专利名称：突变的无激活作用的IgG2结构域和插入该结构域的抗CD3抗体的制作方法
技术领域：
本发明应用免疫和分子遗传技术，设计突变的无激活作用的IgG2结构域和插入该结构域的人源化抗CD3抗体。
背景技术：
T细胞上的CD3复合物与T细胞受体(T cell receptor,TCR)异质二聚体密切相关，在抗原结合而激活T细胞的过程中起重要作用。某些抗CD3抗体能在无抗原的情况下激活T细胞。这种激活依赖于单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的Fc部分和辅佐细胞上Fc受体的相互作用以交联T细胞上的CD3复合物。可溶性的抗CD3单克隆抗体不会刺激T细胞体外增殖，除非它们结合于塑料或含有Fc受体的细胞上。
虽然给人类受试者或小鼠服用这种抗体会产生免疫抑制作用，但功效却常受两种因素影响，其一是由于多次注射外源蛋白而导致的抗球蛋白反应，其二是由于T细胞活化导致的首次给药症状。这些症状包括发烧、寒颤、腹泻和呕吐，严重情况下可以导致死亡。这种症状是由于T细胞短暂激活而释放大量细胞因子所造成(参见Abramowicz等，移植，47,606,(1989))。一直认为TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-4、IL-6和GM-CSF等细胞因子可能与这些严重副作用有关。对于小鼠，曾报道两种形式的抗CD3抗体具有免疫抑制作用而不激活小鼠T细胞，这两种形式是F(ab’)2形式(参见Hirsch等，移植，49,1117,(1990))和小鼠IgG3同种型的嵌合形式(参见Alegre等，免疫学杂志，155,1544,(1995))。前者缺乏与Fcγ受体结合的恒定区部分，后者的恒定区与小鼠Fcγ受体亲合力很低。
在人类治疗中，期望得到一种人源化且不与Fcγ受体相互作用的抗CD3分子以将免疫原性和毒性减至最小。已经分别确定了各种人IgG同种型与三种Fcγ受体--FcRⅠ,FcRⅡ和FcRⅢ的亲合性(参见Raretch和Kinet，免疫学年鉴，9,457,(1991))。FcRⅠ是一种高亲合受体，它以单体形式与IgG结合；后两者是低亲合受体，它们以多聚体形式与IgG结合。通常IgG1和IgG3与三种受体都有显著的结合活性，IgG4与FcRⅠ、IgG2仅与FcRⅡ中称为ⅡaLR的一种类型有显著的结合活性(参见Parren等，免疫学杂志，148,695(1992)；临床研究杂志，90,1537(1992))。ⅡaLR是FcRⅡ的一种等位基因，其在40％的Caucasian群体中有表达。几个研究者制备了各种同种型的嵌合型抗CD3，但报道至少在几个捐献者中它们有促PBMC(外周血单核细胞)分裂的作用(参见Bolt等，欧洲免疫学杂志，23,403,(1993)；Parren等，研究免疫学，143,793(1991))。因此，Fc的天然存在形式不适于产生无激活作用的抗CD3单克隆抗体。
曾报道抗CD3的IgG1和IgG4的下部铰链区或上部CH2区发生突变能使这些分子的促有丝分裂性降低(参见Alegre等，移植，57,1537(1994)；Alegre等，免疫学杂志，148,3461(1991))。据报道IgG3的235位突变能影响它与FcRⅠ的相互作用，234和237位的突变影响它与FcRⅡ的相互作用(参见Lund等，免疫学杂志，147,2657,(1991))。未被糖基化的抗CD3也被报道与Fcγ受体的结合性有所削弱(参见Bolt等，欧洲免疫学杂志，23,403(1993))。
尽管有这些进展，仍然需要在恒定区有突变从而与现有抗体相比将促有丝分裂作用限制在更小范围内和更少病人中的抗CD3抗体。
发明概述本发明涉及一种突变的IgG2恒定区，它在234和237位残基(按EU编号系统定义)之间含有非天然存在的氨基酸区段。插入这样的IgG2恒定区的抗CD3抗体能与T细胞上的CD3抗原特异性结合，而且不会由于与Fcγ受体特异性结合而引起T细胞的促有丝分裂反应。突变的IgG2恒定区234、235和237位残基优选下列各氨基酸序列之一ala alagly、val ala ala、ala ala ala、val glu ala和ala glu ala。需注意这些突变恒定区中不包括236位(按EU编号系统定义)，如同野生型IgG2恒定区的情况。通常，突变区段包含在除此不同外即为天然存在的人IgG2恒定区内。本发明还提供了插入了该突变的IgG2恒定区的抗CD3抗体，优选人源化抗体。
本发明进一步提供了来源于小鼠M291抗体的新的人源化抗体，其中插入了突变的IgG2结构域。优选的人源化抗体轻链含有三个互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和一个来源于人κ轻链可变区框架序列的可变区框架，所说的三个互补性决定区具有M291免疫球蛋白轻链相应互补性决定区的氨基酸序列。优选的人源化抗体重链包括三个互补性决定簇(CDR1、CDR2和CDR3)和一个可变区框架，所说的三个互补性决定区具有M291免疫球蛋白重链相应互补性决定区的氨基酸序列，所说的可变区框架来源于人重链可变区框架序列，除了其至少在H30、H67、H68、H70、H72和H74之一的氨基酸位置由小鼠M291免疫球蛋白重链可变区框架同一位置的同样氨基酸所占据。这种免疫球蛋白与T细胞表面的CD3抗原特异性结合，通常其亲合力下限约107M-1，上限约为M291免疫球蛋白结合亲合力的5倍。最好该人源化轻链可变区框架来自亚组Ⅰ的HF2-1/17抗体的轻链可变区框架。人源化重链可变区框架以来自21/28抗体的重链可变区框架为佳。这种情况下，H44位可以由人免疫球蛋白亚组Ⅰ的共有序列同一位置上的同样氨基酸所替代。
附图简述
图1小鼠(A-B)或人源化(C-D)M291抗体的轻链(A、C)和重链(B、D)可变区cDNA序列(SEQ ID NO:1、3、5、7)和翻译成的氨基酸序列(SEQ ID NO:2、4、6、8)。每一成熟链的第一个氨基酸用双下划线表示。每条链的三个CDR用下划线表示。
图2表达嵌合型抗CD3抗体的质粒构建体。将OKT3的Vh和VLcDNA制成两侧含有XbaⅠ位点的外显子。将VL序列插入到表达载体pVk.rg中，将VH序列插入到重链表达载体pVg2.D.Tt中。然后对这两个质粒进行重组以产生共表达重链和轻链的单一质粒。在这些质粒中PstⅠ和SfiⅠ位点不是单一的。
图3四种人IgG同种型、五种IgG2突变体和一种IgG4突变体的CH2区内的序列。依照EU编号系统对残基进行编号。
图4IgG2突变体3重链恒定区的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。CH1结构域由残基118-215组成，绞链区由残基216-230组成，CH2结构域由残基231-340组成，CH3结构域由残基341-447组成。符号“-”表示为用EU正确排列而引入的间隔。由野生型IgG2突变而来的残基用下划线标出。除残基234-237外，所有五种IgG2突变体都有相同的序列。图3给出了五种突变体在该区域内的序列。所有残基均按EU编号系统编号。
图5与嵌合型OKT3抗CD3抗体有关的T细胞增殖。确定了由嵌合型抗CD3抗体诱导的来自八个人捐献者(供体A-H)的PBMC中[3H]胸苷的掺入量。将PBMC分别与浓度为10ng/ml、100ng/ml和1μg/ml的每一种抗CD3抗体共培养72小时，然后加入[3H]胸苷脉冲标记12小时，由闪烁计数器确定同位素的掺入量。PBS是磷酸缓冲盐溶液对照。FOS代表包含亮氨酸拉链FOS的嵌合型抗CD3分子的F(ab’)2型，M1-M5指IgG2的突变体1-5，AA指IgG4的Ala-Ala突变体，VZV IgG1是与人源化抗体无关的对照。
图6大量T细胞反复靶向导致的裂解。[51Cr]标记的K562细胞和人T细胞母细胞与各种浓度的嵌合型抗CD3抗体共培养4小时，测定51Cr的释放。FOS代表嵌合型抗CD3分子的F(ab’)2型。
图7比较嵌合型OKT3抗CD3抗体相对亲合力的竞争性测定。提高小鼠OKT3或嵌合型OKT3-IgG1、IgG2和IgG2突变体3的量使活化的人T细胞上的小鼠OKT3-FITC的亚饱和量有所偏移。VZV IgG1是无关的人源化抗体。数值以与无任何竞争性抗体的对照的荧光强度相比，其荧光强度的抑制百分比表示。
图8由嵌合型OKT3抗CD3抗体诱导的IFN-γ和TNF-α的释放。与T细胞增殖测定中一样，在每种抗体的三种浓度下对来自六个捐献者(C-H)的PBMC铺板。IFN-γ的浓度在72小时时测定(上图)，TNF-α在24小时时测定(中图)。符号“*”表示细胞因子的浓度超过检测上限。受测抗体对每一捐献者的T细胞增殖曲线来自图5并表示于下图中。使用的四种抗体是嵌合型OKT3 F(ab’)2(FOS),IgG1,IgG2和IgG3突变体3(M3)。PBS是无任何抗体的阴性对照。
图9由嵌合型OKT3抗CD3抗体引起的T细胞中IL-2的释放和IL-2受体α(CD25)的诱导表达。与T细胞增殖测定中一样，在每种抗体的三种浓度下对来自六个捐献者(C-H)的PBMC铺板。表达CD25的T细胞(CD7阳性)百分比在90小时时由流式细胞计量术确定(上图)。IL-2浓度在24小时时测定(中图)。每一捐献者对受测抗体的T细胞增殖曲线取自图5并表示于下图中。使用的四个抗体是抗CD3F(ab’)2(FOS)、IgG1、IgG2和IgG2突变体3(M3)。PBS是无任何抗体的阴性对照。
图10小鼠和人源化M291抗体的竞争性结合。在放射标记的示踪性小鼠M291抗体存在下提高冷竞争性抗体的浓度，与T细胞共培养，测定结合/游离状态放射活性的比率。
图11由人源化M291抗CD3抗体诱导的TNF-α、INF-α和IL-2的释放。检测是按照图8所示方法用来自5个人捐献者的PBMC和所述的抗体浓度进行的。在指定的各时间点测定细胞因子的释放。
定义术语IgG2恒定区是指Ellison和Hood(美国国家科学院院报，79,1984(1981))所述的特异IgG2恒定区序列，其等位基因变体及其它有高度序列同一性(例如，与上述的Ellson和Hood的序列有至少90％、95％或99％的序列相同)的形式。最好不相同的残基位置由不同的保守氨基酸所取代。该术语包括一个全长恒定区及其片段，例如CH1、铰链区、CH2和CH3区及它们的各种组合。人和灵长类动物中发现有IgG2恒定区。
序列同一性百分比由GAP或BESTFIT程序用错误缺口重量来确定。
通过与人抗体EU比较而对恒定区氨基酸进行编号(参见Cunningham等，生物化学杂志，9,3161(1970))。即将一种抗体的重链和轻链与EU的重链和轻链进行排列以使它们具有最大程度的氨基酸序列同一性，该抗体中每一氨基酸被赋予与EU中相应氨基酸同样的编号。EU编号系统在本领域常规使用(一般参见Kabat等，Sequences ofProtein of Immunological Interest,NIH出版号No.91-324,USDepartment of Health and Human Services(1991))。按照这一规则，上述Ellison和Hood(出处同前)描述的野生型IgG2恒定区缺少236位的氨基酸。本文将来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链可变区的氨基酸分别称作Hx和Lx，其中x是可变区序列位置编号。
本发明的抗CD3抗体能特异性结合人CD3抗原。人CD3的大多数抗体并不与低等哺乳动物中的同源抗原交叉反应。
为将氨基酸取代区分为保守取代或非保守取代，将氨基酸按下述分组组Ⅰ(疏水侧链)正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；组Ⅱ(中性亲水侧链)cys、ser、thr；组Ⅲ(酸性侧链)asp、glu；组Ⅳ(碱性侧链)asn、gln、his、lys、arg；组Ⅴ(影响链方向的残基)gly、pro；和组Ⅵ(芳族侧链)trp、tyr、phe。保守取代涉及同组内氨基酸间的取代，非保守取代是一组中的一个氨基酸由另一组中的一个氨基酸取代。
轻链和重链从N末端到C末端均包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。每一结构域的氨基酸排列按Kabat(1991，出处同前)和/或Chothia和Lesk(分子生物学杂志，196:901-917(1987))；Chothia等(自然，342:878-883(1989))的定义确定。
众所周知基本的抗体结构单元包括一个四聚体。每一四聚体含相同的两对多肽链，每对有一条“轻链(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括一个约100到110或更多个氨基酸的可变区，其主要与抗原识别有关。每条链的羧基末端部分定义为恒定区，其主要起效应器功能。每对轻重链的可变区形成抗体结合位点，因此，一个完整的抗体有两个结合位点。
轻链分为κ和λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，同时重链还包括一个约10多个氨基酸的“D”区(一般参见《基础免疫学》(Paul,W.编，第二版，Raren出版社，N.Y.,1989)，第7章(为各种目的将此书全文引入作为参考文献))。
术语“表位”包括能与免疫球蛋白或T细胞受体特异结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
术语“病人”包括人和兽医受试体。
若在竞争性测试中过量的受测抗体能基本上抑制参考抗体与抗原的结合，则受测抗体能与参考抗体竞争以特异性结合抗原。基本抑制意味着受测抗体通常至少降低了参考抗体特异性结合的19％、25％、50％、75％或90％。竞争性抗体结合到抗原上与参考抗体结合相同或相似的表位，或其结合的表位与参考抗体结合的表位非常接近从而抑制了参考抗体与抗原的结合。
详细描述本发明提供了突变的IgG2恒定区，其基本上丧失了与Fcγ受体特异性结合能力，由此可在大多数病人中激活T细胞的促有丝分裂反应。本发明还提供了来源于小鼠M291抗体的新的人源化抗CD3抗体，其中可以插入该突变的IgG2恒定区。也可以将突变的IgG2恒定区插入到其它抗CD3抗体或其它抗体中。Ⅰ．IgG2恒定区的突变本发明提供了在CH2区发生突变并基本上丧失了与Fcγ受体相互作用能力的IgG2恒定区。与Fcγ受体结合能力丧失相关的突变发生在IgG2恒定区的234-237位残基上(按EU规则对残基进行编号)。按以下几种要求选择突变其一，突变应导致其丧失了与能由IgG2(FcRⅡ)天然识别的Fcγ受体的特异性结合能力(即Ka＜106M-1)，同时并不会获得与其它Fcγ受体(不能由IgG2天然识别)的结合能力。换句话说，本发明的IgG2突变型通常不会特异性结合任何Fcγ受体(至少常见的等位基因形式)。基本丧失了与Fcγ受体的结合力导致基本丧失了T细胞促有丝分裂活性。
其二，一种插入了突变的IgG2恒定区的抗CD3抗体应基本上具有与另一种具有野生型IgG2恒定区而其它部分相同的抗CD3抗体相同的结合CD3的亲合性和亲合力(例如在3、5或10倍范围内)。突变也不应影响结合的特异性(例如具有突变的IgG2恒定区的抗体应该能与该抗体的未突变型竞争结合人CD3)。其三，突变不应过多影响恒定区的结构而与天然恒定区结构相差太大，以免导致免疫原性增加。因此，含有本发明经突变的恒定区的抗体在治疗中仍可用于抑制T细胞免疫反应。
下面介绍满足前述要求的包含不同突变组合的5种典型IgG2恒定区的分离。在这些恒定区中，残基234、235和237(按EU编号系统定义)构成一个氨基酸区段，其选自ala ala gly,val ala ala,ala ala ala,val glu ala和ala glu ala。如同野生型IgG2的恒定区，这些突变体恒定区的236位也未被占据。
同样，这些突变的恒定区也可描述为在234到237位间含有下述非天然存在的氨基酸序列之一ala ala-gly,val ala-ala,ala ala-ala,val glu-ala,alaglu-ala。其中“-”表示236位缺失氨基酸。
虽然根据前述氨基酸分类法，这些例子中不是所有的取代都是保守取代，但它们不会实质性改变包含这些序列的IgG2恒定区的电荷分布或构象。因此，通过相对保守的修饰，可基本上减弱其与Fcγ受体的结合性和T细胞促有丝分裂活性。通过用20种常见氨基酸分别或一起取代234到237位的氨基酸，或者任意地删除这些氨基酸，可以产生满足要求的其它突变。
通过重组技术将突变的IgG2恒定区插入抗CD3抗体中。最适合的是完全人的或人源化抗CD3抗体，例如人源化M291或人源化OKT3(Allegre等，(1992)，出处同前)。插入这些恒定区的抗体具有作为免疫抑制剂的理想效果，原因在于至少在大多数病人(本文意指至少67％、75％、90％或95％)中，它们能抑制T细胞免疫反应，而不会诱导促有丝分裂活性，避免了细胞因子的有害释放。插入本发明突变的IgG2恒定区的抗CD3抗体与该抗体的F(ab’)2片段(其完全缺乏FcγR结合结构域)相比，并不显示出具有与Fcγ受体明显更高的结合性(例如超过2、5或10倍)。由于这种结合亲合力的丧失，插入突变IgG2恒定区的抗CD3抗体不会刺激T细胞获得明显的增殖活性(与基底水平相比)。而且，插入本发明突变的IgG2恒定区的抗CD3抗体与相应的F(ab’)2片段相比不会由于抗体与T细胞结合而明显刺激细胞因子(例如TNF-α、IL-2或IFN-γ)的释放，或者诱导IL-2受体的表达。也就是说，大多数病人或大多数捐献者的体外细胞中，与未突变的IgG1和/或IgG2抗CD3抗体中观察到的相应活性相比，该抗体的促有丝分裂活性(即诱导增殖和/或细胞因子释放和/或受体表达)降低至少2、5、10或100倍，并且/或者是F(ab’)2片段相应活性的2、5或10倍以内。插入突变IgG2恒定区的抗体比F(ab’)2具优势处在于前者有较长的血清半衰期。插入突变IgG2恒定区的抗体也常显示较长的体内半衰期，并且相对于具有野生型恒定区的抗体其免疫原性有所降低，这大概由于它们不能与Fcγ受体相互作用。Ⅱ．人源化抗CD3抗体本发明进一步提供了来源于小鼠抗体M291的新的人源化抗体，在该抗体中可以插入突变的IgG2恒定区(也参见USSN 08/397,411，为各种目的将其全文引入作为参考文献)。该人源化抗体也可与其它恒定区一起使用，或以缺乏完整恒定区的片段形式使用。免疫球蛋白的人源化形式具有基本来源于人免疫球蛋白(即受体免疫球蛋白)的可变框架区和基本来源于小鼠免疫球蛋白(即供体免疫球蛋白)的互补性决定区。如果存在恒定区，其也基本来源于人免疫球蛋白(例如85％、90％、95％或更高)。人源化抗体与它们相应抗原的特异结合性亲合力至少为107、108、109或1010M-1。人源化抗体的结合性亲合力的上下限通常为衍生该人源化抗体的小鼠抗体的结合性亲合力的3、5或10倍。
选择了人源化免疫球蛋白的CDR和框架成分后，就可以用很多方法产生这种免疫球蛋白。由于密码子的简并性，每一免疫球蛋白氨基酸序列可由大量核酸序列编码。理想的核酸序列可由固相DNA从头合成或由以前制备的理想多核苷酸的变体经PCR诱变获得。编码本申请中所述抗体的全部核酸显然包括在本发明中。
通常将如上述的人源化抗体的可变区连接到上述突变的IgG2恒定区上。然而也能使用其它恒定区，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何一种同种型，包括IgG1、天然IgG2、IgG3和IgG4。当期望人源化抗体具有细胞毒性时，恒定区通常是可结合补体的恒定区，并通常是IgG1类。当不需要这种细胞毒性时，恒定区可以是IgG2或IgG4类。人源化抗体可以包括来自一种以上类别或同种型的序列。人恒定区DNA序列可按照常规程序从大量人类细胞但最好是无限增殖化B细胞(参见Kabat等，出处同前，和WO 87/02671)中分离得到。通常，这种抗体包含轻链和重链恒定区。重链恒定区通常包括CH1、铰链区、CH2、CH3区，并且有时有CH4区。
另一方面，本发明包括编码已公开的抗体和恒定区的DNA片段。将编码人源化轻链和重链可变区的核酸插入表达载体中，该人源化轻链和重链可任选地与恒定区相连。可将该轻链和重链克隆到相同或不同的表达载体上。编码免疫球蛋白链的DNA片段被有效连接到表达载体的控制序列上，该控制序列可确保免疫球蛋白多肽的表达。这种控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen等，美国国家科学院院报，86,10029(1989)；WO 90/07861；Co等，免疫学杂志，148,1149(1992)，抗体工程实践指南(Borrebaeck编，Freeman,NY1991))，为各种目的将上述全文引入作为参考文献)。
大肠杆菌是一种原核宿主，在本发明DNA序列的克隆和/或表达中特别有用。其它适用的微生物宿主包括芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌和其它肠杆菌科，例如沙门氏茵属、沙雷氏杆菌属和各种假单胞茵属种。也可在这些原核宿主中制备表达载体，该载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，其中可以具有一系列众所周知的启动子的任意数目，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来源于λ噬菌体的启动子系统。这些启动子(任选地可与操纵基因序列相连)通常可控制表达，并含有核糖体结合位点序列等，以便起始和完成转录和翻译。
其它微生物，例如酵母，也能用于表达中。酵母属是一种较好的宿主，它有合适的具有表达控制序列的载体，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，和一个所需的复制起点、终止序列等。
可将植物和植物细胞培养物用于表达本发明的人源化免疫球蛋白(Laaaick和Fry，人抗体杂交瘤(Hum.Antibodies Hybridomas),2(4):172-89(1991)；Benvenuto等，植物分子生物学，17(4):865-74(1991)；Durin等，植物分子生物学，15(2):281-93(1990)；Hiatt等，自然，342:76-8(1989)。此处为各种目的将这些文献全文引入作为参考)。较好的植物宿主包括诸如拟南芥属植物、烟草、黄花烟草、马铃薯。用于表达编码本发明所述的人源化抗CD3抗体的多核苷酸序列的较好表达载体是质粒pMOG18，其中插入的编码该人源化免疫球蛋白链的多核苷酸序列有效地连接到带有重复增强子的CaMV 35S启动子后，pMOG18的应用参照Sijmons等方法(Bio/Technology 8:217-221(1990)，为各种目的将该文献全文引入作为参考)。或者，用于在植物中表达人源化免疫球蛋白链的较好实施例可参照Hiatt等方法(出处同前)，其中用编码本发明的人源化抗CD3抗体的多核苷酸序列代替Hiatt等使用的免疫球蛋白序列(出处同前)。也可利用根瘤农杆菌基于T-DNA的载体表达人源化免疫球蛋白序列，最好这种载体包括有能编码壮观毒素抗性或其它选择标记的标记基因。
也能利用昆虫细胞培养物产生本发明的人源化免疫球蛋白，通常采用基于杆状病毒的表达系统。可以按照Putlitz等，Bio/Techndogy 8:651-654(1990)的方法，通过表达编码人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列而产生人源化免疫球蛋白(可为各种目的将该文献全文引入作为参考)。这可通过适当改动Putlitz等的方法，即将编码本发明人源化抗CD3抗体的多核苷酸序列代替Putlitz等的小鼠单克隆抗体6A4重链和轻链cDNA序列插入而达到。
除微生物和植物外，也能利用哺乳动物组织细胞培养物表达和产生本发明所述的多肽(参见Winnacker，《从基因到克隆》(VCH出版社，NY,1987)，为各种目的将该文献全文引入作为参考)。确实优选哺乳动物细胞，因为本技术领域已经研制出了大量能分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系，各种COS细胞系、Hela细胞，优选骨髓瘤细胞系等，或者经转化的B细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子(参见Queen等，免疫学综述，89:49-68(1986)，为各种目的将该文献全文引入本文作为参考)，和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。较好的表达控制序列是来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。通常，在表达载体中包含有一个选择标记，例如neoR表达盒。
本发明抗体包括片段和完整抗体。通常，这些片段与衍生它们的完整抗体竞争性地结合抗原。通常片段结合的亲合力至少为107M-1，更为常见的是108或109M-1(即与完整抗体的亲合力在同一范围内)。人源化抗体片段包括单独的重链，Fab,Fab’、F(ab’)2和Fv以及单链抗体。片段是通过DNA重组技术或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离方法而得到的。Ⅲ．人抗体通过重组表达技术也能将本发明的经突变的IgG2恒定区与完全人的抗CD3抗体的可变区连接起来。人抗体由下述一系列技术产生。通过竞争性结合实验或其它方法筛选出具有与特定小鼠抗体例如M291或OKT3相同或有所重叠的表位特异性的一些人抗体。
a．三细胞杂交瘤(trioma)法Oestberg等(Hybridoma 2:361-367(1 983)；Oestberg，美国专利号4,634,664；Engleman等，美国专利4,634,666(为各种目的将这些文献全文引入作为参考)描述了这一基础研究及用于该研究的模型细胞融合配体，SPAZ-4。由这一方法获得的可产生抗体的细胞系被称为三细胞杂交瘤，因为它们来源于三个细胞。两个人细胞和一个小鼠细胞。首先，将小鼠骨髓瘤系与人B淋巴细胞融合，获得不产生抗体的异种杂交细胞，例如Oestberg(出处同前)所述的SPAZ-4细胞系。然后将这一异种细胞与经免疫的人B淋巴细胞融合形成可产生抗体的三细胞杂交瘤细胞系。
经免疫的B淋巴细胞来源于人捐献者的血液、脾、淋巴结或骨髓。由于存在诱发有害反应的风险，因此用人T细胞或CD3对活人进行体内免疫通常是不可取的。因此，通常用T细胞、纯化的CD3或其抗原片段体外免疫B淋巴细胞。最好使用CD3的人型。通常在培养基例如补加了10％人血浆的RPMI-1640(参见Engleman，出处同前)中，将B淋巴细胞暴露于抗原7-14天。
按公知方法将免疫的B淋巴细胞与异种杂交细胞(例如SPAZ-4)融合。例如，在37℃下，用40％-50％的聚乙二醇(MW 1000-4000)处理该细胞5-10分钟。然后从融合混合物中分离细胞并在可用于选择所需杂交体的培养基(如HAT或AH)上进行增殖。通过测定三细胞杂交瘤培养基结合CD3或其片段的结合能力，鉴定出可分泌具所需结合特异性的抗体的克隆。可产生具所需特异性的人抗体的三细胞杂交瘤用限制性稀释技术进行亚克隆并在培养基中体外培养。然后测定所获得的三细胞杂交瘤细胞系结合CD3或其片段的能力。
尽管三细胞杂交瘤在遗传学上是稳定的，但它们不会非常高水平地产生抗体。通过将来源于三细胞杂交瘤的抗体基因克隆到一个或多个表达载体上并将载体转化到细胞系如前述的细胞系中以表达重组型或人源化免疫球蛋白，可以提高表达水平。b．转基因的非人类哺乳动物抗CD3的人抗体也能从非人类转基因哺乳动物产生，该动物中具有编码至少一段人免疫球蛋白基因座区段的转基因。通常，这种转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座在功能上已被失活。优选该人免疫球蛋白基因座区段包含重链和轻链成分的未重排序列。通过靶向同源重组或引入YAC染色体，能导致内源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的导入。由此过程产生的转基因哺乳动物能够有效重排这些免疫球蛋白组成序列，并表达由人免疫球蛋白基因编码的各种同种型抗体的全部成分，而不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些特征的哺乳动物的制备及其性质由Lonbery等(WO 93/12227(1993))和Kucherlapati(WO91/10741(1991))(为各种目的将每篇文献全文引入作为参考)详细叙述。转基因小鼠最为适用。通过用T细胞、CD3或其抗原片段免疫转基因的非人类哺乳动物可获得抗CD3抗体，例如Lonberg或Kucherlapati(出处同前)所述。例如，用传统的Kohler-Milstein技术将来自这种哺乳动物的B细胞与合适的骨髓瘤细胞系融合可制备单克隆抗体。c．噬菌体展示法获得人抗CD3抗体的另一条途径是按照Huse等(科学，246:1275-1281(1989))概述的一般方法筛选来自人B细胞的DNA文库。挑选出能与CD3或其片段结合的抗体，然后克隆和扩增编码这些抗体(或结合片段)的序列。Huse所述的方案与噬菌体展示技术结合后更为有效(参见例如Dower等，WO 91/17271和McCafferty等，WO92/01047(为各种目的将每篇文献全文引入作为参考))。这些方法中制备了噬菌体文库，其中各成员在其外表面展示不同抗体。抗体通常是以Fv或Fab片段展示的。通过与CD3或其片段的亲合力的增强筛选出展示具理想特异性的抗体的噬茵体。
在噬菌体展示方法的一种变更方法中，可产生具有选定的小鼠抗体结合特异性的人抗体(参见Winter,WO 92/20791)。在这一方法中，利用选定的小鼠抗体(例如M291)的重链或轻链可变区作为起始材料。如果，例如选择轻链可变区作为起始材料，就能构建一种噬菌体文库，其中各成员展示相同的轻链可变区(即小鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区得自重排的人重链可变区的文库。选择出显示与CD3结合强特异性(例如至少108，优选至少109M-1)的噬菌体。然后将来源于这一噬菌体的人重链可变区用作起始材料构建下一个噬茵体文库。在这个文库中，每个噬茵体展示同样的重链可变区(即来源于第一个展示文库的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区得自重排的人轻链可变区文库。再次选择出显示与CD3结合强特异性的噬菌体。这些噬茵体展示完全人的抗CD3抗体的可变区。这些抗体通常具有与小鼠起始材料(例如M291)同样或相似的表位特异性。Ⅳ．治疗方法包含本发明抗体的药物组合物可用于胃肠外给药，即皮下、肌肉内特别是静脉内施用于遭受或有可能遭受显示不期望的免疫反应的状态的病人。这样的状态包括自身免疫疾病，移植物排斥(特别是在心脏、肺、肾或肝脏移植后)，移植物抗宿主疾病(骨髓移植后)，炎症、过敏性反应和脓毒病。典型的自身免疫疾病有类风湿性关节炎，多发性硬化症、I型糖尿病、系统性红斑狼疮和炎性肠疾病。在治疗上述或其它自身免疫疾病的急性突发或恶化中该组合物特别有效。
用于胃肠外给药的该组合物通常包括该抗体的溶液或分散在合适载体(最好是水性载体)中的该抗体的混合物。可使用很多种水性载体例如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％的甘氨酸溶液等。这些溶液应无菌并通常无颗粒物质。该组合物可以包含必要的与生理状态接近的药剂适用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂，以及毒性调节剂等，比如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠。这些配方中抗体浓度可以广泛变化，即最少可低于0.01％，通常至少约0.1％到高达5％(重量百分比)，主要是按照选用的特定给药模式，基于流体体积和粘度选择抗体浓度。
一种用于静脉输液的典型组合物可制成含有250ml无菌Ringer氏液和10-100mg抗体。(参见Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack出版公司，Easton,Pennsylvania,1980)。
可施用包含该抗体的组合物进行预防和治疗。用于治疗时，给已经感染的病人施用足够量的组合物以治愈或至少部分抑制病症及其并发症。适于达到此效果的用量被称为“治疗有效剂量”。有效用于这一用途的量取决于症状的严重程度和病人自身免疫系统的一般状况，但通常是每剂含约0.01-100mg抗体，更常用的剂量是每一病人给药0.1-50mg和1-10mg。每日、每周或每月的单次或多次给药方式可按照治疗医生选择的剂量水平和服药方式。
用于预防时，给有可能出现这一疾病症状的病人服用包含该抗体的组合物以便增强病人的抵抗力。这一剂量被称为“预防有效剂量”。此应用中，准确使用量同样取决于病人的健康状况和一般免疫水平，但通常范围是每剂0.1-100mg，优选每一病人1-10mg。Ⅴ．诊断方法感染了病原体的人的免疫监测(例如AIDS病人的T细胞数的测量)或免疫系统紊乱的病人的诊断方法中也能用到M291抗体(小鼠和人源化抗体均可使用)。可利用来自病人的细胞样品(例如血液样品、淋巴结活检或组织)体外进行或者通过体内成像进行诊断。M291抗体也能用于白细胞亚型的分类研究中，例如，作为抗体系列的一部分。用于这类目的时，最好将M291用于ELISA、RIA或其它本领域公知的检测程序。
实施例1．材料和方法a．V区cDNA的克隆按照Co等(免疫学杂志，148,1149(1992))所述的锚定PCR(聚合酶链反应)方法，从表达OKT3(ATCC CRL 8001)杂交瘤细胞中克隆OKT3重链和轻链的V区cDNA。用分别可与小鼠γ链和κ链的C区退火的3′引物和可与cDNA的附加G尾退火的5′引物，对cDNA进行扩增。将VH和VL的cDNA亚克隆到载体pUC19中以进行序列测定。它们的序列与Woodle等发表的序列相同(参见Woodle等，免疫学杂志，148,2756(1992))。
b．嵌合型抗CD3抗体的表达将OKT3的VH和VL cDNA构建成为包含信号序列、J区段和剪接供体序列的外显子，其在两侧含XbaⅠ位点(参见Co等，免疫学杂志，148,1149(1992))。将VL序列插入表达载体pVkrg的XbaⅠ位点，类似地将VH序列插入各种重链表达载体(例如pVg2.D.Tt)。载体pVk.rg与pVk相似(Co等，出处同上)，仅是其中gpt单元方向相反。载体pVg 2.D.Tt与pVg1相似(Co等，出处同上)，但其中包含了一个含有以γ2恒定区(Ellison和Hood，出处同上)代替γ1的基因组片段以及人补体基因C2的转录终止子(Tt)(从C2聚腺苷酸区+37到+162bp，参见Ashfield等，EMBO J.,10:4197(1991))。各种人重链载体仅Fc编码序列有所不同。为在一个质粒中共表达重链和轻链，从重链表达载体中得到了包含hCMV启动子、整个重链基因、聚腺苷酸化信号和转录终止信号的EcoRⅠ片段，然后将其克隆到轻链表达质粒的单一EcoRⅠ位点(图2)。由此获得的质粒具有可由一个载体编码的重链和轻链。由于在它们之间存在转录终止信号(Tt)，因此这两个基因由hCMV启动子独立转录(参见Boshart等，细胞，41,521(1985))。在一个实验例中，仅涉及了人γ1恒定区基因的CH1外显子和铰链区，铰链区外显子与编码亮氨酸拉链Fos的DNA融合形成了一个嵌合的F(ab’)2Fos(参见Tso等，J.Hematother 4,389(1995))。为表达一种特定抗体，用电穿孔方法将相应质粒转染到小鼠骨髓瘤细胞系TSO中。TSO细胞是按照Sato等(参见Sato等，实验医学杂志，165,1761,(1987))的程序，通过对其在无血清培养基中生长能力的筛选而从小鼠骨髓瘤NSO细胞获得的。筛选每一转染反应的细胞的gpt表达。转染子在无血清培养基中培养，然后从衰竭培养物中用蛋白G亲合层析纯化抗体。
c．γ2和γ4 CH2外显子的诱变利用PCR程序将突变导入γ2和γ4外显子CH2区。每一诱变中，合成了包含突变序列的两个互补引物。其中之一用作上游引物以通过PCR反应合成5′部分，另一个用作下游引物以合成所需片段的3′部分。将野生型Fc序列用作模板。然后混合这两种PCR产物，并再次用上游和下游引物进行退火和扩增。γ2诱变时，使用的上游引物是5′GGACACCTTCTCTCCTCCC(SEQ ID NO:10)，下游引物是5′CCCAAGCTTGGGTGGGCCGAGCCGGCCTCTGTCC(SEQID NO:11)。这些引物分别处于铰链外显子和CH2外显子的旁侧。用于突变体1的两个互补引物是5′GCACCACCTGCGGCAGGACCGTCA(SEQ ID NO:12)和5′TGACGGTCCTGCCGCAGGTGGTGC(SEQ ID NO:13)。用于各种其它IgG2突变体的互补引物除突变的密码子外均类似。扩增反应产物用PstⅠ和SfiⅠ在铰链和CH2外显子旁侧两个限制位点切开，将产生的525bp片段插入IgG2表达载体PstⅠ和SfiⅠ位点之间。类似地，制备经诱变的241bp PstⅠ-PmlⅠ片段以用于γ4的CH2外显子，并插入IgG4表达载体中。分析每一表达载体的序列以便确保仅引入了所需的突变。
d．T细胞增殖测试将于补加了10％FCS的RPMI中的外周血单核细胞(PBMC)在96孔微量滴定平板上铺板，每孔2×105个细胞。加入各种浓度的抗体，将细胞在37℃培养3天。每孔加入1μCi的[3H]胸苷，将平板再保温12小时后收获。用细胞收集器收集细胞，在液闪计数器中测量[3H]胸苷掺入量。所有数据均为三次测定的平均值。
e．FcRⅡ依赖性T细胞重复靶向检测在补加了10％FCS的RPMI培养基中加入植物凝集素(PHA)于37℃培养PBMC三天，接着用含IL-2的培养基继续培养5天得到活化的人T细胞。在含5×106个靶细胞的1ml RPMI培养基中加入100μCi51Cr以使表达FcRⅡ的K562细胞用51Cr标记。在37℃培养1小时后，洗涤细胞两次。T细胞(50ml)和已被标记的K562靶细胞(50ml中7×104个)以25∶1的效应器与靶细胞比率铺板于U型底微滴定平板上，然后加入所需浓度的嵌合型抗CD3抗体。所有样品铺板三份。离心平板，于37℃培养4小时，再次离心。通过测定每一样品释放到100μl无细胞上清液中51Cr的量确定细胞裂解状况。用Beckman 5500型γ计数器计数。具体裂解百分比由下式确定(E-S/M-S)×100，其中E是样品中三次每分钟样品计数的平均值，S是仅用靶细胞的样品中自发释放量，M是用靶细胞和100μl 1％SDS的样品的最大释放量。
f．比较嵌合型OKT3抗体与CD3抗原相对亲合力的竞争性测定将人T细胞以2.5×106个细胞/ml的浓度再次悬浮于完全的RPMI培养基中。加入待测抗体(嵌合型OKT3)或对照抗体(小鼠OKT3)的稀释液，于4℃培养1小时，加入固定的、亚饱和量的结合了FITC的小鼠OKT3，将细胞在4℃培养1小时，冲洗细胞并再次悬浮于1％的多聚甲醛中，然后用流式细胞计量法分析细胞。将每个样品的荧光强度与无任何竞争性抗体对照的荧光强度相比较，数值表示为相对于对照荧光密度的百分比。
g．抗CD3介导的细胞因子释放和CD25的表达与T细胞增殖测试中类似地对PBMC和抗体进行铺板，在24小时时取样用于测定TNF-α和IL-2值，在72小时时取样用于测定IFN-γ值。利用商用测定试剂盒测定培养基中TNF-α和IFN-γ水平。利用IL-2依赖性细胞系HT-2通过增殖测定法确定IL-2水平。在90小时时用双色FACS测定(two-color FACS assay)确定表达活化标志IL-2受体α(CD25)的T细胞的百分比。利用人源化、结合了FITC的抗Tac抗体标记T细胞表面的活化标志CD25，利用与连接了PE的山羊抗小鼠IgG结合的小鼠抗人CD 7抗体标记全部T细胞。两种细胞数的比率表示CD25阳性的T细胞的百分比。2．结果a．IgG2 CH2区的突变图3给出了所有野生型IgG同种型在CH2区的序列。IgG1和IgG3在这一区有同样的序列Leu-Leu-Gly-Gly；IgG4不同之处仅在于234位是Phe残基。然而IgG2在这一区的序列完全不同。除了在236位缺乏氨基酸外，其余三个位置中的两个(234和235位)还与IgG1、IgG3和IgG4的序列不同。也许是由于IgG2的独特序列Val Ala-Gly而造成它仅对FcRⅡ有特异性。
一次一个或联合地将突变导入以包含这一区的所有残基。图3给出了制成的五种IgG2 Fc变体在234-237位的序列。前三个突变体是丙氨酸扫描突变(Ala scanning mutation)。235位无变化是因为它本身是丙氨酸残基。第4、5个突变体的235位还改变为Glu残基。无促有丝分裂活性的小鼠IgG2b同种型抗CD3在这一位置是Glu残基。为了比较，制备了IgG4在234和235位有两个Ala取代的突变体(参见Alegre等，移植，57:1537(1994))。图4给出了IgG2突变体3的重链恒定区的全部序列。
与在234和235位上具有两个Ala取代的IgG4变体以及所有天然人IgG同种型一样，通过与OKT3可变区结合，将这五种IgG2突变体恒定区插入嵌合型OKT3抗体中。另外，通过亮氨酸拉链技术制备来源于IgG1的嵌合型OKT3 F(ab’)2(参见Kostelny等，免疫学杂志，148,1547(1992))。重组的F(ab’)2完全无Fc。用来自八个捐献者的人PBMC测定所有这些OKT3嵌合型抗体和片段在促有丝分裂测试中的T细胞增殖作用。使用多个捐献者是因为由于Fc受体的多态性，他们的PBMC可能对抗CD3产生不同反应。一种有用的抗CD3变体最好应在大多数或所有捐献者对T细胞均无促有丝分裂活性。也使用这些抗体的不同浓度以确保在临床适当剂量范围内不会激活T细胞。
b．抗CD3的IgG2突变体中有所降低的促有丝分裂活性图5给出了T细胞增殖测定的结果。IgG1和IgG4同种型的抗CD3抗体在大多数受测供体中均有促有丝分裂活性，而供体对IgG2和IgG3同种型的抗CD3反应有所不同。所有五种IgG2突变体对PBMC的促有丝分裂活性有所削弱，而野生型IgG2具有明显的增殖作用。突变体2-5诱导的增殖作用最小。对大多数捐献者样品，突变体2-5的促有丝分裂活性与无Fc的F(ab’)2一样低，并且比IgG4突变体的促有丝分裂活性还低。在高抗体浓度下(1μg/ml)，仅在一个捐献者(D)中观察到这些突变体的明显增殖作用，但这与细胞因子的释放或T细胞活化标志CD25的诱导无关。因此突变体2-5具有无激活作用的抗体的性质。具体地说，它们比IgG4突变体诱导的增殖作用更低，而IgG4突变体在高浓度下(1μg/ml)与IgG1和未突变IgG4的增殖作用相当。
c．抗CD3的IgG2突变体3不会介导依赖于Fc和FcRⅡ相互作用的重复靶向作用(retargeting)如果抗CD3抗体含有有功能的Fc，则通过该抗体可连接含有Fc受体的细胞和T细胞。这种连接能触发T细胞溶解含有Fc受体的细胞(反向溶解，reverse lysis)。由此提供了一种探测抗CD3的IgG2突变体与Fc受体相互作用的灵敏检测方法。这一检测中，挑选突变体3作为IgG2突变体的代表。既然IgG2主要与FcRⅡ相互作用，因而将在细胞表面表达FcRⅡ的K562细胞用作IgG2突变体3介导的反向溶解的靶细胞。数据如图6所示。抗CD3的I2G2突变体3在介导反向溶解时与抗体的F(ab’)2型同样无活性，而野生型IgG2能介导高达32％的K562细胞的特异性溶解。虽然由于与FcRⅡ的低亲合力，IgG1同种型的活性较低，但它在高抗体浓度下仍能介导与IgG2水平相当的溶解作用。另一单独实验中，抗CD3的IgG2和突变体3均不能有效介导FcRⅠ依赖性反向溶解作用。因此在IgG2突变体3的Fc中引入的突变并不会逆转IgG2对FcRⅠ的低亲合力。这些实验确证了突变体3与FcRⅠ和FcRⅡ的亲合力均很低。
d．嵌合型抗CD3抗体对其抗原的亲合力基本不被其同种型或Fc突变影响利用上述的竞争性测地定评价小鼠OKT3、嵌合型OKT3 F(ab’)2、IgG1、IgG2和IgG2突变体3对T细胞的相对亲合力，以证明不是由于OKT3 IgG2突变体3不能与T细胞结合而使其丧失了引发T细胞活化或FcRⅡ介导的反向溶解。嵌合型OKT3 IgG1阻断FITC标记的小鼠OKT3和未标记OKT3的结合力(图7)。因此，该抗体必须具有与小鼠OKT3非常相似的亲合力。嵌合型OKT3 IgG2和IgG2突变体3在阻断FITC标记的小鼠OKT3的结合方面比未标记的OKT3效能略低一点。估计它们的亲合力是嵌合型IgG1亲合力的2到3倍以内。因此这一实验证实IgG2和其突变体的抗原结合活性基本上得以保留。既然有相似亲合力的野生型IgG2能够激活来自合适捐献者的PBMC中的T细胞，那么结合力的轻微降低并不足以导致突变体3的活性的丧失。
e．抗CD3的IgG2突变体3不会诱导细胞因子的释放下面检测了IgG2突变体诱导细胞因子释放能力和上调T细胞中IL-2受体的能力。首先将来自八个受测捐献者中六个的PBMC与不同浓度的嵌合型OKT3 F(ab’)2和同种型IgG1、IgG2和IgG2突变体3的嵌合型OKT3混合铺板，然后在24小时时检测上清液中活化标志TNF-α和IL-2的存在，在72小时时检测IFN-γ的存在。另外，在90小时时检测T细胞中活化标志IL-2受体α(CD25)。结果如图8和图9所示。与预期一致，IgG1在刺激三种细胞因子释放和诱导CD25表达方面的活性最强。在所有六个捐献者中，IgG2也具有可测量到的CD25诱导和细胞因子释放。另一方面，在这三种受测抗体中，IgG2突变体3的激活作用最低。在所有情形下均很难检测到高于本底的活化标志。甚至在以前高浓度(1μg/ml)的IgG2突变体3曾观察到有一些增殖作用的捐献者D中(图5)，这些活化标志的表达也是可忽略的。基于这些检测，似乎抗CD3的IgG2突变体3表现出最小的T细胞活化作用，故应该是这些实验的受测抗体中最为安全的一个。3．人源化M291抗体的构建a．小鼠M291可变区cDNA的克隆和测序使用锚定PCR技术，从分离自杂交瘤细胞的mRNA克隆小鼠M291重链和轻链可变区cDNA(Co等，免疫学杂志，148:1149(1992))。使用的5′引物可与添加到cDNA的poly-dG尾退火，3′引物可与恒定区退火。然后将扩增的DNA插入到pUC19中，测定几个重链和轻链的克隆的序列，发现它们分别相同。这些可变区的cDNA序列和来源于它们的氨基酸序列如图1A和图1B所示。
b．人源化M291可变区的设计为了保留人源化抗体中小鼠抗体的结合亲合力，参照Queen等的一般程序(参见Queen等，美国国家科学院院报，86:10029(1989)和WO 90/07861)。在保留高结合亲合性方面，框架残基的选择比较重要。原则上，来自任何人抗体的框架序列都可以作为CDR移植模板，然而，已经证明将CDR直接替换到这样的框架中会导致与抗原结合亲合力的明显丧失(Glaser等，免疫学杂志，149:2606(1992)；Tempest等，Biotechnology 9:266(1992)；Shalaby等，实验医学杂志，17:217(1992))。人抗体与原始小鼠抗体的同源程度越高，由人框架将可降低亲合性的变形导入小鼠CDR的可能性看来越低。基于抗体序列数据库的序列同源性检索，人抗体HF2-1/17与小鼠M291轻链可变区有很好的框架同源性，人抗体21/28与小鼠M291重链可变区有很好的框架同源性，尽管其它高度同源的人抗体也可能是合适的，特别是来自人亚组Ⅰ的κ轻链或来自人亚组Ⅰ的重链(按照Kabar等的定义，出处同前)。
利用计算机程序ENCAD(Levitt等，分子生物学杂志，168:595(1983))，构建M291可变区的分子模型。利用该模型，对M291框架中与CDR足够靠近的氨基酸进行定位，使其有可能与CDR相互反应。为了设计人源化M291轻链和重链可变区，将来自小鼠M291抗体的CDR分别移植到人HF2-1/17和21/28抗体轻链和重链的框架区内。在计算机模型提示可能与CDR明显接触的框架位置处，将来自小鼠抗体的氨基酸替换为原始人框架氨基酸。对于人源化M291，这种替换发生在重链的残基30、67、68、70、72和74位置，轻链无残基替换。人抗体数据库中框架位置上很少出现的框架残基也用那些位置上的人共有氨基酸代替。对于人源化M291，这种替换发生在重链的44位残基。
图1C和1D给出了人源化M291抗体(HuM291)轻链和重链可变区的最终序列。然而，还有许多潜在的CDR接触性残基也能由其它氨基酸替换，而使抗体仍保留了与抗原的基本亲合性。下表列出了框架中的一些位置，在这些位置处另外一些氨基酸可能也是合适的(LC=轻链，HC=重链)位置 HuM291 替换物LC-69 DE,SHC-30 IT,V,LHC-44 GRHC-67 KRHC-68 AVHC-70 LI,VHC-72 AR同样，与人源化M291可变区中CDR无接触的许多框架残基也可由来自人HF2-1/17和21/28抗体的相应位置、或者来自其它人抗体、或者来自小鼠M291抗体、或者来自其它小鼠抗体的氨基酸替换，而不会导致该人源化抗体亲合性或无免疫原性的明显丧失。下表列出了框架中可由其它一些氨基酸替换的其它位置。
位置HuM291替换物LC-3 Q VLC-4 M LHC-1 Q E
HC-75 SA,THC-81 MI,L,V可选用替换氨基酸的各种组合以产生具有下述性状各种不同组合的各型人源化M291亲合性、特异性、无免疫原性、易制备性以及其它理想性质。因此，上表中各例子仅是举例说明，而非穷举。
c．人源化M291的构建一旦已按如上所述设计出人源化可变区氨基酸序列，就可以构建编码这些序列的DNA区段，该区段包括信号肽、剪接供体信号和合适的限制位点。每一可变区编码区段按以下四步用10个合成的重叠寡核苷酸构建和扩增(1)将四对中间的重叠寡核苷酸变性、退火，然后用DNA聚合酶的Klenow片段延伸，从而从八个较短的重叠寡核苷酸合成四个较长的重叠寡核苷酸；(2)将这四个寡核苷酸变性，然后类似地组合形成两个重叠的DNA片段；(3)产生的寡核苷酸对同样地连接起来形成编码区段的中间部分；以及(4)将包含XbaⅠ限制位点的最后两个旁侧寡核苷酸用于PCR以完成扩增编码区段。
将人源化可变区编码区段插入人表达载体，这些载体包含人Cκ编码区段或人Cγ2突变体3编码区段或人Cγ1编码区段，分别称为pVk.rg和pVg2.D.Tt(同上所述)，或者相似载体pVg1.D.Tt。然后将轻链和每一重链编码区段分别插入上述的一个表达载体中(参见图2)。两个表达质粒用FspⅠ线性化以备转染之用。利用基因脉冲装置(Bio-Rad)，按照厂家说明在1500V和3μF进行两次脉冲将每一质粒约20tg分别转染到1×107个TSO细胞中。然后将细胞在96孔组织培养平板上铺板，两天后使用选择培养基(DMEM,10％FCS,1X青霉素一链霉素(P/S)(Gibco),1xHT添加物(Sigma),0.25mg/ml黄嘌呤、1μg/ml雷酚酸)。
约两星期后，出现的克隆通过ELISA筛选其抗体产生情况。在无血清培养基中培养高水平生产IgG1的克隆和IgG2突变体3克隆至铺满并培养至细胞死亡，从而从这些细胞中制备抗体。将培养物上清液过蛋白G-Sepharose柱(Pharmacia)；用0.1M甘氨酸-盐酸、100mM NaCl,pH2.5洗脱抗体，接着对磷酸缓冲盐溶液(PBS)透析。通过跑丙烯酰胺凝胶鉴定抗体纯度，利用OD280读数测定其浓度(假设1.3mg抗体蛋白的OD280读数为1.0)。
d．人源化M291的性质为证实人源化M291抗体能与小鼠M291抗体竞争性结合CD3，由此测量它们的结合亲合力，分别将浓度递增的抗体与12.5ng125I标记的小鼠抗体示踪物混合，并在0.2ml结合缓冲液(PBS加2％胎牛血清，0.1％叠氮化钠)中与4×105个IL-2活化的人T细胞在冰上共保温90分钟。洗涤细胞并离心，测量其放射活性，计算结合抗体和游离抗体的比率。按照Berzofsky和Berkower(J.A.Berzofsky和I.J.Berkower，《基础免疫学》，W.E.Paul，编，Raver出版社，New York,1984)的方法计算结合亲合力。小鼠M291与IgG1 M291抗体等效竞争(图10)，并且具有很高的亲合力计算值(Ka=1.6×109M-1)，因此该人源化程序并未显著改变原始抗体的结合亲合力。人源化IgG2突变体3(IgG2M3)抗体的竞争力略低，这也许是由于IgG2铰链区的较高刚性所致，但仍有很高的亲合力(Ka=5×108M-1)。
在与上述嵌合型OKT3 IgG2突变体相似的实验中，用来自不同捐献者的PBMC证实了人源化M291 IgG2M3抗体诱导T细胞增殖和淋巴因子释放的能力。与那些突变体一样，人源化M291 IgG2M3抗体对大多数或全部捐献者诱导的增殖作用更低，细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的释放减少甚至没有(图11)。
为各种目的将上面提及的所有出版物和专利文献全文引入作为参考，每篇出版物或专利文献均相同程度地特定并单独引入作出参考那样。虽然本发明为了清楚和便于理解而通过举例说明和实施例作了一定程度的详细描述，但显然在附加的权利要求范围内可做某些改变和调整。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)姓名Tso,J.YunCole,Michel S.
Anasetti,Claudio(ⅱ)发明名称突变的无激活作用的IgG2结构域和插入该结构域的抗CD3抗体(ⅲ)序列数13(ⅳ)联系地址(A)收件人Townsend and Townsend and Crew LLP(B)街道Two Embarcadero Center,Eighth Floor(C)城市San Francisco(D)州加利福利亚(E)国家美国(F)邮编(ZIP)94111-3834(Ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC可兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0,Version#1.30(EPO)(ⅵ)当前申请信息(A)申请号US 08/656,586(B)申请日1996年5月31日(C)分类(ⅷ)代理人/代理机构信息(A)姓名Liebeschuetz,Joseph O．(B)注册号37,505(C)文档号11823-007210US
(ⅸ)电信信息(A)电话(415)576-0200(B)电传(415)576-0300(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度384个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)性质(A)名称/关键词CDS(B)位置1..384(C)其它信息/注=“小鼠M291抗体轻链可变区的cDNA”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15GCC ATA ATA TCC AGA GGA CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC 96Ala Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC 144Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser35 40 45TCA AGT GTA AGT TAC ATG AAC TGG TAC AAG CAG AAG TCA GGC ACC TCC 192Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Lys Gln Lys Ser Gly Thr Ser50 55 60CCC AAA AGA TGG ACT TAT GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA GTC CCT 240Pro Lys Arg Trp Thr Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC 288Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG 336Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110AGT AGT AAC CCA CCC ACG TTC GGC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA AAA 384Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度128个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Ala Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Lys Gln Lys Ser Gly Thr Ser50 55 60Pro Lys Arg Trp Thr Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)长度417个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)性质(A)名称/关键词CDS(B)位置1..417(C)其它信息/注=“小鼠M291抗体重链可变区的cDNA”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATG GAA AGG CAC TGG ATC TTT CTA CTC CTG TTG TCA GTA ACT GCA GGT 48Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15GTC CAC TCC CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GCA AGA 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg20 25 30CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45ATT AGT TAC ACG ATG CAC TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 192Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60GAA TGG ATT GGA TAC ATT AAT CCT AGA AGT GGT TAT ACT CAT TAC AAT 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn65 70 75 80CAG AAG TTA AAG GAC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC 288Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95TCA GCC TAC ATG CAA CTG AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336Ser Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110TAT TAC TGT GCA AGA TCG GCC TAC TAT GAT TAT GAC GGC TTT GCT TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr115 120 125TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 417Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)长度139个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Glu Arg His Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Ser Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度378个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)性质(A)名称/关键词CDS(B)位置1..378(C)其它信息/注=“人源化小鼠M291抗体轻链可变区的cDNA”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:ATG GAG ACC GAT ACC CTC CTG CTA TGG GTC CTC CTG CTA TGG GTC CCA 48Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15GGA TCA ACC GGA GAT ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCT TCC CTC TCT 96Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30GCT AGC GTC GGG GAT AGG GTC ACC ATA ACC TGC TCT GCC AGC TCA AGT 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser35 40 45GTA AGT TAC ATG AAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGC AAA GCT CCC AAG 192Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys50 55 60AGA CTA ATT TAT GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA GTC CCT TCT AGG 240Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg65 70 75 80TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACC GAT TTC ACC CTC ACA ATC AGC TCT 288Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser85 90 95CTG CAG CCA GAA GAT TTC GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAA TGG AGT AGT 336Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser100 105 110AAC CCA CCC ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA 378Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度126个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser35 40 45Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys50 55 60Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg65 70 75 80Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser85 90 95Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser100 105 110Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)长度417个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)性质(A)名称/关键词CDS(B)位置1..417(C)其它信息/注=“人源化小鼠M291抗体重链可变区的cDNA”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGT ACC GCG GGC 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15GTG CAC TCT CAG GTC CAG CTT GTC CAG TCT GGG GCT GAA GTC AAG AAA 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30CCT GGC GCC AGC GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45ATT AGC TAC ACG ATG CAT TGG GTA AGG CAG GCC CCT GGA CAG GGT CTG 192Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60GAA TGG ATG GGA TAT ATT AAT CCG AGA AGT GGG TAT ACT CAT TAC AAT 240Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn65 70 75 80CAG AAG TTA AAG GAC AAG GCA ACA CTT ACC GCG GAC AAA TCC GCG AGC 288Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser85 90 95ACA GCC TAC ATG GAA CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACC GCA GTC 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110TAT TAC TGT GCA AGA TCG GCC TAC TAT GAT TAT GAC GGC TTT GCT TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr115 120 125TGG GGC CAA GGA ACC CTG GTC ACA GTC TCC TCA 417Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)长度139个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Ile Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Leu Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)长度326个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)性质(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..326
(C)其它信息/注=“IgG2突变体3的重链恒定区”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro100 105 110Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp115 120 125Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp130 135 140Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly145 150 155 160Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn165 170 175Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp180 185 190Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro195 200 205Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu210 215 220Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn225 230 235 240Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile245 250 255Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr260 265 270Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys275 280 285Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys290 295 300Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu305 310 315 320Ser Leu Ser Pro Ser Lys325(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGACACCTTC TCTCCTCCC19(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:CCCAAGCTTG GGTGGGCCGA GCCGGCCTCT GTCC 34(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GCACCACCTG CGGCAGGACC GTCA24(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TGACGGTCCT GCCGCAGGTG GTGC 2权利要求
1．在按EU编号系统定义的残基234和237位间具有非天然存在的氨基酸区段的突变IgG2恒定区，其中含有一种抗CD3抗体的可变区与所述突变IgG2恒定区相连的抗体相对于含有所述抗CD3抗体的可变区与一种天然IgG2恒定区相连的另一种抗体而言，前者所诱导的人T细胞的促有丝分裂反应有所降低。
2．一种突变的IgG2恒定区，其中按EU编号系统定义的残基234、235和237形成下述氨基酸区段之一ala ala gly,val ala ala,ala ala ala,val glu ala,以及ala glu ala。
3．按照权利要求2的突变的IgG2恒定区，其中所说的区段是ala alaala。
4．按照权利要求3的突变的IgG2恒定区，其中所说的区段包含在除此区段不同外即为天然存在的IgG2恒定区中。
5．按照权利要求2的突变的IgG2恒定区，其至少包括CH1，铰链，CH2和CH3区。
6．按照权利要求5的IgG2恒定区，其含有图4所示的序列(SEQ IDNO:9)。
7．可特异性结合人CD3的抗体，其中含有权利要求1的突变的IgG2恒定区。
8．可特异性结合人CD3的抗体，其中含有权利要求2的突变的IgG2恒定区。
9．按照权利要求8的抗体，其中该抗体是人源化的。
10．按照权利要求9的抗体，其中该抗体是人源化M291。
11．按照权利要求10的抗体，其中人源化轻链含有如图1C(SEQ IDNO:6)所示的成熟氨基酸序列，并且人源化重链可变区包括与IgG2恒定区融合的具有如图1D(SEQ ID NO:8)所示的成熟氨基酸序列。
12．按照权利要求11的抗体，其中突变的IgG2恒定区的234、235和237残基形成区段ala ala ala。
13．按照权利要求10的人源化抗体，其含有人源化重链和人源化轻链(1)该人源化轻链包括3个互补性决定区(CDR1、CDR2、CDR3)和一个可变区框架，所说的3个互补性决定区具有小鼠M291免疫球蛋白轻链的相应互补性决定区的氨基酸序列，所说的可变区框架来源于人κ轻链可变区框架序列；以及(2)该人源化重链包括3个互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和一个可变区框架，所说的3个互补性决定区具有小鼠M291免疫球蛋白重链的相应互补性决定区的氨基酸序列，所说的可变区框架来源于人重链可变区框架序列，差异仅在于其至少在选自由H30、H67、H68、H70、H72和H74位置组成之组的氨基酸位置之一由小鼠M291免疫球蛋白重链可变区框架同一位置的同样氨基酸占据；该免疫球蛋白与T细胞表面的CD3抗原特异性结合，其结合亲合力下限为约107M-1；上限约是M291免疫球蛋白结合亲合力的5倍。
14．按照权利要求13的人源化抗体，其中该人源化轻链可变区框架来源于亚组Ⅰ的HF2-1/17抗体的轻链可变区框架，该人源化重链区框架来源于21/28抗体的重链可变区框架，差异仅在于选自所说组的至少位置之一，以及44位，该氨基酸位置由出现在人免疫球蛋白亚组Ⅰ共有序列同一位置上的同样氨基酸占据。
全文摘要
本发明提供了突变的IgG2恒定区和插入了该区的抗CD3抗体。这样的抗体可与T细胞上的CD3抗原特异结合,但与另一种具有天然IgG2恒定区而其余部分与所述抗体相同的抗体相比,其诱导的促有丝分裂反应有所降低。该抗体可以用于治疗需要免疫抑制功能的疾病,并且治疗时比原先的CD3抗体副作用更小。
文档编号C07K16/00GK1222162SQ97195646
公开日1999年7月7日 申请日期1997年5月19日 优先权日1996年5月20日
发明者J·Y·特索, M·S·科勒, C·阿纳瑟迪 申请人:蛋白质设计研究室有限公司, 弗雷德哈钦森癌症研究中心