CEA. Tg小鼠(▲ ;n = 12)、仅接受佐剂poly1:C的小鼠(■ ;n = 12)或者以rCEAN结构域和佐剂免疫的小鼠( ；!!= 12)后足内的所建立的表达CEA的鼠结肠癌MC38. CEA的肿瘤生长动力学。C.对于每一实验处理组内每一 CEA. Tg小鼠观察到的各个肿瘤生长曲线的集合。每条线代表一只小鼠。图11显示以rCEA N结构域作为免疫原对CEA. Tg小鼠(腹膜内)疫苗接种阻止肺肿瘤结节发展。A.实验设计和免疫方案。B.在疫苗接种后28天时将表达CEA的鼠结肠癌MC38. CEA细胞静脉注射(尾静脉)进入CEA. Tg小鼠中。照片突出存在于在肿瘤注射后60天时从免疫和对照CEA. Tg小鼠分离的肺组织内的肿瘤块(黑色箭头)。C.小鼠全肺苏木精和伊红(H&E)染色切片显示，在未接种的或者仅佐剂处理的动物中存在大的肿瘤结节(黑色的染色区)。来自免疫小鼠肺组织的组织学特征与正常小鼠肺的相似。D.H&E染色肺标本中的肿瘤病灶计数(n = 6,来自每一处理组的整个肺)。E.肿瘤植入后60天时肺组织总体积(包括肿瘤块；n = 12)。使用Student-t-检验确定统计学显著性。图12显示使用rCEA N结构域作为免疫原对CEA. Tg小鼠腹膜内疫苗接种预防了腹膜肿瘤结节的发生。A.实验设计和免疫方案。将表达萤光素酶的稳定转化MC38. CEAme细胞腹膜内注射入未免疫的、佐剂处理的或者免疫的CEA. Tg小鼠中。B.植入后1、3和8天时MC38.CEALLUC细胞生长和扩散的原位监测。肿瘤植入后的动物内记录到的发光信号(Xenogen IVIS ;腹膜内注射萤光素)证明对于植入到疫苗接种动物内的MC38. CEA-C细胞随着时间信号降低。C.照片突出了肿瘤注射后35天时免疫和对照小鼠内脏内肿瘤结节的缺乏和存在。肿瘤结节通过 绿色箭头指出。D.免疫和对照小鼠腹膜腔内存在的肿瘤结节数量(n = 5)。使用Student-t-检验确定统计学显著性。图13显示疫苗接种的、佐剂处理的和未接种的CEA. Tg小鼠的CEA-特异性Th细胞因子表达谱。A.实验设计和免疫方案.B.如通过ELISP0T测定法测量的，来自免疫和对照小鼠的rCEA-特异性IFN- y、IL-10和IL-4斑点形成单位(A SFUs)计数。直方图表示从两个独立的免疫试验测量的(n = 3每组)平均的ASFU数值。通过从处理组测量值减去背景值(来自包含未刺激细胞的孔)计算分泌Ag-特异性细胞因子的淋巴细胞的数量(A SFUs)。星号意味着与源于未免疫CEA. Tg小鼠的分泌CEA-特异性细胞因子的细胞的频率相比具有统计学显著性(P ( 0. 05 ;Student-t-检验)。图14显示以rCEA N结构域和poly1:C疫苗接种CEA. Tg小鼠导致产生N结构域-特异性血清IgG。A.通过ELISA分析未免疫的、佐剂处理的或者免疫的CEA. Tg小鼠血清中循环N结构域-特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体滴度的存在。结果表示混合血清样品在450nm下的平均实测光密度(土 SEM) (n = 12 ;以1: 1000稀释度).B.如通过ELISA以I 1000的血清稀释度测定的各个小鼠CEA N结构域-特异性IgGl和IgG2a滴度的比较。图15显示来自以rCEA N结构域疫苗接种的CEA. Tg小鼠的血清表现出对表达CEA的细胞具有ADCC和CDC细胞毒性功能以及CEA-特异性抗粘附特性。仅源于疫苗接种CEA.Tg小鼠的血清(I 250稀释度)可以通过A. Ab-依赖细胞毒性(ADCC)和B.补体依赖细胞毒性(CDC)杀死表达CEA的MC38. CEA肿瘤细胞。C.加入来自免疫CEA. Tg小鼠的抗-CEA抗血清(I 250稀释度)抑制MC38. CEAluiC细胞对MC38. CEA单层的CEA依赖性粘附。将I u M rCEA N结构域与免疫小鼠血清预孵育逆转了由血清抗体对MC38. CEA细胞的CEA-特异性细胞粘附的抑制。NS;当与未处理细胞相比时没有统计学显著性。D.通过加入来自以rCEA N结构域免疫的小鼠的血清(I 1000稀释度)特异性抑制重组纯rCEA N与A3B3结构域之间的同型结合。星号意味着当与以来自未免疫CEA. Tg小鼠的血清处理的样品比较时具有统计学显著性(P ( 0. 001)，Student-t-检验。实验使用混合的血清样品开展(n =8)。图16显示源于疫苗接种CEA. Tg小鼠的CEA N-结构域特异性抗体或B淋巴细胞过继转移进入未免疫CEA. Tg受体中预防腹膜肿瘤结节的发生。A.植入后1、3和8天时MC38.CEAiue细胞生长和扩散的原位监测。在肿瘤植入后的动物内记录到的发光信号(XenogenIVIS)证明，对于将MC38. CEAluc细胞植入到用来源于疫苗接种CEA. Tg小鼠的纯化B细胞(1. V.)或血清(腹膜内)预处理的未免疫CEA. Tg动物，信号随着时间降低。B.在MC38.CEAluc植入到未免疫CEA. Tg小鼠腹腔内后21天时的累积肿瘤体积。图17显示表达CEA的人腺癌细胞系对补体依赖溶解的敏感性。CEA+(MC38. CEA、HT-29、MCF-7和BxPC3)和CEA^MC38、HeLa)细胞以I X IO6个细胞每mL的密度悬浮于添加兔补体(I 250最终稀释度)的培养基中并且用来源于免疫或对照小鼠(I 250最终稀释度)的血清处理。从通过台盼蓝染料排除测量的存活细胞部分计算细胞溶解的百分数。每个柱表示从一式四份开展的实验计算的平均细胞毒性％ (土SEM)。星号意味着当与用补体和来自未免疫CEA. Tg小鼠的血清处理的细胞相比具有统计学显著性(P ^ 0. 05 ；Student-t-检验)。图18显示酵母-2- 杂交实验，证实rCEA N结构域与自身和与A3B3结构域结合。作为C-末端与GAL4DNA-结合结构域的融合体表达CEA的IgV-样N结构域的质粒载体(诱饵载体)，与表达与GAL4活化结构域C末端融合的CEA IgV-样N-结构域或者IgC-样A3B3结构域的载体(捕获载体)在酵母菌株AH109中共转化[McCluskey等，2008]。所得到的酵母菌落生长过夜并且作为十倍系列稀释物(5 u I)点在缺乏Trp的SD培养基上以选择存在诱饵质粒的酵母细胞；缺乏Trp和Leu的SD培养基上以选择存在诱饵和捕获质粒两者的酵母细胞；或者点在缺乏Trp、Leu和His的SD上，以选择表达N-Gal和A3B3-Gal融合蛋白的诱饵和捕获质粒，N-Gal和A3B3-Gal融合蛋白彼此相互作用导致菌落生长。酵母生长结果(右侧最后一组)表明CEA N结构域诱饵融合蛋白与它的CEA N结构域捕获融合配偶体或者与CEA A3B3结构域捕获融合构建体相互作用。图19显示响应于利用rCEA N结构域或全长CEA的刺激缺乏淋巴细胞增殖。细胞从免疫或者对照小鼠(n = 4只小鼠每组)的脾脏分离并在全长糖基化CEA(FL-CEA)或rCEAN结构域存在下培养72h。来自免疫和对照小鼠的脾细胞用伴刀豆球蛋白A (ConA ;5y g每mL)、人CEA的全长肿瘤糖形(I ii g每mL)、rCEA WT N结构域(I y g每mL)进行体外刺激或者留作未刺激对照。然后细胞生长48小时(37°C,5% CO2)，然后用3H-胸腺嘧啶核苷脉冲24小时。使用闪烁计数器测量所收集的细胞中掺入的胸腺嘧啶核苷的量。淋巴组织增生结果表示为刺激指数(Ag刺激细胞的cpm/未刺激细胞的cpm)。大于1. 5的刺激指数考虑为明显Ag-特异性淋巴细胞增殖的指标。用ConA刺激淋巴细胞(来自任何测试组)得到大于10的刺激指数(数据未显示)。来自免疫或者对照小鼠的脾细胞在用CEA构建体刺激时没有观察到统计学显著性的增殖。数据集通过ANOVA分析。图20显示所使用腺癌细胞系表达人CEA。(A)鼠结肠癌MC38细胞系(70kDa条带)或者(B)人腺癌细胞系BxPC3、HT29、MCF-7和HeLa的相对CEA表达谱的免疫印迹分析。来自6X IO4个细胞的细胞溶解液在7. 5%不连续LaemmliSDS-PAGE凝胶上解析并转移到硝酸纤维素膜上。通过Western印迹使用CEA N结构域-特异性mAb Coll (1:1, 000稀释)接着使用HRP-偶联的抗小鼠二抗缀合物(I 1，000稀释)证实CEA的存在。发明详述本发明人已经证明，腹膜内施用癌胚抗原(CEA) N-结构域与佐剂导致产生CEA-特异性IFN-Y和IL-4应答以及产生能够介导抗体依赖性肿瘤溶解的高水平循环IgGl和IgG2a抗体。本发明人还证明，携带表达hCEA的鼠肿瘤的CEA转基因(CEA. Tg)小鼠中肿瘤生长被阻滞，导致这些动物的存活时间改善。本发明人还证明，从以CEA N-结构域免疫的小鼠收集的血清和B淋巴细胞起对抗肿瘤植入的保护作用。鉬合物因此，本公开提供免疫原性组合物，其包含癌胚抗原(CEA)N-结构域或者编码N-结构域的核酸，和任选的药用载体。术语“免疫原性组合物”如本文所使用，指能够弓I起免疫应答的组合物,所述免疫应答包括但不限于针对组合物中存在的抗原产生抗体或者细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。术语“佐剂”如本文所使用，指能够增强本文所述N-结构域的免疫刺激作用但其本身没有任何特异性抗原作用的物质。有代表性的佐剂包括但不限于，弗氏佐剂、招盐、S烯、poly1:C> poly1:C LC(来自Oncovir的也称作Hiltonol )、四醚脂质体、病毒体、微粒体、细菌外膜或膜蛋白制剂(OMP)、TiterMax佐剂制剂、免疫刺激复合体(ISCOM)、GM-CSF, SB-AS2、Ribi佐剂系统、Gerbu佐剂、CpG和单磷酰脂质A。在一个实施方案中,佐剂是poly1:C。在另一实施方案中,佐剂是poly1:C LC0
在一个实施方案中，免疫原性组合物是疫苗。术语“疫苗”如本文所使用指能够引起预防、治疗或改善疾病的预防性和/或治疗性应答的免疫原性组合物。术语“癌胚抗原”或“CEA”如本文所使用指来自任何物种或者来源的CEA并且指180-kD GPI锚定免疫球蛋白(Ig)样糖蛋白。CEA也称作CEACAM5或CD66e。人CEA包含651个氨基酸和7个不同的Ig结构域可变N-结构域和6个恒定-结构域-样IgC区(Al、B1、A2、B2、A3和B3)。在一个实施方案中，CEA是人CEA。人CEA具有Genbank登录号NM004363. 2。术语“N-结构域”如本文所使用指具有成熟CEA蛋白质(即缺乏信号肽)免疫球蛋白可变-样N-末端区的分离的蛋白质，其在结构上包含IgV-样球形模块和，任选地，分隔CEA N和AlIgC-样结构域的间隔序列，并且最低限度地包含N-结构域的免疫显性表位和负责粘附和转移的序列，例如如图3中所示，并且具有与野生型CEA蛋白质不同的糖结构。在一个实施方案中，N结构域是非糖基化的。在另一实施方案中，N结构域具有改变的糖基化。在一个实施方案中，N-结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的野生型序列或者如SEQ IDNO :7中所示的标签化的野生型序列或其同源物或类似物，或者由如SEQ ID NO :3或14中所示的核苷酸序列或其同源物或类似物编码。在另一实施方案中，N-结构域包含SEQ IDNO :1或7的氨基酸序列。在又一实施方案中，N-结构域包含如SEQ IDNO 2中所示去糖基化突变体序列或其同源物或类似物，或者由如SEQ ID NO :4中所示核苷酸序列或其同源物或类似物编码。在再一实施方案中，N-结构域包含如SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列。(见表I)。
术语“同源物”意思是指与SEQ ID N0:l_4、7或14中的序列具有轻微或者无关紧要的序列变异的那些氨基酸或核酸序列，即，序列以基本上相同的方式起作用。变异可归因于局部突变或者结构改变。具有相当大同源性的序列包括与如SEQ ID N0:l-4、7或14中所不序列具有至少65*%、至少85*%、或90-95%同一性的核酸序列。序列同一性可根据本领域已知方法计算。例如，通过BLAST版本2.1高级搜索算法可容易地评价核酸序列同一性。BLAST是可在http://www. ncb1. nlm. nih. gov/BLAST上在线可利用的一系列的程序。高级 blast 搜索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi Jform =I)被设置成默认参数(即矩阵BL0SUM62 ;空位存在扣分11 ;每一残基空位扣分I ;Lambda比率 0. 85 默认)。BLAST 搜索参考文献是Altschul, S. F.，Gish, ff.，Miller, ff.，Myers,E. ff.和 Lipman, D. J. (1990) " Basic local alignment search tool.(基本局部比对搜索工具)"J. Mol. Biol. 215 :403410 ；Gish, ff.和 States, D. J. (1993) " Identificationofprotein coding regions by database similarity search.(通过数据库相似性搜索识别蛋白编码区)"Nature Genet. 3 :266272 ；Madden, T. L. , Tatusov, R. L.和Zhang, J. (1996) " Applications of network BLAST server(网络 BLAST 服务器的应用)"Meth. Enzymo1. 266 131_141 ；Altschul, S. F.，Madden, T. L. , Schaffer, A. A.，Zhang,J.，Zhang, Z.，Miller, ff.和 Lipman，D. J. (1997)" Gapped BLAST and PSI_BLAST anewgeneration of protein database search programs. (Gapped BLAST 和 PSI_BLAST :新一代蛋白质数据库搜索程序)"Nucleic Acids Res. 25 :33893402 ；Zhang, J.和 Madden,T. L. (1997) " PowerBLAST A new network BLAST applicationfor interactive orautomated sequence analysis and annotation. (PowerBLAST 一种用于交互式或自动序列分析和注释的新型网络BLAST应用)"Genome Res. 7 :649656。此外，CEA N-结构域的同源物包括但不限于，就它们的序列而言具有同源的N-结构域的所有CEACAM。此类CEACAM有代表性地与细菌感染(粘附)和细菌定植有关。术语“类似物”意思是指与SEQ ID NO :1_4、7或14序列相比已经被修饰的氨基酸或核酸序列，其中修饰没有改变如本文所述的序列的效用(例如作为免疫激活剂)。修饰的序列或类似物可以具有比SEQ ID N0:l-4、7或14所示序列改善的特性。制备类似物的核酸修饰的一个实例是用修饰碱基例如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤，5-卤代 尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶，假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶，8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤，8-卤代鸟嘌呤、8氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它8-取代的鸟嘌呤，其它氮杂和脱氮尿嘧啶、胸腺嘧啶核苷、胞嘧啶、腺嘌呤、或鸟嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶替换序列中的天然存在碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷)中的一个。修饰的另一个实例是在SEQ ID NO :3、4或14中所示核酸分子中包括磷酸主链内的修饰的磷或氧杂原子、短链烷基或环烷基糖间化学键或者短链杂原子或杂环糖间化学键。例如，核酸序列可包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯和二硫代磷酸酯。本公开核酸分子类似物的更多实例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链被替换成与肽中存在的主链相似的聚酰胺主链(P.E. Nielsen，等Science 1991，254，1497)。已经证明，PNA类似物抗酶降解并且具有延长的体内和体外寿命。由于在PNA链与DNA链之间缺乏电荷排斥，所以PNA也会更强地与互补DNA序列结合。其它核酸类似物可包括含聚合物主链、环状主链或者无环主链的核苷酸。例如，核苷酸可以具有吗啉代主链结构(美国专利号5，034，506)。类似物还可包含基团，例如报告子基团，用于改善核酸序利药代动力学或药效动力学特性的基团。本公开还包括与SEQ ID NO :3、4或14中所示序列或其片段杂交并且保持了编码
刺激免疫应答的蛋白质特性的序列。术语“与......杂交的序列”意思是指可与SEQ ID
NO :3、4或14的序列在严格杂交条件下杂交的核酸序列。促进DNA杂交的适宜“严格杂交条件”是本领域技术人员已知的，或者可以在CurrentProtocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，John Wiley & Sons，N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中找到。术语“严格杂交条件”如本文所使用意思是指选择促进溶液中的两个互补核酸分子之间选择性杂交的条件。杂交可发生于全部或者部分核酸序利分子上。杂交部分就编码多肽的多核苷酸序列之一是至少50%的长度。在这一点上，核酸双链体或杂交体的稳定性由Tm决定，在包含缓冲液的溶液中，Tm是钠离子浓度、标记核酸的G/C含量、核酸探针长度(I)和温度的函数(Tm = 81. 50C -16. 6 (LoglO [Na+] )+0. 41(% (G+C) -600/1)。因此，决定杂交体稳定性的洗涤条件中的参数是 钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似但不相同的分子，可假设1%错配导致Tm降低大约1°C，例如如果寻找具有大于95%同一性的核酸分子，则最终的洗涤将降低5°C。基于这些考虑，严格杂交条件应该定义为在5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5 XDenhardt溶液/1.0% SDS下于Tm(基于上面方程)_5°C杂交，然后于60°C用0. 2XSSC/0. 1% SDS 的洗涤。本文所述的N-结构域可以被修饰以包含不改变刺激免疫应答性质的氨基酸取代、插入和/或缺失。保守氨基酸取代包括以相似电荷、大小和/或疏水特性的氨基酸取代蛋白质的一个或更多个氨基酸。当仅进行保守取代时，所得到的类似物应该与蛋白质功能上等效。非保守取代包括以具有不同电荷、大小和/或疏水特性的一个或更多个氨基酸取代蛋白质的一个或更多个氨基酸。本文所述的N-结构域可以被修饰以便使其治疗上更有效或者更稳定。例如，蛋白质可以通过与无机酸包括盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等，或者与有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸、和甲苯磺酸反应转变成药物盐。本公开还包括包含本文所公开核酸序利的表达载体。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒、人工染色体、病毒载体或修饰病毒(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要载体与所使用的宿主细胞相容即可。表达载体“适宜于宿主细胞的转化”，其意思是指表达载体包含本公开的核酸分子和基于待用于表达的宿主细胞选择的调控序列，所述调控序列可操作地连接至核酸分子。可操作地连接意指核酸与调控序列以允许核酸表达的方式连接。因此，本公开考虑了组合物，所述组合物包含含有本公开的核酸分子或其片段，和用于所插入蛋白质序列的转录和翻译的必需调控序列的本公开的重组表达载体。适宜的调控序列可以来源于许多来源，包括植物、藻、细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因(例如，参见 Goeddel, Gene Expression Technology MethodsinEnzymology (基因表达技术酶学方法)185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中描述的调控序列)。对适当的调控序列的选择依赖于如下所讨论所选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地实现。此类调控序列的实例包括转录启动子和增强子或者RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外,取决于选择的宿主细胞和采用的载体，可将其它序列，例如复制起点、额外的DNA限制位点、增强子和赋予转录诱导性的序列整合入表达载体中。应当意识到，必需的调控序列可以由CEA序列和/或它们的侧翼区提供。本公开的重组表达载体还可以包含选择标记基因，选择标记基因有利于对以本公开重组分子转化或者转染的宿主细胞的选择。选择标记基因的实例是编码蛋白质例如赋予对某些药物的抗性的G418和潮霉素、^ -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶、或免疫球蛋白或其部分例如免疫球蛋白，任选IgG的Fe部分的基因。通过选择标记蛋白质例如P -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的浓度变化监测选择标记基因的转录。如果选择标记基因编码赋予抗生素抗性，例如新霉素抗性的蛋白质，则可用G418选则转化体细胞。已经整合有选择标记基因的细胞可以存活，而其它细胞死亡。这使得有可能使本公开的重组表达载体的表达可见和被测定，并且特别是确定突变对表达和表型的影响。应当意识到，选择标记可以引入到与目的核酸分开的载体上。重组表达载体还可包含编码提供增强的重组蛋白表达的部分；增强的重组蛋白溶解度的部分；和通过充当亲和纯化中的配体来辅助纯化靶重组蛋白的部分的基因。例如，可向靶重组蛋白加入蛋白水解裂解位点以便在融合蛋白纯化之后从融合部分中分离重组蛋白。有代表性的融合表达载体包括pGEX(AmradCorp. , Melbourne,澳大利亚)、pMal (NewEngland Biolabs, Beverl y, MA)和 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ),它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或者蛋白A与重组蛋白融合。重组表达载体可以引入到宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“转化的宿主细胞”旨在包括能够被本公开的重组表达载体转化或转染的细胞。术语“转导的”、
“以......转化的”、“以......转染的”、“转化”和“转染”旨在包括通过本领域已知多
种可能技术之一将核酸(例如载体或裸RNA或DNA)引入到细胞中。可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，核酸可以通过常规技术例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质体(Iipofectin)、电穿孔、微注射、RNA转移、DNA转移、人工染色体、病毒载体和任何新出现的基因转移技术引入到哺乳动物细胞中。用于转化和转染宿主细胞的适宜方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning ALaboratory Manual (分子克隆实验室指南)，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratorypress (1989))，和其它实验教程中找到。CEA N结构域可以使用多种系统产生以得到非糖基化多肽。这包括整个多肽的化学合成；CEA N结构域在N-连接糖基化有缺陷的突变体中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达；使用无细胞表达系统(原核的和真核的两种)表达；或者在任何真核表达系统中表达蛋白质，接着体外去糖基化。适宜的宿主细胞包括广泛多种的真核宿主细胞和原核细胞。例如，本公开的蛋白质可以在藻类细胞、酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物细胞、真核或原核无细胞表达系统、或哺乳动物细胞中表达。其它适宜的宿主细胞可以在Goeddel, Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology (基因表达技术酶学方法)185, Academic Press,San Diego, CA(1991)中找到。此外，本公开的蛋白质可以在原核细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli) (Zhang 等，Science303 (5656) :371-3 (2004))或原核表达平台例如革兰氏阳性细菌和乳酸细菌，包括但不限于，格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)和乳杆菌属(Lactobacillus sPP)中表达。适宜开展本公开的哺乳动物细胞尤其包括293T细胞、COS(例如ATCC号CRL1650 或 1651)、BHK (例如 ATCC 号 CRL 6281)、CH0(ATCC 号 CCL 61)、HeLa (例如 ATCC 号 CCL2)、293 (ATCC 号 1573)和 NS-1 细胞。哺乳动物细胞还可以来源于人或动物并且包括已经被遗传工程化以表达本文所述蛋白质的干细胞(包括造血干细胞)、体细胞、祖细胞(包括内皮祖细胞)、成纤维细胞、淋巴细胞和间充质干细胞(MSC)。用于在哺乳动物细胞中指引表达的适宜表达载体通常包含启动子(例如源于病毒物质例如多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体实例包括 pCDM8(Seed，B.，Nature 329 :840(1987))、pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J. 6 :187-195(1987))和 pCMV (Clontech，California，美国)。也可使用 pCDNA 和从其衍生的载体(Gateway系列；Invitrogen)。在另一实施方案中，本文所述的免疫原性组合物还包含第二 CEA结构域。在一个实施方案中，本文所述的免疫原性组合物还包含A3B3IgC-样结构域或其截短形式。术语"A3B3IgC-样结构域”如本文所使用是指人CEA分子第3个串联免疫球蛋白恒定-样区，或其同源物。在一个实施方案中，A3B3IgC-样结构域是人的并且包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6的核酸序利编码(见表2)。方法和用途

本公开还提供本文所述免疫原性组合物用于诱导或增强免疫应答，用于抑制表达CEA的肿瘤细胞生长，和/或用于治疗癌症的方法和用途。因此，本公开提供诱导或增强抗癌胚抗原(CEA)的免疫应答的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本公开还提供有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子用于诱导或增强需要其的动物或细胞中抗CEA的免疫应答的用途。还提供有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子在制备用于诱导或增强需要其的动物或细胞中抗CEA的免疫应答的药物中的用途。还提供用于诱导或增强需要其的动物或细胞中抗CEA的免疫应答的有效量的CEAN-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本公开还提供用于诱导或增强抗CEA免疫应答的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域特异性血清或者CEA N-结构域特异性抗体。本公开还提供有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体用于诱导或增强需要其的动物或细胞中抗CEA的免疫应答的用途。还提供有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体在制备用于诱导或增强需要其的动物或细胞中抗CEA的免疫应答的药物中的用途。还提供用于诱导或增强需要其的动物或细胞中抗CEA的免疫应答的有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体。术语“诱导免疫应答”如本文所使用指激活免疫应答。术语“增强免疫应答”如本文所使用指使存在的免疫应答增强。
在一个实施方案中，免疫应答包括TH2应答，例如IL-4和IL-10的产生。在另一实施方案中，免疫应答包括循环IgGl和/或IgG2a抗体的产生。术语“CEA N-结构域特异性血清”如本文所使用指从先前以本文公开的免疫原性组合物免疫的动物中分离的包含多克隆抗体的血清。术语“CEA N-结构域特异性抗体”如本文所使用指从先前以本文公开的免疫原性组合物免疫的动物中分离的抗体或其片段。术语“抗体”如本文所使用旨在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可以来自重组来源和/或在转基因动物中产生。术语“抗体片段”如本文所使用旨在包括但不限于Fab、Fab' > F (ah' )2、scFv、dsFv、ds_scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、及其多聚体、多特异性抗体片段和结构域抗体。抗体可以使用常规技术片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab' )2片段。可将所得到的F(ab' ) 2片段处理以还原二硫键产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以导致形成Fab片段。Fab、Fab'和F(ab' )2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其它片段也可通过重组技术合成。可以使用常规方法制备抗体。使用标准方法，例如通过使用CEA N-结构域可以制成多克隆抗血清或单克隆抗体。可用N-结构域免疫哺乳动物(例如小鼠、仓鼠或者兔)在哺乳动物中引起抗体应答。赋予免疫原性的技术包括与运载体的结合或者本领域众所周知的其它技术。例如，可以在佐剂存在情况下施用N-结构域。可通过检测血浆或血清中的抗体滴度监测免疫进展。标准ELISA或其它免疫测定过程可使用免疫原作为抗原评价抗体水平。在免疫之后，可得到抗血清，并且必要时从血清分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可从免疫的动物采集产生抗体的细胞(淋巴细胞)并通过标准体细胞融合过程与骨髓瘤细胞融合，由此使这些细胞永生化和产生杂交瘤细胞。此类技术是本领域众所周知的，例如最初由Kohler和Milstein(Nature256 :495-497,1975)开发的杂交瘤技术以及其它技术例如人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor和Roder，Immunology Today 4 :3, 72-79,1983)、产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，“The EBV-Hybridoma Technique and its Application toHuman Lung Cancer (EBV-杂交瘤技术及其在人肺癌中的应用)”在“MonoclonalAntibodies in Cancer Therapy (癌症治疗中的单克隆抗体)”中，Allen R-Bliss, Inc. (1985)，第77-96页)以及组合抗体文库筛选(Huse等，Science 246 :4935，1275-1282，1989)。可通过免疫化学方法筛选产生与N-结构域特异性反应的抗体的杂交瘤细胞并且可以分离单克隆抗体。因此，本公开还考虑分泌对N-结构域具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。 还考虑了嵌合抗体衍生物，即，组合非人动物可变区与人恒定区的抗体分子。嵌合抗体分子可以包括，例如来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的抗原结合结构域，与人恒定区。还可以使用常规方法产生包含识别N-结构域的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体(参见例如，Morrison 等(PNAS 81 :21，6851-6855，1984)，和 Takeda 等(Nature 314 :452-454)，和Cabilly等的专利，美国专利号4, 816, 567 ；Boss等，美国专利号4, 816, 397 ；Tanaguchi等，欧洲专利公开号EP171496 ;欧洲专利公开号0173494，英国专利GB 2177096B)。与本文所述CEA N-结构域特异性反应的单克隆或嵌合抗体还可以通过产生人恒定区嵌合体进一步人源化，其中部分可变区，特别是抗原结合结构域的保守构架区，是人源的并且仅高变区是非人源的。此类免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的技术产生，(例如 Teng 等 (1983)Proc. Natl. Acad. Sc1. 80 :12，7308-7312)，Kozbor 和 Roder(1983)Immunology Today 4 :3, 72-79 ;01sson 等(1982)Methods in Enzymol. 92, 3-16, PCT 专利申请公开号W092/06193和EP专利申请公开号0239400)。人源化抗体还可以商业化生产(Scotgen Limited, 2HollyRoad, Twickenham, Middlesex,英国)。还可通过对在细菌中表达的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库筛选从编码CEA N-结构域的核酸分子产生的肽，产生与CEA N-结构域反应的特异性抗体或抗体片段。例如，可以使用噬菌体表达文库在细菌中表达完整Fab片段、VH区和FV区(参见例如 Ward 等(1989)Nature 348 :544-546, Huse 等(1989)Science 246 :4935，1275-1282，和McCafferty 等(1989)Nature 348,552-555)。还可以使用DNA免疫制备抗体。例如，包含编码CEA N-结构域的核酸的表达载体可以注射入适宜的动物，例如小鼠中。因此，蛋白质将体内表达并且抗体将被诱导。可如上对于蛋白质免疫所述，分离和制备抗体。本公开还提供抑制表达癌胚抗原(CEA)的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。还提供有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子用于在需要其的动物或细胞内抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的用途。还提供有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子在制备用于在需要其的动物或细胞内抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的药物中的用途。甚至还提供用于在需要其的动物或细胞内抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的有效量的CEAN-结构域或编码N-结构域的核酸分子。本文还提供抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体。还提供有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体用于在需要其的动物或细胞内抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的用途。还提供有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEAN-结构域特异性抗体在制备 用于在需要其的动物或细胞内抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的药物中的用途。甚至还提供用于在需要其的动物或细胞内抑制表达CEA的肿瘤细胞生长的有效量的CEAN-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体。短语“抑制表达CEA的肿瘤生长”如本文所使用指使肿瘤细胞生长减慢和/或杀死肿瘤细胞。在一个实施方案中，肿瘤细胞通过补体介导的溶解或者通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)被杀死。本文还提供治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的方法，该方法包括施用有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本公开还提供有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的用途。还提供有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子在制备用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的药物中的用途。还提供用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的有效量的CEA N-结构域或者编码N-结构域的核酸分子。本文还提供治疗具有CEA-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的方法，该方法包括向需要其的动物或细胞施用有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体。本公开还提供有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的用途。还提供有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体在制备用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的药物中的用途。还提供用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者增加的所述癌症风险的受试者的有效量的CEA N-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体。术语“施用N-结构域”包括向动物或向细胞体外或体内施用蛋白质以及施用编码蛋白质的核酸序列两者。术语“施用”还包括施用表达蛋白质的细胞。本文所述的N-结构域可以体内或间接体内施用至细胞，然后施用细胞。例如，细胞用编码本文所述蛋白质的核酸转化或者转导，然后体内施用该细胞。术语“治疗”如本文所使用意思是指向受试者施用治疗有效量的本公开组合物并且可以由单次施用构成，或者备选地包含一系列应用。如本文所使用，并且如本领域充分理解，“治疗”还是用于得到有益或希望结果，包括临床结果的方法。有益或希望的临床结果可以包括，但不限于，缓解或改善一种或更多种症状或病症，减小疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病扩散、延缓或减慢疾病进展、改善或减轻疾病状态、和缓解(不论部分还是全部)，不论是能检测到还是不能检测到。“治疗”还可指与不接受治疗的期望生存相比生存延长。本文所述的更多任一治疗方法或用途可以设计成单独或与其他试剂或疗法同时施用。“治疗”还可包括预防疾病发作。 术语“受试者”或者“动物”如本文所使用包括动物界所有成员，包括哺乳动物，适宜地是人，包括患者。术语“增加的癌症风险”如本文所使用意思是指受试者具有比人群的平均风险更高的发展成特定癌症的风险。受试者可以因为先前已经具有所述特定癌症或者具有所述特定癌症的遗传风险因素而具有更高的风险。在另一实施方案中，CEA-相关癌症是由表达CEA的肿瘤细胞引起的癌症。在一个实施方案中，癌症是胃肠道癌症、乳腺癌症、肺癌症、结直肠癌症、胰脏癌症、雌性生殖道如宫颈、卵巢或子宫癌症、神经母细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤、皮肤恶性肿瘤或者甲状腺髓样癌。在另一实施方案中，本文所述的方法和用途还包括共施用第二 CEA结构域。在一个实施方案中，本文所述的方法和用途还包括共施用或者使用A3B3IgC-样结构域或其截短形式。在一个实施方案中，A3B3IgC-样结构域是人的并且包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6的核酸序利编码(见表2)。在又一实施方案中，本文所述的方法和用途还包括使用或施用佐剂。如本文所述，有代表性的佐剂包括但不限于，弗氏佐剂、铝盐、鲨烯、poly1:C、poly1:C LC、四醚脂质体、病毒体、微粒体、OMP制剂、Titer Max佐剂制剂、ISCOMs, GM-CSF, SB-AS2、Ribi佐剂系统、Gerbu佐剂、CpG和单磷酰脂质A。在一个实施方案中,佐剂是poly1:C。在另一实施方案中，佐剂是poly1:C LC0在所有上述治疗应用中，蛋白质可以作为蛋白质或者作为编码蛋白质的核酸分子施用。在一个实施方案中，如上面所述，因为向生物体施用编码蛋白质的核酸而发生蛋白质的表达。因此，蛋白质将在生物体中内源性产生，而不是以蛋白质形式施用。治疗可以在生物体的胚胎期进行，以致于生物体的生殖细胞包含蛋白质核酸，导致产生转基因生物体，或者在向特定体细胞发育的后期进行，以致于仅特定组织或者部分组织包含蛋白质核酸。用于核酸治疗的技术是本领域众所周知的，用于产生转基因生物的技术也是如此(CarlA. Pinkert. Transgenic Animal Technology A Laboratory Handbook (转基因动物技术实验室手册).Academic Press ;第 I 版(1994))。应当理解，在基因治疗中施用蛋白质核酸会采用数种形式，它们全部包括在本公开的范围内。编码蛋白质的核酸可以以如此方式施用以致于向细胞或生物体的基因组中加入蛋白质核酸。例如，施用处于导致蛋白质表达增加的启动子控制下的编码蛋白质的核酸，导致核酸整合进入细胞或者生物体的基因组中，以致于使蛋白质水平增加。用于治疗应用的适宜表达运载体和载体的构建将取决于待治疗的生物体和基因治疗目的。适宜启动子和其它调节DNA的选择将根据已知原理，基于许多种已知基因治疗技术进行。例如，反转录病毒介导的基因转移是用于治疗的非常有效的方法，因为利用包装缺陷病毒的系统使得可以产生仅感染一次的重组体，因此避免将野生型病毒引入到生物体内。备选的治疗方法包括非病毒转移方法，例如磷酸钙共沉淀，机械技术，例如微注射，通过脂质体的膜融合介导的转移，以及直接DNA摄取和受体介导的DNA转移。测定法本发明人已经利用 先前在Tiscornia等,2006中描述的表达萤火虫萤光素酶和GFP的修饰MC38. CEA细胞系来测量CEA嗜同性相互作用。因此，本公开还提供用于鉴定CEA-介导的嗜同性相互作用的抑制剂的体外筛选测定法，该测定法包括将MC38. CEAluc细胞与不发光M38. CEA细胞单层在测试化合物存在情况下孵育；和通过定量由粘附的MC38.CEAiue细胞发出的生物发光信号评价细胞粘附，其中与对照相比生物发光降低表明测试化合物是CEA-介导的嗜同性相互作用的抑制剂。术语“对照”如本文所使用指缺乏测试化合物的细胞。对照还可以是数值的预定标准或者参考范围。上面公开概括性地描述了本公开。通过参考下列具体实施例可以达到更完全的理解。这些实施例仅以例证的目的描述并且不旨在限制本公开的范围。形式改变和等效取代考虑作为可能提示或赋予有利性的情况。虽然本文已经采用了专门的术语，但是此类术语旨在是描述性意义上的并且不用于限制的目的。下列非限制性实施例例证本公开
实施例实施例1 :折叠rCEA模块的产生图1小组B和C显示目前从大肠杆菌表达和纯化的不同rCEA构建体。通过优化表达和纯化方案，达到了纯化蛋白质的高产率，有代表性地从使用N1-NTA琼脂糖珠的单一聚组氨酸亲和层析步骤纯化IOmg可溶重组蛋白每IOOml培养物。在变性条件下将CEA结构域纯化至同质。最初测试N结构域与自身之间以及与A3B3结构域之间的相互作用以证实正确折叠。其余的CEA模块(图1小组B和C)也被表达并且使用基于ELISA的结合测定法证实它们不与N结构域结合。图2A显示N结构域与自身，与A3B3或A3结构域的特异性结合，但是不与其它CEA结构域或TNF-a (无关蛋白质对照)结合。所观察到的结构域相互作用通过钓馆(pull-down)测定法证实，由此使用8M尿素将非标签化的N结构域从以His-标签化的rCEA N、A3或A3B3模块包被的磁性N1-NTA珠释放出；但是没有从以His-标签化的TNF-a包被的珠释放出(图2B)。最后,使用CEA介导的细胞间聚集测定法[Benchimol等，1989, Zhou等，1993]并且测试可溶性rCEA结构域是否可以使悬浮的HT-29人结直肠腺癌细胞解聚。图2C显示加A N、A3B3或A3结构域后抑制CEA介导的相互作用，但是TNF- a不抑制CEA介导的相互作用。总之，这些观察证实所产生的rCEA N模块是正确折叠的并且能够介导CEA-CEA同型相互作用。表达CEA的肿瘤异种移植物的培养获得两个表达CEA的鼠细胞系(及其与CEA. Tg小鼠品系一致的CEA无效背景细胞)°从Wolfgang Zimmerman博士(Tumor Immunology Laboratory, LIFE-Center, KlinikumGrosshadern, Lud wig-Maximilians-University ;德国)获得鼠胃癌细胞系 mGC4. CEA,及其CEA阴性细胞系(mGC8)。MC38. CEA及其CEA无效背景(MC38)从Jeffrey Schlom博士 (Laboratory of Tumor Immunologyand Biology, National Cancer Institute, NIH ；Bethesda，马里兰)获得。CEA表达谱分析显示mGC4. CEA是低表达细胞，而MC38. CEA是高表达细胞。此外，发现两个细胞系均以与HT-29细胞相似的方式对加入N、A3、和A3B3模块后CEA介导的细胞间聚集的抑制敏感(图2C)。CEA. Tg小鼠群体的建立CEA. Tg 小鼠从 Wolfgang Zimmerman 博士(Tumor Immunology Laboratory,LIFE-Center, Klinikum Grosshadern, Ludwig-Maximilians-University ;德国)获得。通过CEA阳性动物与C57BL/6小鼠回交产生CEA阳性动物幼仔。然而，在产生大量该小鼠品系中遭遇挑战，因为该小鼠品系繁殖率较低并且CEA阳性后代较少。虽然如此，成功维持了稳定育种计划，其中25-33%的后代为CEA阳性幼仔，产仔数范围4-6只(与1_3只相比)。工程改造突变体rCEA N结构域以作为候选疫苗原进行测试最初，考虑了注射用GalNAc 0_糖基化的rCEA模块。为此目的，工程改造了保留所有推定的免疫显性表位以及负责介导其同型粘附特性的序列的突变体rCEA N-结构域(图3)。在充分测试之后，发现人CEA整合有I (±2)个GalNAc基团。尽管如此，测试了缺乏GalNAc基团的突变体CEA N结构域在CEA. Tg小鼠中克服对CEA的无免疫反应性的有效性。测试rCEA治疗潜力在已经满足两个主要的前提(即产生折叠的rCEA模块和建立CEA. Tg小鼠模型)后，开展免疫试验以确定在CEA. Tg小鼠中克服对CEA免疫耐受的可行性。此外，需要确定用N结构域进行免疫是否会干扰所植入的MC38. CEA肿瘤异种移植物的生长。为此，24只12周龄CEA. Tg小鼠再分成3个组，每组8只动物。一个组留作未处理对照组,一组动物接受WT CEA N结构域，而最后一组接受突变体CEAN结构域。向每一动物皮下植入50万(5X105)个MC38.CEA细胞。在异种移植物植入后第6和13天，小鼠接受腹膜内注射与lOOiipoly1:C混合的IOOiig rCEAN结构域。Poly1:C用作佐剂是因为它能够刺激B细胞活化[Scher等，1973]以及通过TLR-3/7信号传导刺激I型应答[Barchet2008]，已经证明这种免疫应答组合正面影响小鼠和临床试验中保护性的抗肿瘤免疫应答的发展[BarChet2008]。过去尚未报导纯化的人CEA的固有抗原性。因此，使用了腹膜内注射途径，因为传统上特定抗原的免疫原性在通过腹膜内注射施用之后确定[Garvey等，1983]。图4A显示免疫和对照CEA. Tg小鼠中肿瘤体积进展。在植入5 X 105MC38. CEA细胞的对照小鼠中，在7至14天内，100 %的对照小鼠中出现了发展成彡750mm3的肿瘤体积。尽管如此，观察到在腹膜内注射无内毒素WT和突变体rCEA N结构域之后肿瘤生长明显迟延(图4A)。该疫苗制剂(N结构域+poly1:C)的作用在25%的接受任一 Ag的动物中是显著的，因为在注射后观察到肿瘤体积显著降低(图4A)。此外，注射该制剂没有产生明显的毒性/病理学体征。最后，腹膜内施用rCEA N结构域明显改善存活率(图4B)。重要的是，概括来说尽管MC38. CEA肿瘤异种移植物具有侵袭性生长，但是植入该细胞系没有杀死动物。然而，在肿瘤生长部位出现溃疡和/或肿瘤直径> 15mm的动物按照机构动物管理伦理指导原则处以安乐死。总之，这些发现表明，腹膜内注射无内毒素WT或突变体rCEA N模块与poly1:C克服了对CEA的免疫耐受并且有效地显著降低肿瘤生长。测试rCEA的预防潜力在干扰肿瘤转移进程方面充分讨论了基于CEA的疫苗。在已经观察到基于CEA的免疫对延缓肿瘤生长的作用之后，还对确定疫苗是否具有阻止表达CEA的肿瘤细胞种植的预防潜力产生兴趣。照此，24只12周龄的CEA. Tg小鼠再分成3个组，每组包括8只小鼠。两个组接受无内毒素rCEA WT或突变体N结构域，或留作未处理对照(图5)。最后一次免疫步骤后4天，5 X IO5 个MC38. CEA细胞作为异种移植物皮下植入，并且用测径器测量肿瘤生长。尽管免疫没有阻止所植入肿瘤异种移植物种植，但是它显著延缓了肿瘤异种移植物的生长(图5B)并且以像用CEA疫苗制剂治疗性施用所观察到的那样(图4)的方式显著延长存活(图5C)。引起的CEA-特异性免疫应答的表征依据观察到的肿瘤延缓，分析了内在的免疫学机制。为此，12周龄小鼠再分成4组使用图5A中概括的方案以无内毒素WT或突变体rCEA N结构域对两个组的4只CEA.Tg小鼠进行免疫；使用图5A中概括的方案以WT rCEA N结构域对一组2只C57BL/6小鼠进行注射，并且最后未免疫的对照组包含4只CEA. Tg小鼠。在最后一次免疫后4天，处死动物并收集血液和脾脏以分析免疫应答相关物。细胞应答从免疫和对照小鼠收集脾脏白细胞，悬浮至IO6个细胞每mL的终密度并且以伴刀豆球蛋白A (ConA ;5 y g每mL ； Sigma-A I dr ich)、人CEA的全长肿瘤糖形(I y g每mL ;Sigma-Aldrich)、rCEA WT N结构域(lug每mL)进行间接体内刺激或者留作未刺激对照。采集后的细胞活力> 95%。使用来自免疫和对照小鼠的脾细胞开展细胞因子ELISP0T以监测CEA-特异性IFN-Y、IL-1O和IL-4斑点形成单位(SFU)的频率，以便确定疫苗诱导的Th极性。源于未免疫CEA. Tg小鼠的细胞(被称为未免疫小鼠)没有响应于CEA的抗原性刺激产生任何上述细胞因子，但是在用ConA进行促有丝分裂刺激后产生了上述细胞因子(图6)。相反，CEA-免疫的C57BL/6小鼠响应于抗原刺激产生全部三种细胞因子(图6)，虽然以较低水平产生，这与Woo等[Woo等，2008]的观察相一致。以WT rCEA N结构域免疫的CEA. Tg小鼠在用rCEA N结构域或FL-CEA刺激后产生相等水平的IL_4、IL-1O和IFN- Y SFU (图6)，而以突变体rCEA N结构域免疫的CEA. Tg小鼠产生IL-4和IL-10，但不产生IFN-Y (图6)。在包含这些实验组和使用CEA的两种形式(重组体和肿瘤糖形)的所有动物中观察到Ag-特异性细胞因子产生的这种差异。与这些观察相一致，观察到源于免疫和对照小鼠的脾细胞响应于抗原刺激的增殖较小或者没有增殖，由此表明通过该免疫策略对T细胞的刺激较小。体液应答由于所观察到的CEA-特异性细胞因子表达谱像Th2免疫应答的那样，所以分析了免疫和对照动物的血清中CEA-特异性抗体的存在。在间接ELISA中使用WT rCEA N结构域作为捕获抗原，检测到高水平的rCEA-特异性IgG血清抗体(图7)。对CEA-特异性IgG亚类的分析显示存在高水平的CEA-特异性IgGl抗体和一些IgG2a (图7)。有趣地是，以WTN结构域免疫的CEA. Tg和C57BL/6小鼠中产生的相对更高水平的CEA-特异性IgG2a(图
7)与这些动物产生的IFN-y有关(图6)。最后，对CEA-特异性IgGl抗体的刺激使得本发明人提出一个问题，即它们是否会干扰CEA介导的细胞间粘附事件或者通过补体介导的溶解或者通过抗体依赖细胞毒性(ADCC)而介导对肿瘤细胞的杀伤。将MC38. CEA细胞与来自疫苗接种小鼠的血清孵育没有导致CEA介导的细胞间聚集显著减少；而是它进一步增强了聚集体形成。这种结果并不意夕卜，因为多克隆抗体与它 们的同源抗原(作为颗粒性抗原递呈)的共孵育导致Ag-Ab网格形成。为了研究疫苗刺激的抗体在介导补体依赖的溶解中的效力，将MC38. CEA细胞与兔补体(I 100稀释)和来自免疫或者对照动物的血清(I 100稀释)孵育。当细胞与补体和来自免疫的CEA. Tg或C57BL/6小鼠的血清共孵育时观察到显著的溶解(图8)。另一方面，MC38. CEA细胞与补体和来自未免疫(正常)小鼠的血清孵育没有导致细胞溶解(图8)。总之，开发的蛋白质表达和纯化方案可以产生能够介导同型相互作用以及干扰CEA介导的细胞间粘附的正确折叠的CEA结构域。第二，疫苗制剂和注射途径足以克服CEA.Tg小鼠中对CEA的免疫耐受。虽然引起的免疫应答似乎主要是体液应答(TH2)，但是它的确导致抑制侵袭性极强的肿瘤异种移植物的生长。实施例2:材料与方法rCEA模块的克隆、表达与纯化人CEA cDNA 可读框购自 Genecopoeia Inc (GermanTown, MD)并且用作克隆模板。使用 CEA-N 正向引物(5，-GCGATA CAT ATG CAT CAT CAC CATCAC CAT GAA AAC CTC TATTTC CAA AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACGCCG TTC AAT-3，) (SEQ ID NO 8)和 CEA-N 反向引物(5，，-GTC CTG AGTGGA TCC CTC GAG CTA GGT GAA GG CCA CAGC-3”)(SEQ IS NO 9)扩增包含N-末端His-标签和TEV切割位点的CEA N结构域(氨基酸1-132)。通过使用FLAG-N正向引物(5，-CCCAT ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CATCAT CAC AGC AGC GGC GACTAC AAG GAC GAC GAT GAC MG AAGCTC ACT ATT GM TCC ACG CCG TTC AAT GT-3’)(SEQID NO: 10)和 FLAG N 反向引物(5”-GIT CAG ATT TTC CCC CTC GAG CTA AGA TGTGTT TAGAGG GGA AAT GGT GGG GGC ATC CGG-3”)(SEQ ID NO : 11)，将FLAG表位融合至由残基 1-214组成的重组CEA结构域的His-标签/TEV切割位点，产生FLAG-标签化的rCEA N。发现在C-末端包含额外的CEA残基会改善构建体的稳定性并增加其产率。CEA A3B3结构域(残基445-656)包括 C-末端 His-标签并且使用 A3B3 正向引物(5，-TATACC CATATG GCC AAT AACTCA-3，) (SEQ ID NO 12)和A3B3反向引物(5”_CTA TAT CTC GAG TCA ATG GTG ATGGTG ATGGTG ATG GTG GCC GAC AGT GGC CCC AGC TGA GAG ACC-3”)(SEQ ID NO :13)产生。将 PCR扩增子亚克隆进入pET30b (Novagen ；Gibbstown, NJ)的NdeI和XhoI限制位点之间，并将构建体转化进入大肠杆菌菌株BL21 DE3Star (Invitrogen ;0ntario,加拿大)中。通过将转化的细胞在添加有卡那霉素(75iig/mL)的Lauria Bertani (LB)肉汤中于37°C生长至0. 5的光密度(0D_J，然后在24小时的时期内于37°C以ImMIPTG诱导蛋白质表达，实现rCEA模块的表达。通过离心(8，OOOg, 15分钟，4°C )收集细胞沉淀，然后重悬并在包含溶菌酶(100U每mL ；Sigma-Aldrich ；Ontario,加拿大)和Benzonase核酸酶(1U 每 mL ;Novagen)的 1% Triton X-100, 25mM Tris (pH 8), 150mM NaCl 中溶解。通过离心(25，OOOg ；4°C ；20分钟)将包含所表达rCEA结构域的包涵体沉淀并将所得到的沉淀重悬于8M尿素，25mM Tris (pH8), 250mM NaCl和IOmM P -巯基乙醇中。然后将悬浮液重新沉淀并且收集包含溶解的His-标签化rCEA蛋白质的上清液并直接加载到N1-NTA琼脂糖柱(Sigma-Aldrich)上。在变性条件下纯化rCEA模块，其中使用包含8M尿素，25mM Tris,pH 8,250mM NaCl，IOmMP -巯基乙醇和5mM咪唑的缓冲液将污染蛋白质洗掉。所结合的重组CEA模块使用8M尿素，25mM Tris, pH 8，250mM NaCl，IOmM ^ -巯基乙醇和50mM咪唑特异性洗脱。通过针对包含50mM Tris, pH 8. 0，150mM NaCl和IOmM ^ -巯基乙醇的缓冲液进行超滤将包含纯化的rCEA蛋白质模块的级分浓缩。通过将15mg纯化rCEA N结构域在补充有250 ii g重组烟草蚀纹 病毒(rTEV)蛋白酶的50mM Tris (pH 8), 150mM NaCl, ImM DTT和ImM EDTA中于室温孵育20小时，将His-标签亲和性臂从纯化CEA模块中去除。通过将切割的蛋白质溶液经过N1-NTA琼脂糖柱实现所切割的rCEA N结构域(残基1-132)与释放的亲和性标签、rTEV和未切割的His-标签化蛋白质的分离。通过SDS PAGE监测切割程度和最终重组产物的纯度。为了疫苗接种的目的，通过将所纯化蛋白质的溶液经过Detoxigel柱(Pierce,Thermo Scientific, Ontario,加拿大)UrCEA N结构域制剂中去除内毒素污染。最终产物储存于4°C直到进一步使用。免疫沉淀测定通过与以I y g mAb Coll (对CEA N结构域具有特异性的小鼠IgGlmAb ；Invitrogen)或者同种型对照抗体包被的磁性蛋白A珠(New England Biolabs ；Pickering, Ontario,加拿大)混合开展rCEA N和A3B3复合体的免疫共沉淀。然后将包被珠与ImL包含I ii M每一模块的溶液混合。结合的复合体通过SDS-PAGE分离并通过考马斯染色显色。通过ELISA测量CEA同型相互作用使用酶联免疫吸附测定法(ELISA) [Madrid等，2004]评价FLAG-标签化rCEA N与rCEA N、rCEA A3B3或CEA的全长肿瘤糖形的结合。简言之，96-孔平底Falcon微量滴定板(Becton-Dickinson Biosciences ；Franklin Lakes, NJ)以 2 u g 纯化 CEA 模块或全长 CEA每孔包被。在用包含Tween(0. 05% v/v)和牛血清白蛋白(l%w/v)的PBS封闭之后,然后将平板与在PBS-Tween (0. 05%；100uL)中稀释的增加浓度的FLAG-标签化rCEA N于室温孵育I小时。通过将平板与辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗FLAG单克隆抗体M2 (I 5,000稀释；Sigma-Aldrich)于室温孵育I小时检测结合的FLAG-标签化rCEA的存在。使用生色HRP底物3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB ；Sigma)在450nm下测量结合的FLAG-标签化N结构域的量。细胞系和生长条件表达CEA的人癌细胞系BxPC-3 (ATCC号CRL-1687，人胰腺腺癌)，HT-29 (ATCC号HTB-38 ;人结直肠腺癌)和MCF-7(ATCC号HTB22 ;人乳腺腺癌)用于监测它们在源于疫苗接种小鼠的血清存在下对补体依赖细胞毒性(CDC)的敏感性。鼠结肠癌MC38.CEA和MC38细胞由 Jeffrey Schlom 博士 (National CancerInstitute ;Bethesda,马里兰)惠赠。在 CDC研究中使用人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC号CCL-2)作为CEA—细胞。所有细胞均于37°C，5. 0% CO2，在补充10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和双氢链霉素(100 u g/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。如先前所述[Tiscornia等，2006]，共表达萤火虫萤光素酶和绿色荧光蛋白的双顺反子慢病毒载体用于产生稳定转染的产生萤光素酶的MC38. CEA(MC38. CEAuig)细胞。简言之，通过将编码包装和包膜PCMV的质粒pHR2和质粒VSV-G共转染HEK-283T细胞用于产生编码LUC/GFP(luc+gfp+)的慢病毒。来自产生细胞的上清液用于在聚凝胺(IOii g/mL;Sigma)和硫酸鱼精蛋白(IOii g/mL; Sigma)存在下转导MC38. CEA细胞。转染之后，将细胞进行两次高GFP表达分选。将存活集落扩增并通过Xenogen IVIS光谱(Caliper LifeSciences ；Hopkinton, MA)进行生物发光筛选和通过免疫印迹进行CEA表达筛选。动物作为转基因(CEA. Tg)的表达人CEA的种畜小鼠对由Wolfgang Zimmerman博士 (Tumour Immunology Laboratory, LIFE-Center, Klinikum Grosshadern,Ludwig-Maximilians-University ;德国)惠赠。通过CEA-阳性动物与亲本C57BL/6小鼠[Neckel等，2006]回交产生CEA-阳性幼仔。通过PCR证实CEA. Tg小鼠的基因型[Nockel等,2006]。在安大略癌症研究所(the Ontario Cancer Institute)动物房的标准无病原体条件下培育和维持转基因动物以及C57BL/6小鼠。所有实验经当地动物福利委员会批准并按照加拿大动物管理委员会规章制度(the rulesand regulations of the CanadianCouncil for Animal Care)开展。免疫和肿瘤攻击对于肿瘤植入后的免疫，12-16周龄CEA. Tg小鼠后足皮下(s. c)接受2. 0X IO5个MC38.CEA细胞。然后将所有动物随机再分成三个组。一组CEA. Tg小鼠不处理(未免疫组)，而第二组接受仅IOOyg poly1:C的腹膜内剂量(1. .)(此后称作佐剂)。最后一组动物腹膜内施用与IOOiIg poly1:C混合的IOOiI g无内毒素rCEA N结构域(此后称作免疫的)。动物在肿瘤植入后第13天最初免疫并且在第20和28天加强免疫。对于肿瘤植入前的免疫，在第I天通过腹膜内注射与IOOii g poly1:C混合的100 i! g无内毒素rCEA N结构域将CEA. Tg小鼠最初免疫，接着在注射后第3和10天用50 y g无内毒素rCEA N结构域和IOOiig poly1:C构成两次腹膜内加强免疫。筛选来自CEA. Tg小鼠的血清中的抗CEA IgG抗体并且在以后的肿瘤攻击实验中仅包括应答者小鼠(免疫小鼠中80-90%的小鼠)。在第28天对于腹膜侵袭研究腹膜内植入MC38. CEAluc肿瘤细胞或者对于肺定植研究静脉注射(尾静脉)MC38. CEAluc肿瘤细胞。肿瘤生长和肿瘤负荷的监测皮下植入的肿瘤的长度和宽度用测径器测量。使用下列公式计算肿瘤体积体积mm3 = ((X2Xy)/2)。为了计算肺肿瘤结节，福尔马林固定的肺标本用石蜡包埋，在三个不同的深度上切片，并且4 iim切片用苏木精和伊红(H&E)染色。使用Aperio载玻片扫描仪和ImageScope软件(Aperio Technologies Inc ；Vista, CA)记录染色载玻片的图像并分析肿瘤病灶。通过腹膜内 注射萤光素(100iiL;100mM)和使用Xenogen IVIS光谱(CaliperLife Sciences ；Hopkinton, MA)在第1、3和8天记录从CEA. Tg小鼠腹膜区发射出的发光信号，监测植入到腹腔内的MC38. CEAluc肿瘤细胞的生长和扩散。在肿瘤植入后第35天，将动物处以安乐死，切开并通过测量所形成肿瘤结节的数量和大小评价它们的肿瘤负荷。白细胞的制备和培养在处以安乐死之后，无菌性地从疫苗接种CEA. Tg小鼠取出脾脏。然后通过轻轻地迫使器官经过100 细胞过滤器(Falcon)收集脾脏白细胞。然后将所得到的细胞悬液用补充有青霉素(100U/mL)，链霉素(100 u g/mL)和I % FBS的冷RPMI洗涤三次。收集之后的细胞活力有代表性地为> 95%，如使用台盼蓝染料排除测定法所确定。将这些白细胞以I X IO6个细胞每mL的密度悬浮于添加有青霉素(100U/mL)、链霉素(100 y g/mL)、2mM L-谷氨酰胺、ImM HEPES、0. 05mM ^ -巯基乙醇和10% FBS的RPM1-1640中并维持于37°C，增湿的5. 0% CO2气氛中。CEA-特异性细胞免疫的分析来自免疫和对照小鼠的脾细胞用伴刀豆球蛋白A (ConA ;5 ii g每mL ;Sigma-Aldrich)、人 CEA 的全长肿瘤糖形(I U g 每 mL ； Sigma-A I dr ich)、rCEA WTN 结构域(ly g每mL)进行间接体内刺激或者留作未刺激对照。分泌CEA-特异性细胞因子的细胞的定量使用 IFN-Y、IL-10 和 IL-4ELISP0T 测定试剂盒(R&DSystems ;Minneapolis，MN，美国)开展。使用自动化ELISP0T平板计数器(CellularTechnologies Inc ；Shaker Heights,0H)计算斑点。如先前所述[Abdul-Wahid和Faubert, 2007],通过从来源于测试条件下的测量值中减去背景值(从包含未刺激细胞的孔计算)计算分泌CEA-特异性细胞因子的细胞的频率。通过ELISA检测CEA-特异性抗体如先前所述[Abdul-Wahid和 Faubert，2007]，通过 ELISA 分析在 CEA. Tg 小鼠中产生的并且针对CEA N结构域的抗体应答。简言之，96-孔微量滴定ELISA板(Falcon)用I U g每孔的rCEA N结构域包被。源自免疫或对照小鼠的血清在1% BSA-PBS-EDTA(25mM)中连续稀释并于室温下轻轻摇动孵育I小时。在用PBS-Tween(0. 05% )洗涤平板之后，将孔于室温接触HRP-偶联抗小鼠IgG、IgGl或IgG2a次级抗体溶液(在0. 5% BSA-PBS-EDTA中稀释；1: 5，000 ;BethylLaboratories !Montgomery, TX) I 小时。然后洗漆平板并使用TMB作为底物显色。使用一半体积的0. 5M H2SO4停止显色反应并在450nm下测量吸光度读数。淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的产生当收集细胞用于ADCC测定法时,如先前所述[Nishimura等,2008],通过以重组鼠IFN- y (1000U 每 mL ；Pepprotech Inc ；Rocky Hill, NJ)和 IL-2 (250 U 每 mL ；PepprotechInc)刺激来源于CEA. Tg小鼠的脾脏白细胞48小时，接着每3天进行一次IL-2处理直到第10天，产生淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。抗体依赖细胞毒性分析通过在LAK细胞(3 I效应器与靶标比率)或者外源性补体(I 250稀释；Cedarlane laboratories ;Burlington, Ontario,加拿大)存在下，将MC38. CEAlug 细胞与从免疫的、佐剂处理的或者未免疫的小鼠得到的血清(I 250稀释)孵育，开展通过补体依赖细胞毒性(CDC)或者抗体依赖细胞毒性(ADCC)对肿瘤细胞的抗体介导杀伤分析。在于37°C孵育3小时之后，通过向MC38. CEAuig靶细胞中加入萤光素并使用Xenogen IVIS成像系统(Caliper Life Sciences Inc. ；Hopkinton, MA)记录相对发光信号，评价细胞活力。对CEA介导的细胞粘 附的抑制于37°C将MC38. CEAuig细胞与来自免疫的或者对照CEA. Tg小鼠的血清(I 250稀释)混合15分钟。然后将细胞悬液加入到接种有汇合的MC38. CEA单层的多孔板中，并于37°C孵育2小时。洗掉未结合的细胞，并且如先前所述通过使用Xenogen IVIS光谱成像系统(Caliper Life Sciences ；Hopkinton,MA)测量它们的发光确定结合的MC38. CEAlug细胞的存在。通过在用血清处理MC38. CEAluc细胞之前将来自免疫CEA. Tg小鼠的血清与I y MrCEA N结构域混合并开展细胞粘附测定法，确定嗜同性细胞间相互作用对CEA N结构域的特异性。淋巴细胞的过继转移为了研究淋巴细胞在阻止小鼠腹腔内产生肿瘤结节中的作用，将来自免疫CEA.Tg小鼠的全部脾脏淋巴细胞或者纯化的B细胞注射入未受免疫的受体CEA. Tg小鼠的尾静脉内。通过负选择(EasySep小鼠B细胞富集试剂盒；StemCellTechnologies, BritishColombia，加拿大)从自免疫CEA. Tg小鼠(n = 6)收集的全部脾脏白细胞的单细胞悬液纯化B淋巴细胞。特别地，将B细胞与由表面抗原CD4、CD8、CDllb、CD43、CD49b、Ly-6G(GR-1)和TERl 19所定义的其它造血来源的细胞分离。接受者未免疫小鼠接受2 X IO6个B细胞每只小鼠(相当于小鼠等效物)或4.1 X IO6个脾脏淋巴细胞。3天后，将2.0X105个MC38 CEALue 细胞植入到处理的小鼠的腹腔内。如先前所述监测肿瘤植入后前21天的MC38. CEAluc细胞增殖和肿瘤结节发生。使用高免疫血清被动免疫在最后一次加强注射(免疫后第11天)后I天从免疫的CEA. Tg小鼠(n = 6)收集血清，混合并用PBS稀释(I 10)，过滤除菌并储存于-20°C直至使用。如先前所述通过ELISA证实CEA N结构域-特异性血清抗体的存在。在第_5至3天和第10至17天将血清样品(200 yL)腹膜内注射入未受免疫的CEA. Tg小鼠(n = 5)中。在第0天，将2. 0X IO5个MC38. CEAluc细胞植入到腹腔内并且如上所述监测肿瘤发生。统计学和数据分析通过ANOVA分析收集的数据集的显著性并且使用Student-t-检验比较各个组。所有统计学分析和图表使用PRISM(版本5. 01 ；Graph Pad Software forScience,San Diego,CA)进行。P值彡0. 05认为具有显著性。结果参与同型结合的重组CEA结构域的表达产生能够阻断CEA的细胞粘附特性的免疫应答需要产生参与此类相互作用的CEA的各个Ig-样结构域。在过去已经证明CEA的N和A3B3结构域彼此相互作用，导致CEA分子同型结合[Zhou等，1993]。在该实施例中，这些结构域在大肠杆菌中分开表达、纯化并且在测量它们的同型结合的三种不同测定法中证实了它们的折叠状态。具体地，在酵母2-杂交测定法中，各个N和A3B3结构域作为与Gal启动子互补结构域的融合构建体表达，其中它们的相互作用导致酵母存活(图18) [McCluskey等，2008]。第二，以mAb Coll (对CEA N结构域具有特异性)包被的蛋白A磁性珠用于特异性地沉降单独的rCEA N结构域或者沉降rCEA N结构域和rCEA A3B3,由此证实两个结构域在溶液中的确形成复合体(图9A)。最后，通过ELISA[Madrid等，2004]显示rCEA N结构域与rCEAA3B3片段或来源于肿瘤细胞的野生型全长CEA形成具有相当紧密的复合体(图9B)。通过ELISA还观察到包括自身结合的N结构域的较弱的相互作用对(图9B)。
理论上，在针对对抗CEA介导的细胞聚集事件的疫苗接种策略中，IgV-样N-和IgC-样A3B3片段均表现为适宜的免疫原。然而，CEA N结构域提供优于CEA内所有其它IgC-样结构域的两个额外的优点。它整合有PELPK基序(残基108-112) [Samara等，2007]，该基序显示介导将CEA-阳性肿瘤细胞植入肝脏中。所引起的针对该结构域的免疫应答会阻断该基序的呈递并且因此阻断其在远隔器官处肿瘤植入中的作用。第二，IgV-样N结构域缺乏半胱氨酸残基并且其蛋白质折叠不需要二硫键的存在，CEA的所有其它IgC-样结构域也如此，这是设计稳定的正确折叠免疫原的有用特征。在产生针对癌胚抗原的有用免疫应答中的关键挑战是CEA是自身抗原的事实，并且照这样的话，有代表性地通过中枢和外周耐受机制减弱宿主针对该抗原的免疫应答[Morse等，2008 ；Bos等，2008]。当递呈在癌症细胞上时CEA (其它相关CEACAM分子也如此)高度N-糖基化。推测通过在细菌中表达CEA单结构域(残基1-132) [rCEA N]，这种得到的N结构域将缺乏N-聚糖并且呈现出非天然的C-末端，导致展现与全长抗原相比不同的决定簇/表位组。rCEA N结构域的这些独特的结构特征将使宿主免疫系统偏离以察觉到该免疫原为改变形式的自身抗原。CEA N结构域的治疗性免疫延缓皮下植入的表达CEA的鼠肿瘤在CEA转基因小鼠模型内的生长。使用重组CEA N结构域作为免疫原的疫苗接种方案用于评价CEA. Tg小鼠中的针对CEA的免疫应答是否会干扰所植入的鼠结肠MC38. CEA肿瘤细胞的生长。具体地，2 X IO5个MC38. CEA细胞植入到CEA. Tg小鼠后足内。随后将动物再分成3个组。第一组没有用与佐剂poly1:C混合的无内毒素rCEA N的制剂进行疫苗接种(未免疫的)并且充当肿瘤生长的对照组。第二组动物接受直接施用入它们腹腔内单独的佐剂(1.P) (poly1:C;该组在此后称作佐剂组)。最后一组接受以相似的腹膜内途径给与的与poly1:C混合的无内毒素rCEA N(免疫组)。如图1OA中所示，皮下植入2xl05个MC38. CEA细胞导致在植入后12天内大多数小鼠内形成明显的肿瘤结节。在肿瘤植入后第13天，通过注射(腹膜内)与IOOyg poly1:C混合的100 u g无内毒素rCEA N结构域对小鼠进行疫苗接种并且在第20和28天加强。选择Poly1:C作为佐剂是考虑到其具有刺激B细胞活化[Scher等，1973]以及通过TLR-3/7信号传导刺激ThI应答[Barchet 2008]两者的能力，这是一种已经在小鼠和临床实验中证明正面影响保护性抗肿瘤免疫应答发展的免疫应答组合[Barchet 2008]。纯化的人CEA的固有免疫原性在过去尚未有报导。因此决定使用腹膜内途径施用，因为传统上使用该免疫途径评价抗原的免疫原性[Garvey等，1983]。如图1OB和IOC所突出，与植入到未免疫和仅佐剂处理的CEA. Tg小鼠内的肿瘤细胞相比，用rCEA N结构域疫苗接种延缓所形成的后足肿瘤的快速生长。通过预先用rCEA N结构域进行疫苗接种阻断CEA转基因小鼠内的肺肿瘤结节的定植和形成。快速消耗性局部肿瘤团块，如在后足中皮下植入鼠MC38. CEA的情况那样，代表着有代表性地通过局部手术和放射疗法治疗的肿瘤负荷[Berinstein，2002 ；von Mehren,2005]。基于CEA的抗癌症疫苗的合适用途将优选地用在靶向正在转移的细胞的辅助治疗情况中，而不是根治原发肿瘤，因为不受约束的CEA过表达似乎与肿瘤转移过程直接相关[Samara 等，2007 ；Zimmer 和 Thomas, 2001 ；Bast 等，2001 ；Molina 等，2005 ；Duffy, 2006]。在后足皮下植入MC38. CEA细胞后，在远隔器官没有观察到肿瘤转移灶。为解决后足植入模型的这种局限性，第一次用无内毒素rCEA N结构域和polyl :C腹膜内接种小鼠，并且随后静脉内施用2X IO5个MC38. CEA肿瘤细胞进行刺激，如图1lA中所概述。肿瘤注射后60天，将动物处以安乐 死并解剖以确定肿瘤结节在器官中的分布。对解剖的器官目视检查表明，大多数静脉内接受MC. 38. CEA细胞的动物在60天内在肺内发生大的肿瘤块(图1lB和11C)。在有限亚组的动物肝脏中也观察到肿瘤结节(小于未处理小鼠的5%)。来源于对照动物(未免疫和佐剂处理组)的肺组织的组织学检查(H&E染色的肺切片；n = 18 ;来自每一组的6个随机选择的肺)证实，与来自正常的年龄匹配或者免疫动物的肺相比，因为肿瘤病灶的数量和大小导致肺明显扩大(图11，小组B至E)。这些结果表明，作为免疫原施用的rCEA N结构域有效地预防肺肿瘤结节的发展。用rCEA N结构域预先疫苗接种防止腹腔内的肿瘤定植和肿瘤结节形成。已经报导表达CEA的腺癌，特别是在具有胃癌的患者的情况下，转移至腹腔[Asao等，1989]。用rCEA N结构域预接种的CEA. Tg小鼠将防止在腹腔内形成肿瘤病灶。简言之，在腹膜内植入2 X IO5个MC38. CEAluc细胞之前18天，如先前所述将动物进行腹膜内预接种(图12A)。建立MC38. CEAluc细胞系以允许在植入后这些细胞在体内的可见和扩充(作为萤光素酶产生量的量度)。如图12B中所表明，预接种CEA. Tg小鼠导致这些动物腹腔内发光信号损失。到植入后第8天，在免疫小鼠中没有检测到发光(图12B)，而在未免疫和仅佐剂处理动物腹腔内纪录到明显的发光信号(图12B)。在肿瘤植入后第35天，将动物处以安乐死，将它们的器官解剖并检查肿瘤结节的存在。在腹腔(植入部位)之外没有检测到肿瘤块。未免疫和仅佐剂处理动物已经发生大的肿瘤结节，而表现出对CEA具有免疫应答的疫苗接种动物仍然是无肿瘤的(图12C和12D)。腹膜内施用rCEA N结构域与poly1:C产生强的CEA-特异性体液应答在该实施例中使用的疫苗接种方案导致在三种不同的体内肿瘤植入模型情况下产生积极结果。为了解释负责保护的免疫学机制，将年龄匹配的CEA. Tg小鼠再分成3个组(图5A);未免疫的，仅poly1:C处理的(腹膜内)，或者用与poly1:C混合的rCEA N结构域处理的(腹膜内)。最后一次免疫步骤之后4天，处死动物并且收集它们的血液和脾脏以分析免疫应答的相关物。在分离来源于来自所有三个组的CEA. Tg小鼠的脾脏白细胞之后，首先分析CEA-特异性细胞应答的存在。白细胞用rCEA N结构域或CEA的全长肿瘤糖形(FL-CEA)进行体外刺激。不管用于刺激的抗原如何，观察到极少的白细胞增殖或者没有观察到增殖(图19)。该观察结果表明，免疫方案得到适度水平的T细胞刺激。随后通过ELISP0T测定法[Berinstein, 2002 ；Hodge等，2009 ；ffoo等，2008]测量分泌抗原-特异性细胞因子(IL-4、IL-10和IFN- y )的细胞的数量，评价CEA-特异性，Th-细胞应答的发生。未免疫CEA. Tg小鼠以及仅给与佐剂的小鼠没有刺激产生CEA-特异性细胞免疫应答，因为来源于这些动物的白细胞没有响应于rCEA N结构域或CEA的全长肿瘤糖形的抗原性刺激而分泌细胞因子(图13B)。相反，以rCEA N结构域或全长CEA肿瘤糖形刺激淋巴细胞(来源于免疫的CEA.Tg动物)得到均衡的细胞因子产生谱，如通过所纪录的分泌抗原-特异性IL-4、IL-10和IFN-Y的细胞的相等数量(作为ELISP0T测定法的斑点形成单位；图13B)所表明。随后通过ELISA分析循环的抗CEA抗体的存在。仅在来源于免疫CEA. Tg小鼠的血清中观察到高滴度的循环抗-CEA IgG抗体(图14A)。同种型分析显示高滴度的CEA-特异性IgGl和IgG2a(图14A)。这些高IgGl和IgG2a滴度在彡90%的来自独立免疫试验的个体疫苗接种动物中一致性地观察到(图14B)并且与所观察到的均衡的CEA-特异性细胞因子应答(图13B)有关。 此外，疫苗接种方案得到与MC38. CEA细胞溶解物特异性反应的抗-CEA抗体，意味着N-连接糖的存在对rCEA N-结构域-特异性血清抗体识别表位没有影响。总之，这些观察表明，免疫策略得到了由适度Th细胞应答支持的强的体液免疫应答。N结构域-特异性抗体可以介导Ab-依赖杀伤肿瘤细胞以及阻断CEA-依赖细胞间粘附事件在ADCC或补体依赖细胞杀伤测定法中首次评价了 N结构域-特异性血清抗体介导抗体-依赖细胞杀伤的能力(图15)。具体地，在LAK细胞(3 I效应器与靶标比率)或者外源性补体(I 250稀释)存在下，将MC38. CEAuig细胞与从疫苗接种的、佐剂处理的或者未处理的CEA. Tg小鼠收集的血清(I 250稀释)孵育。在于37°C孵育3小时之后，通过定量由存活MC38. CEAiue细胞发出的生物发光信号评价细胞活力。在这些条件下，显著杀伤MC38. CEAluc细胞仅在来源于CEA-免疫小鼠的血清存在下孵育时出现(图15A、B)。使用两种方法评价CEA-特异性血清抗体干扰CEA-介导的嗜同性相互作用的能力。首先，研究了疫苗引起的免疫血清干扰嗜同性细胞相互作用的能力。MC38. CEAme细胞与来自免疫或对照小鼠的血清(I 250稀释)预混合，并将所得到的悬液与不发光MC38.CEA细胞单层孵育。从由在干扰抗体存在下仍结合细胞单层的MC38. CEAluc细胞所发出的相对发光信号测量值，计算剩余的细胞粘附。用来自免疫小鼠的血清预处理MC38.
胞悬液显著减少CEA介导的细胞粘附，但是来自未接种或者仅佐剂处理的小鼠的血清不然(图15C)。由于来自疫苗接种动物的血清抗体导致的CEA介导的细胞粘附的丧失可通过在开展细胞粘附测定法之前向血清稀释液中加入I U M可溶性rCEA N-结构域完全逆转(图15C)。在使用表达CEA的细胞系观察到结果之后，在蛋白质水平研究了 CEA-特异性抗体抑制CEA同型相互作用的能力。具体而言，使用基于ELISA的蛋白质结合测定法比较，由于加入来自免疫或对照小鼠的血清所导致的对可溶性FLAG-标签化rCEA N结构域与固定化rCEA A3B3之间相互作用的抑制(图15D)。使用对于rCEA N结构域与rCEA A3B3结构域相互作用所纪录的ELISA信号作为最大结合的阳性对照信号，发现加入来自对照小鼠的血清对阻断N结构域与A3B3结构域之间的同型结合中没有作用(图15D)。相反，加入来自免疫小鼠的血清减少同型结合 60% (图15D)。总之，这些发现证明，识别rCEA N结构域的抗体的产生具有细胞毒性和阻断嗜同性粘附特性两者。被动免疫实验支持疫苗引起的抗-N-结构域抗体作为抗肿瘤定植的关键效应器机制的重要性。开展过继转移研究以解释负责赋予在疫苗接种CEA. Tg中所观察到的保护作用的效应器机制。具体而言，从免疫CEA. Tg小鼠收集血清和B淋巴细胞并过继转移至未免疫的CEA. Tg接受者小鼠。在过继转移步骤之后，以腹膜内灌注2 X IO5个MC38. CEAluc细胞激发动物。记录的未免疫CEA. Tg小鼠腹腔内MC38. CEAluc细胞的发光影像表明了肿瘤植入后第1、4和8天的肿瘤细胞扩大(图16A)。相反，3天前通过静脉内注射将脾脏来源的白细胞或者纯化的B细胞转移进入未免疫CEA. Tg小鼠，以及用免疫血清被动免疫的动物，显示出腹腔内生物发光信号以时间依赖方式消退(图16A)。在经历过继转移步骤的所有3个动物组中观察到的信号损失，与在以rCEAN结构域/poly1:C制剂预接种的CEA. Tg小鼠中观察到的8天时间观察期内的信号降低平行(图17A)。在MC38. CEAiue植入后第21天处死小鼠并且检查它们的腹腔是否早期发生肿瘤结节。在所有未处理的未免疫小鼠中容易地观察到小的肿瘤块，而在所有主 动和被动免疫的未经试验CEA. Tg组中仅一只动物出现肿瘤结节(在血清处理或者B细胞处理组中)(图17B)。这些结果支持这样的观点，即致力于产生CEA N结构域-特异性抗体的B细胞在静脉内的扩充负责所观察到的抗肿瘤植入到免疫小鼠腹腔内的保护性作用。表达CEA的人腺癌细胞系对补体依赖细胞毒性敏感为了验证所观察到的针对rCEA N结构域特异性产生的血清抗体的广谱杀细胞特性，在补体依赖细胞溶解测定法中测试了来源于3个CEA. Tg小鼠组中的每一组的血清杀死一组表达 CEA 的人肿瘤细胞的能力。CEA+(MC38. CEA、HT_29、MCF_7 和 BxPC3)和 CEA1MC38、HeLa)人癌症细胞系用补体和来自免疫或对照小鼠的血清处理，并且通过台盼蓝染料排除定量非存活细胞数量。如图17中所述，补体依赖性杀伤仅在来源于疫苗接种动物的血清存在下对于CEA+MC38. CEA、BxPC_3、HT-29和MCF-7细胞观察到，但对于CEAHeLa或MC38细胞没有观察到。补体依赖性杀伤的强度性质上与细胞系上的CEA表达程度相关(图17 ;图20)。讨论癌胚抗原(CEA)的异常过表达与癌症进展和肿瘤转移有关[Berinstein，2002 ；Samara等,2007 ;Benchimol等，1989 ;Taheri等,2000]。因此,该抗原可作为有用的临床生物标志用于监测复发和处理转移癌[Molina等，1998 ;Curigliano等，2006 ；Berinstein,2002 ；Bast等，2001 ;Molina等，2005 ;Duffy，2006]。CEA的一个已知功能是它在同型和异型相互作用两者中的作用[Taheri,2000 ;Singer等,2010 ;Zhou等，1993],这种同型和异型相互作用与肿瘤转移癌在组织例如肝脏、肺和腹腔内的形成和生长强烈相关[Berinstein，2002 ；Samara 等，2007 ;Zimmer 和 Thomas, 2001 ；Zhou 等，1993]。CEA 的 IgV-样 N 结构域代表着在所有CEA依赖性相互作用中的共同点。在机制上，CEA过表达及其自身结合与早期半胱天冬蛋白酶-9失活，PI3-K/Akt存活途径活化以及半胱天冬蛋白酶-8失活有关[Camacho-Leal P和Stanners, 2008],这大概通过其五肽PELPK基序(其N结构域中存在的残基108-112)对TRAIL-R2(DR5)的直接结合产生[Samara等，2007]。以结直肠癌为例，发现PELPK序列是转移的表达CEA的细胞寄居于肝实质上所必需的[Samara等,2007 ；Zimmer和Thomas, 2001 ；Hostetter等，1990]。从结构角度看，CEA IgV-样N结构域与其IgC-样A3B3结构域强烈相互作用，使得邻近CEA分子同型性地彼此粘附。CEA阳性细胞上的此种同型粘附事件得到嗜同性细胞间相互作用网络，这进一步促进另外的细胞寄居于扩张的新生转移病灶环境中[Samara等,2007 ;Taheri 等，2000 ;Zimmer 和 Thomas, 2001 ;Zhou 等，1993 ；Hostetter等，1990]。假设集中于CEA N结构域的免疫应答会得到能够阻断导致肿瘤植入和生长的CEA-阳性细胞之间的嗜同性细胞粘附事件的多克隆抗体应答，以及产生的抗体能够通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)破坏携带CEA的肿瘤细胞。因此，在大肠杆菌中表达重组形式的CEA N结构域(残基1-132)并且纯化用作用于接种CEA. Tg小鼠的制剂中的免疫原。重组的CEA IgV-样N结构域(rCEAN)是细菌产生的蛋白质，其代表着改变形式的自身抗原，因为其缺乏天然存在的N-连接聚糖并且表现出非天然的C-末端。该特征 解决了关键问题，即人免疫系统正常情况下耐受自身抗原例如CEA[Morse等，2008 ;Bos等，2008]。所产生的rCEA N结构域还包含与将表达CEA的转移性肿瘤细胞寄居于肝脏内有关的PELPK基序(残基108-112)。最后，与全长抗原相比，使用CEA的单个结构域作为免疫原将限制免疫应答至集中的且不同的决定簇组。通过实验，所表达的rCEA N结构域保留了其已知的与自身、rCEA A3B3模块以及全长的肿瘤衍生糖基化CEA结合的特性(图9)。然后，将折叠的无内毒素rCEA N结构域与佐剂poly1:C混合，并将混合物腹膜内施用入CEA. Tg小鼠内以引起抗CEA+鼠结肠MC38.CEA肿瘤细胞的保护性免疫应答。选择Poly1:C作为佐剂是考虑到其具有刺激B细胞活化[Scher等，1973]以及通过TLR-3/7信号传导来刺激I型应答[Barchet等，2008]两者的能力，这是已经证明正面影响小鼠和患者中发生保护性抗肿瘤免疫应答的免疫应答组合[Barchet等,2008]。此外,腹膜内施用rCEA N结构域/poly1: C制剂以评价该改变的自身抗原的免疫原性[Garvey等，1983]。使用3种不同的方法将MC38. CEA细胞植入到CEA. Tg小鼠中。作为第一个植入模型，将MC38. CEA细胞皮下引入到转基因小鼠后足内；这是导致局部大肿瘤块极其快速形成和生长的方法。在肿瘤形成后对动物的疫苗接种显著延缓了肿瘤生长(图10)。然而，突出的是，引起的针对rCEA N结构域的免疫应答将在阻断新肿瘤病灶的形成中，而不是阻止实体肿瘤块不受控地局部生长中发挥更合适的作用。因此向CEA. Tg小鼠静脉推注M38. CEA细胞，这导致在注射后60天内在肺中发生大的肿瘤病灶。在静脉注射肿瘤细胞之前，用N结构域免疫CEA. Tg小鼠保护所有免疫接种动物不发生肺肿瘤结节(图11A-E)。相反，所有未免疫的和仅佐剂处理的小鼠均在相同时间阶段内出现众多肺肿瘤结节(图11A-E)，表明疫苗接种阻止了肿瘤病灶在肺内的寄居和形成。还在腹腔内观察到CEA+肿瘤转移灶[Asao等，1989]。因此，将MC38. CEA细胞直接植入到CEA. Tg小鼠腹腔内以观察肿瘤结节的发生。在该植入模型中，由MC38. CEAuig细胞产生的发光信号用于监测在植入后前8天内这些细胞的快速散布和扩张。在腹膜内注射肿瘤细胞之前以N结构域免疫CEA. Tg小鼠的结果与静脉内植入途径相同，发光的MC38. 0￡4^细胞从腹腔消失(图12B)导致在第35天处死动物时在腹膜内空间(和别处)没有观察到肿瘤结节(图12C和12D)。在所有的未免疫和佐剂处理小鼠中出现不同的结果，其中MC38.CEA细胞在植入后快速扩张导致到35天时出现众多肿瘤病灶(图12B-D)。如所预期，预接种的CEA. Tg小鼠阻止经腹膜内注射的MC38. CEA细胞的生长和肿瘤块在腹腔内的形成。在简单的疫苗接种过程中使用重组rCEA N蛋白质结构域作为免疫原限制了对安全的担心[Woo等，2008]。该疫苗还具有优于先前公布的疫苗接种策略的吸引力，因为引起的应答将靶向更窄范围的潜在相关表位，绕过了来自全长CEA中存在的无关表位的抗原竞争[Crosti 等，2006 ；Shen 等，2004 ；Kobayashi 等，2002 ；Matsuda 等，2004 ；Dai 等，2008]。仅一篇报道描述了基于CEA的亚基疫苗的用途。具体而言，rCEA A3B3结构域与CpG寡核苷酸混合并皮下注射入C57BL/6小鼠[Woo等，2008]。据作者报导，该策略产生弱的CEA-特异性免疫应答，未能保护C57BL/6小鼠对抗致命的肿瘤植入物(当与TAT-融合构建体比较时)[Woo等，2008]。相反，本研究使用与poly1:C混合的CEA N结构域在CEA. Tg小鼠中产生对抗植入至肺和腹腔的肿瘤的有效CEA-特异性免疫应答(图13-15)。针对CEA N结构域的 IgGl和IgG2a抗体的产生支配在CEA. Tg小鼠中引起的CEA-特异性免疫应答(图13，14)。相反，在疫苗接种转基因小鼠中没有观察到白细胞增殖，不管用于刺激的抗原如何(图19)，该发现表明存在适度水平的T细胞刺激作为针对rCEAN结构域免疫应答的组成部分。然而，通过ELISP0T对分泌抗原-特异性细胞因子(IL-4、IL-10和IFN- y )的细胞的检测表明存在均衡的CEA-特异性，Th-细胞应答(图13B)。因此，针对CEA N结构域的总体应答与着眼于产生Ag-特异性细胞免疫应答[Berinstein，2002]的大多数癌症疫苗策略不同。然而，已经证明CEA N结构域-特异性IgGl和IgG2a抗体应答在调节或阻止所植入肿瘤的生长中(图10-14)，在诱导Ab-依赖肿瘤溶解中(通过ADCC和CDC两者)和在干扰CEA介导的细胞粘附中(图15)是有益的。通过过继转移来自疫苗接种动物的CEA-特异性B细胞或血清进入未免疫CEA. Tg小鼠中证实B淋巴细胞群体在疫苗接种小鼠中的重要性；这是挽救未免疫接受者小鼠不在它们的腹腔内发生肿瘤结节的免疫应答的部分(图16)。该结果与在Park和同事[Park等，2008]的研究中报导的结果相似，他们证明引起靶向ffiR-2/neu细胞外部分的多克隆抗体应答导致治愈小鼠内大的皮下形成的以及肺的表达ErbB-2的肿瘤，推测通过破坏其生物学功能实现[Park等，2008]。总之，简单地腹膜内注射改变的自身形式的CEA N结构域(残基1-132)在表达该抗原的转基因小鼠中引起CEA N结构域-特异性免疫应答。所引起的抗体应答阻止CEA. Tg小鼠肺或腹腔内肿瘤定植和肿瘤结节发展。该抗体-主导的(IgGl和IgG2a)应答导致除了阻碍CEA-依赖性细胞间粘附之外还通过Ab-依赖细胞溶解机制(ADCC和CDC)特异性杀伤表达CEA的细胞。由于癌症患者血清中高循环水平CEA时常与更高的转移复发发病率相关，所以使用该rCEA N结构域作为免疫原的癌症疫苗制剂将代表着对在手术前表现出升高的血清CEA水平的癌症患者的安全且简单的辅助治疗。虽然本公开已经参照目前认为是优选的实施例进行了描述，但是应当理解，本公开不限于所公开的实施例。相反，本公开旨在涵盖在后附权利要求书的精神和范围内包括的多种修改和等效排列形式。所有出版物、专利和专利申请以其全部内容，以如各个出版物、专利或专利申请明确地且各自地指明以其全文通过引用并入本文的相同程度，通过引用并入本文。表1:1)CEAWT N 结构域 A. DNA AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG AAGGAG GTG CTTCTA CTT GTC CAC AAT CTG CCC CAG CAT CTT TTT GGCTAC AGC TGG TAC AM GGT GAA AGAGTG GAT GGC AAC CGT CAAATT ATA GGA TAT GTA ATA GGA ACT CAA CM GCT ACC CCA GGGCCCGCA TAC AGT GGT CGA GAG ATA ATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTGATC CAG AAC ATCATC CAG AAT GAC ACA GGA TTC TAC ACC CTA CACGTC ATA AAG TCA GAT CTT GTG AAT GAAGAA GCA ACT GGC CAG TTCCGG GTA TAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGC AACAACTCC AAA CCC GTG GAG GAC AAG GAT GCT GTG GCC TTC ACC (SEQ IDNO 3)B.蛋白质KLTIESTPFNYAEGKEYLLLYHNLPQHLFGYSffYKGERYDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO:1)2)标签化的rCEA突变体N结构域核苷酸序列A. DNA GCGATA catatg CAT CAT CAC CAT CAC CAT GM MC CTC TAT TTC CM AAG CTCACTAGC ACT TCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG MG GAGGTG CTT CTA CTT GTC CAC AATCTG CCC CAG CAT CTT TTT GGC TACAGC TGG TAC AAA GGT GAA AGA GTG GAT GGC AAC CGTCAA ATTATA GGA TAT GTA ATA GGA ACT CAA CAA GCT ACC CCA GGG CCCGCA TAC AGT GGTCGA GAG ATA ATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTGATC CAG AAC ATC ATC CAG AAT GAC ACAGGA TTC TAC ACC CTA CACGTC ATA MG TCA GAT CTT GTG AAT GAA GAA GCA ACT GGC CAGTTCCGG GTA TAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ACC TCC AGC ACG ACTTCC AAA CCC GTGGAG GAC AAG GAT GCT GTG GCC TTC ACC TAGCTCGAG GGA TCC ACT CAG GAC(SEQ ID NO 4)B.切割的突变体rCEA N蛋白质 KLTSTSTPFNYAEGKEYLLLYHNLPQHLFGYSffYKGERYDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSTSSTTSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO :2)3) His-标签化的rCEA N :在实施例2中用作免疫原(残基1-132)标签化的rCEA N结构域核苷酸序列ATG CAT CAT CAC CAT CAC CAT GAA MC CTC TAT TTC CAA AAG CTCACT ATT GAATCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG AAG GAGGTG CTT CTA CTT GTC CAC AAT CTG CCCCAG CAT CTT TTT GGC TACAGC TGG TAC AM GGT GM AGA GTG GAT GGC MC CGT CM ATTATAGGA TAT GTA ATA GGA ACT CAA CM GCT ACC CCA GGG CCCGCA TAC AGT GGT CGA GAG ATAATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTGATC CAG MC ATC ATC CAG AAT GAC ACA GGA TTC TACACC CTA CACGTC ATA AAG TCA GAT CTT GTG AAT GAA GAA GCA ACT GGC CAG TTCCGG GTATAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGC AAC AACTCC AM CCC GTG GAG GAC AAGGAT GCT GTG GCC TTC ACC TAG(SEQ ID NO :14)标签化的多肽:MHHHHHHHHENLYFQKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO :7)切割的rCEA N KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO :1)表2 CEA A3B3 A. DNA序列(如在pET30中克隆的)tatacc CATATGGCC AAT AAC TCA GCC AGT GGC CAC AGC AGG ACT ACA GTC AAGACA ATC ACA GTCTCT GCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGCAAC AAC TCC AAA CCC GTG GAG GAC AAGGAT GCT GTG GCC TTCACC TGT GM CCT GAG GCT CAG MC ACA ACC TAC CTG TGG TGG GTAMTGGT CAG AGC CTC CCA GTC AGT CCC AGG CTG CAG CTG TCC AATGGC AAC AGG ACC CTC ACTCTA TTC AAT GTC ACA AGA AAT GAC GCAAGA GCC TAT GTA TGT GGA ATC CAG AAC TCA GTGAGT GCA AACCGC AGT GAC CCA GTC ACC CTG GAT GTC CTC TAT GGG CCG GAC ACCCCC ATCATT TCC CCC CCA GAC TCG TCT TAC CTT TCG GGA GCG AACCTC AAC CTC TCC TGC CAC TCGGCC TCT AAC CCA TCC CCG CAG TATTCT TGG CGT ATC AAT GGG ATA CCG CAG CAA CAC ACACAA GTT CTCTTT ATC GCC AAA ATC ACG CCA AAT AAT AAC GGG ACC TAT GCC TGTTTT GTCTCT AAC TTG GCT ACT GGC CGC AAT MT TCC ATA GTC AAGAGC ATC ACA GTC TCT GCA TCTGGA ACT TCT CCT GGT CTC TCA GCTGGG GCC ACT GTC GGC CAC CAT CAC CAT CAC CAT CACCAT TGACTCGAG atatag (SEQ ID NO :5)B.蛋白质序列(如从pET30中表达的)MANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNP SPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGHHHHHHHH(SEQ ID NO 6) 参考文献:Abdul-Wahid A，Faubert G. 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权利要求
1.免疫原性组合物，包含癌胚抗原(CEA)的N-结构域或者编码该N-结构域的核酸。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其还包含佐剂和/或药用载体。
3.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括poly1:C。
4.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述N-结构域是未糖基化的。
5.权利要求1的免疫原性组合物，其中与野生型CEA蛋白质相比，所述N-结构域具有改变的糖基化。
6.权利要求1-3中任意一项的免疫原性组合物，其中所述N-结构域包含SEQID NO 1、2或7中所示的氨基酸序列。
7.权利要求1-3中任意一项的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包括SEQIDN0:3、4或14中所示的核酸序列。
8.权利要求1-3和7中任意一项的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包括表达载体。
9.权利要求8的免疫原性组合物，其包含含有所述表达载体的宿主细胞。
10.权利要求1-9中任意一项的免疫原性组合物，其还包含第二CEA结构域或编码所述第二 CEA结构域的核酸。
11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述第二CEA结构域包括A3B3结构域。
12.权利要求11的免疫原性组合物,其中所述A3B3结构域包含SEQIDNO 5中所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6中所示的核酸序列编码。
13.有效量的癌胚抗原(CEA)的N-结构域或编码该CEAN-结构域的核酸分子或者CEAN-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体用于在有需要的动物或细胞内诱导或增强针对癌胚抗原(CEA)的免疫应答的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述免疫应答包括Th2免疫应答。
15.有效量的CEA的N-结构域或编码该N-结构域的核酸分子或者CEAN-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体用于在有需要的动物或细胞内抑制表达癌胚抗原(CEA)的肿瘤细胞的生长的用途。
16.权利要求15的用途，其中抑制肿瘤细胞的生长包括杀死所述肿瘤细胞。
17.权利要求16的用途，其中通过抗体依赖细胞毒性杀死所述肿瘤细胞。
18.有效量的CEA的N-结构域或编码该述N-结构域的核酸分子或者CEAN-结构域特异性血清或CEA N-结构域特异性抗体用于治疗具有癌胚抗原(CEA)-相关癌症或者具有增加的所述癌症风险的受试者的用途。
19.权利要求18的用途,其中所述CEA-相关癌症是由表达CEA的肿瘤细胞引起的癌症。
20.权利要求18或19的用途，其中所述癌症是胃肠癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌。
21.权利要求13至20中任意一项的用途，其中所述N-结构域是未糖基化的。
22.权利要求13至20中任意一项的用途，其中与野生型CEA蛋白质相比，所述N-结构域具有改变的糖基化。
23.权利要求13至20中任意一项的用途，其中所述CEA的N-结构域包含SEQID NO:1、2或7中所示的氨基酸序列。
24.权利要求13至20中任意一项的用途，其中所述核酸分子包含SEQIDN0:3、4或14中所示的核酸序列。
25.权利要求13-24中任意一项的用途，其还包括施用第二CEA结构域或者编码该第二CEA结构域的核酸。
26.权利要求25的用途，其中所述第二CEA结构域包括A3B3结构域。
27.权利要求26的用途，其中所述A3B3结构域包含SEQID NO 5中所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6中所示的核酸序列编码。
28.权利要求13至27中任意一项的用途，其还包括施用佐剂。
29.权利要求28的用途，其中所述佐剂是polyIiC0
30.用于鉴定CEA-介导的嗜同性相互作用的抑制剂的体外筛选测定法，包括a)在测试化合物存在下将MC38.CEAluc细胞与不发光MC38. CEA细胞的单层孵育；和b)通过定量由粘附的MC38.CEAluc细胞发出的生物发光信号评价细胞粘附，其中与对照相比生物发光降低表明所述测试化合物是CEA-介导的嗜同性相互作用的抑制剂。
全文摘要
本公开提供包含癌胚抗原(CEA)的N-结构域的免疫原性组合物。这些组合物可用于诱导或增强免疫应答，用于抑制肿瘤细胞生长和用于治疗癌症。
文档编号A61K39/00GK103037896SQ201180034343
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者A·阿布杜尔-瓦西德, J·加里皮 申请人:多伦多大学理事会