含过氧氧化还原酶和/或β－微管蛋白的疫苗的制作方法

专利名称：含过氧氧化还原酶和/或β－微管蛋白的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用过氧氧化还原酶(硫醇特异性抗氧剂)和/或β-微管蛋白作为防止肠虫寄生物的保护性抗原。
每种家畜都可能被许多不同类肠虫所寄生，这一过程通常会引起疾病。例如，肝片吸虫Fasciola hepatica被认为是引起诸如牛和羊等反刍动物经济上重要疾病，片吸虫病的原因之一。寄生虫通过渗透至肠壁而进入哺乳动物宿主，且在迁移进入胆管之前，需要约7周时间在肝脏上摄食并通过肝脏穴居。感染之后，寄主的免疫性发育就会减缓，而且已感染的寄主只部分对再感染有抵抗力或根本没有抵抗力。其它寄生吸虫包括大片吸虫(Fasciola gigantica)和双腔吸虫(Dicrocoelium)spp.、拟单片吸虫Paramphistomum spp.，也包括血吸虫Schistosoma spp.、比如牛血吸虫S.bovis和曼氏血吸虫(S.mansoni)。
线虫，如钩虫(如板口线虫属(Necator)、钩口线虫属(Ancylostoma)、钩虫属(Uncinaria)和仰口线虫属(Bunostomum SPP.)也会导致疾病。
在血液摄食线虫中，血矛线虫(Haemonchus)属会引起贫血和失重，若不治疗，经常会导致死亡。被非血液摄食线虫胃线虫属(Ostertagia)所感染的动物同样不能茁壮成长，若不治疗就会导致死亡。
具有经济重要性的其它寄生肠虫包括下列各类肠虫属毛圆线虫属(Trichostrongylus)、细颈线虫属(Nematodirus)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、古柏线虫属(Cooperia)、蛔虫属(ascaris)、恶丝虫属(Dirofilaria)、鞭虫属(Trichuris)和圆线虫属(Strongylus)。除家畜外，相伴的动物和人类也会被感染，致命结果并非罕见，所以，肠虫传染和感染就提出了一个相当重要的世界性问题。
目前，控制食草家畜的肠虫寄生主要依赖于使用抗肠虫药与放牧管理相结合。这种方法通常是不能令人满意的，首先因为抗肠虫药必须经常供给，其次因为家畜对抗肠虫药的抗药性在不断增加，第三个原因在于合适的放牧管理在某些农场常常是不可能的，即使可能，也会影响对可放牧食草的充分利用。
关于用免疫方法控制家畜的肠虫寄生已经作出许多努力。但除极少数的例外(如牛肺肠虫，田螺网尾线虫(Dictyocaulus viviparus))，这种方法尚未证明其可行性。
专利WO90/08819已经提出了一种抗肝片吸虫的疫苗，包含着取自于肝片吸虫的作为抗原的一种谷胱甘肽-S-转移酶。在专利WO94/09142、WO94/28925和PCT/GB95/02350中提出了另一些抗肝片吸虫的疫苗，分别包含着取自于肝片吸虫的作为抗原的一种组织蛋白酶L、一种二肽酶和一组血蛋白。
Bennett(英国专利，专利号为2169606B)通过一种从存在于幼年期到成年期生物体中的抗原中分离出对幼年期吸虫特异的多种抗原方法，从片吸虫各种组织中提取了各种抗原。
更进一步，在某些环境下的原始的体外排泄/分泌(E/S)物可以给予大鼠以免疫性(Rajaseksriah等，寄生虫学(Parasitol.),79(1979),p.393-400)。
现已发现，用相对不纯的血蛋白制剂给动物接种以预防肝片吸虫，与PCT/GB95/02350中所描述的纯的制品产生了对肠虫的过氧氧化还原酶和β-微管蛋白的抗体。这一发现提供了制备抗肝片吸虫和其它肠虫的疫苗的可能性，这一方法基于使用其它肠虫寄生物所产生的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子和/或相应的蛋白来作为抗原。
因此，本发明的一个目的在于提供一种用于哺乳动物抗肠虫寄生感染的疫苗配方，其抗原材料包括一种过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子，至少为部分纯化形式、或一种抗原片段或抗原决定簇、组分、前体、类似物、变异体或与其功能相当的衍生物，与载体和/或佐剂一起组成抗原材料。
本发明还提供一种用于哺乳动物抗肠虫寄生感染的方法，包括根据本发明所述的一种疫苗对所述的哺乳动物给药，其用量足够抗所述感染。
另一方面，本发明提供在制备哺乳动物抗肠虫寄生感染的疫苗配方中所描述的分子的应用。
所述的哺乳动物优选反刍动物，如牛或羊，但是，本发明的疫苗配方和方法也可用于人类及其相伴的动物如狗和猫、或其它家畜。
过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子优选取自吸虫，如片吸虫或双腔吸虫，特别是取自于肝吸虫肝片吸虫。另外，过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子应能激起免疫应答，这种免疫应答将对片吸虫或双腔吸虫是有效的，特别是肝片吸虫和大片吸虫，从其它物种得到的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子能提供交叉保护的免疫应答，因而形成本发明的一个特别值得称道的方面。
下文所表明的肝片吸虫过氧氧化还原酶和β-微管蛋白分子具有cDNA序列和预测的氨基酸序列，分别如图2和图4所示，它们特别适用于本发明的疫苗配方和方法。
根据本发明，掺入到疫苗中的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子至少为部分纯化的形式。本发明的分子优选至少为75％纯度，更优选至少为95％纯度。一旦得到至少为95％纯度的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子，就与一种或多种进一步纯化的抗原蛋白质混合以便形成一种多价疫苗。
根据本发明，疫苗中的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子可为抗原形式、抗原片段形式、或抗原决定簇、组分、前体、类似物、或与其功能相当的衍生物。
根据本发明的多价疫苗的优选形式含有上文定义的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白多肽，与一种组织蛋白酶L型抗原或一种二肽酶抗原或一组血蛋白分子相结合，国际专利申请WO94/09142更详细描述了组织蛋白酶L型抗原，国际专利申请WO94/28925更详细描述了二肽酶抗原，国际专利申请PCT/GB95/02350更详细描述了一组血蛋白分子。这样，组织蛋白酶L型和/或二肽酶和/或血蛋白优选取自于吸虫，如片吸虫或双腔吸虫，特别优选取自于肝吸虫肝片吸虫。这样一种多价疫苗通过在寄主体内对两个或多个肠虫寄生物侵入诱导免疫性，将显著增加抗肠虫的可能性，并显著减少发生感染的机会。
根据本发明的单价疫苗可能对肠虫寄生物也具有抗生殖力效应，而多价疫苗的这种效应将更为显著。
在一个优选方面，所述多价疫苗包括根据本发明的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子，以及一种分子量为27kDa(用WO94/09142中公开的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)的组织蛋白酶L1，和/或一种分子量为29.5kDa(用WO94/09142中公开的相同方法测定)的组织蛋白酶L2，和/或分子量为200kDa(用WO94/28925中公开的相同方法测定)的二肽酶，或一种或多种分子量至少为200kDa(用PCT/GB95/02350中公开的凝胶过滤色谱方法测定)的一组血蛋白。
根据本发明的疫苗可以使用常规的载体和/或佐剂，而且本发明也提供一种制备该疫苗的工艺，该工艺将上文所述的纯化过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子以及一种或多种佐剂或载体组成一体。在一种或多种药物可接受的载体或稀释剂存在下，合适的佐剂包括氢氧化铝、皂苷(ISCOMs)、quil A和它们更纯化的形式、胞壁酰基二肽、矿物和植物油、DEAE葡聚糖、非离子共聚物或脂质体，比如Novasomes(MicroVesicular System公司的商标)。相应于根据本发明的过氧氧化还原酶或β-微管蛋白分子的抗原决定簇的肽序列载体抗原可以是蛋白质，诸如乙型肝炎核抗原多抗原肽，或脂肪肽，诸如三棕榈-S-甘油半胱氨酰基丝氨酰基丝氨酸(P3CSS)。合适的稀释剂包括液态介质，诸如适合用作媒介物的盐水溶液。也可以包括附加组分，如保存剂。
可以通过任何常规的方式向寄主供给疫苗，比如，口服、或肠胃以外吸收如肌肉注射，可选择间隔时间，比如在7到35天之内注射两次。当用注射供给疫苗时，合适的剂量按蛋白质的量计算，可以在10-500μg范围内。
另一方面，本发明提供肝片吸虫过氧氧化还原酶分子或抗原片段、抗原决定簇、组分、前体、类似物或其变异体，以及功能相当的衍生物以抵抗一个或多个肠虫寄生物而保护性抗原活性，其特征如下(a)至少具有一部分本质上对应于如图4所示的氨基酸序列；(b)由核苷酸序列编码的，至少一部分本质上对应于图4所示的序列；虽然用于根据本发明的疫苗的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子优选为通过从肠虫中分离制备，但也可以方便地采用重组DNA技术制备，重组DNA技术在生产规模扩大和重现性方面具有人们共知优点。这样，本发明也可以提供通过重组DNA技术制备的上述过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子。
因此，本发明一方面提供对本发明的过氧氧化还原酶或β-微管蛋白分子或抗原部分进行编码的核酸序列，本质上对应于所有或部分核苷酸序列如图4所示为过氧氧化还原酶的核苷酸序列，图2所示为β-微管蛋白分子的核苷酸序列，或对肠虫过氧氧化还原酶或β-微管蛋白抗原进行编码的序列，本质上是同源的，或能与任何一种所述序列杂交。
因此，根据本发明的一种核酸可以是单股或双股DNA、cDNA或RNA。
在过氧氧化还原酶或β-微管蛋白编码的核苷酸序列中可能出现一个物种中肠虫的不同株之间的变异体、一种肠虫生活期的不同阶段(如，幼虫和成虫阶段)之间的变异体、不同地理源的相似株之间的变异体，也可在相同肠虫内部出现变异体。这种变异体包括在本发明的内容中。
这里使用的“本质上同源”包括那些具有约50％或更多，如60％或更多的序列同源的序列，也包括功能相当的等位变异体，和通过单个或多个碱基取代、增加和/或缺失修饰的相关序列。“功能相当”的含义是对具有抗氧剂或β-微管蛋白功能的多肽进行编码的核酸序列，所述的多目太是指有相似的免疫性，即增加寄主抵抗肠虫的保护性抗体。
与图2和图4所示的序列杂交的核酸分子或与上文定义的任何本质上同源或功能相当的序列也包括在本发明的内容中。这里，“杂交作用”的含义是在非严格条件下(室温下，6×SSC/50％甲酰胺)与那些序列结合，在低严格条件(室温下，2×SSC，或更优选为42℃下，2×SSC)、或更严格条件下，如65℃下，2×SSC(这里SSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠，pH7.2)，进行洗涤的核酸序列。
通过如点突变、随机突变、或核酸的酶解和/或连接来制备这种核酸在工艺上是人所共知的，这种修饰的核酸是否与目标序列具有显著的同源性就是通过杂交作用来决定的。
根据本发明的一种核酸分子提供能够得到大量的以前不能得到的重组过氧氧化还原酶或β-微管蛋白或其致免疫片段，从而允许开发抗肠虫疫苗。
本发明的另一方面在于提供包含一个或多个核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列对一个或多个能产生抗肠虫寄生的保护性抗体的多肽进行编码，该序列与来自于如图2和图4所示的编码过氧氧化还原酶或β-微管蛋白一个或多个的抗原决定簇区的序列结合为一体。
本发明也延伸至合成多肽，包括一个或多个组成过氧氧化还原酶或β-微管蛋白分子或其抗原部分的氨基酸序列，本质上对应于部分或全部如图2和图4所示的核苷酸序列，或一种功能相当的变异体。
与上文相关的本发明的另一些方面包括含有一个或多个定义如上的核苷酸序列的载体；由这样的载体，比如杆状病毒载体转化的寄主细胞，例如细菌E.Coli，或酵母细胞，如沙门菌属spp.，或更优选为真核细胞；用于制备重组过氧氧化还原酶和β-微管蛋白多肽或抗原片段或抗原决定簇的工艺，该工艺包括培养这些转化寄主细胞和从培养的细胞中分离所述过氧氧化还原酶或β-微管蛋白多肽或抗原片段或抗原决定簇。
一个改变了活性的或失活的疫苗配方可以包含一种减毒的或有毒的病毒或一种寄主细胞，比如，象细菌这样的微生物，插入根据本发明的一种核酸分子(如一种DNA分子)，用于由被插入核酸分子编码的多肽刺激一个免疫应答。特别优选一种细菌载体，该载体可诱出对一种吸虫抗原的局部肠粘膜的免疫性，进而阻塞幼虫吸虫的迁移，其显著的品种如沙门菌属。
本疫苗中还可以存在其它的抗原物质，从而给出对所述寄生肠虫的一个增强的保护作用，或对一种或多种其它寄生虫感染的联合保护作用。
本发明的另一方面提供单克隆或多克隆抗体，当所述哺乳动物服用后，这些抗体能够诱导出哺乳动物对过氧氧化还原酶或β-微管蛋白分子的免疫性，此类抗体具有对一种或多种进一步的抗体的可变区的亲和力，所述进一步的抗体具有对所述硫醇特异的过氧氧化还原酶或β-微管蛋白分子的亲和力。
这一方法即所谓“抗一个体基因型”方法，该方法允许完全不采用原始抗原配制一种疫苗的配方，且可以在安全性、防止副作用和方便制造方面提供更多的优点。
附图简述

图1免疫选择PCR扩增插入gtll克隆的。阳性克隆是由采用通用λ正向和逆向引物的PCR扩增的。通过琼脂糖凝胶电泳对每个PCR反应样品进行了分析。
道1,12,23pGem DNA标准样品道2 克隆D6道3和4 克隆B5、D5道5-11 克隆A1、A4、A5、B1、B4、B6、E3道13克隆C4道14-17 克隆C2、D1、D7、E2道18克隆D8道19和20克隆C1、D3道21克隆A8道22克隆E4图2β-微管蛋白(克隆D6)的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列。
图3
克隆D6对弓形虫属β-微管蛋白预测氨基酸序列的排列。
部分D6序列推导的氨基酸序列与来自弓形虫属gondii(基因库编号P10878,Nagel和Boothroyd,1988)的β-微管蛋白是匹配的。方框圈出了同源的部分，图中有一些中断线是为了给出最大的匹配。Z=未确定。
图4过氧氧化还原酶(克隆B1)的核苷酸序列和预测氨基酸序列的。
图5克隆B1的预测氨基酸序列的排列。
克隆B1推导的氨基酸序列与大鼠的硫醇特异抗氧化剂(TSA，基因库编号P35704)、人的天然的杀伤细胞增强因子B(NKEF B编号P31945)、人的增殖相关基因(PAG，编号X67951)。人的TSA(Lim等，1994，编号P35704)和盘尾丝虫属肠扭转TSA(编号U09385)是匹配的。方框表示保守的残基，图中有一些中断线是为了给出最大的匹配。箭头指示活性中心半胱氨酸残基。
图6克隆B1融合蛋白的表达。
A. 野生型噬菌体(道1)和克隆B噬菌体(道2)洗涤上清液的SDSPAGE平板电泳和银染。
B. 电泳之后，SDS凝胶被转印至硝化纤维素上并用抗β-半乳糖苷酶抗体进行检测。道1含有野生类噬菌体的上清液，道2含有克隆B1上清液。大箭头指示β-半乳糖苷酶的位置。小箭头指示B1重组融合蛋白的位置。
图7肝片吸虫和牛肝的总RNA的Northern blot分析结果。
肝片吸虫(道1)和牛肝(道2)的总RNA在甲醛琼脂糖凝胶中电泳，转移至硝化纤维素膜，并用32P标记的400bp片段探针进行检测。图上标出了RNA的大小。
图8
肝吸虫匀浆对谷氨酰胺合成酶抗DTT/Fe3+体系的保护。0.5U谷氨酰胺合成酶(GS)在失活液IS(15μM FeCl3和5mM DTT)存在的条件下，分别加0.3mg、0.6mg和0.9mg肝吸虫匀浆(LFH)，在37℃保温10分钟。然后测定反应物残留的谷氨酰胺合成酶活性。
发明的详述1.材料α32P dATP购自Amersham,RNAzolTMB购自AMS生物工程有限公司，X-Omat X射线胶片、FX40定影液、LX24显影剂667宝丽来胶卷都从Kodak公司购得。琼脂糖、碱性磷酸酯酶标记的鼠抗-β半乳糖苷酶抗体、ApaⅠ、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷酶(X-Gal)、dNTP’s、EcoRⅠ、HindⅢ、异丙硫醇-β-D-半乳糖苷酶(IPTG)、pGem DNA标准样品、pGem载体系统、Prime-a-Gene系统、SacⅠ、TaqDNA聚合酶、WizarDTMλpreps、WizarDTMDNA纯化系统均购自Promega公司。腺嘌呤二磷酸(ADP)、碱性磷酸酯酶标记的兔抗牛IgG、二乙基焦碳酸盐(DEPC)、二硫苏糖醇(DTT)、谷氨酰胺、谷氨酰胺合成酶、溶菌酶、蛋白酶K、鲑鱼精DNA都购自Sigma化学公司。
2．肝片吸虫λgt11 cDNA表达库的免疫筛选λgt11 cDNA库的制备λgt11 cDNA库通过下述标准方法(Promega手册)制备。采用RNAzoLTM从成熟的成年吸虫中分离出总RNA，通过一种寡DT柱分离出mRNA。采用RiboclonecDNA合成试剂盒从mRNA产生双股cDNA。EcoRⅠ粘着末端加至cDNA，再连接至gt11粘着末端并使用Packgene系统将它包装到λ头内。滴定包装的噬菌体，然后通过用稀释的噬菌体感染噬菌体感受态E.Coli Y1090细胞(在含有0.2％麦芽糖和10mM MgSO4的LB培养基中过夜培养)，室温下培养20分钟，然后将细菌涂布在含有100μg ml-1氨苄青霉素的LB琼脂板上。对所包装的噬菌体进行扩增。
血红蛋白馏分部的制备在爱尔兰的一个本地屠场宰杀牛，从其感染的肝的胆管中取出成熟的肝片吸虫。该吸虫在pH值为7.3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤6次，然后在37℃下，于pH值为7.3、含有2％葡萄糖、30mM HEPES和25mgml-1庆大霉素的RPMI-1640中培养18个小时。经过该培育期之后，除去培养液，12,00xg离心30分钟，收集上清液(ES产物)并在-20℃贮存。
在Amicon8400超滤装置(Danvers,MA,USA)上用YM3膜将500ml的ES产物浓缩至15ml。浓缩产品以离心力为12,000xg进行离心30分钟，并加载至340ml的Sephacryl S-200柱上，该柱用pH值为7.0的0.1M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液在4℃平衡。在死体积(110ml)通过之后分部收集(5ml)。洗脱液使用Atto UV监测器选用280nm进行监测。那些含有血蛋白的分部(黄色)合并收集并在Amicon8050超滤装置上浓缩至5ml。该浓缩物称为血红蛋白分部(Hf)。
用于免疫筛选的血清的制备使用来自于接种上述血红蛋白分部(Hf)的动物的合并血清对cDNA库进行了免疫筛选。所述血清是在三次接种Hf之后和寄生虫攻击之前得到的。使用前，血清经过预吸附以除去所有与E.coli蛋白反应的抗体。这是通过用含有结合E.coli蛋白的硝化纤维素圆片在室温下与血清保温6小时而实现的。该吸附步骤重复三次。该圆片的制备工艺如下于4℃下，在超声萃取(10×30秒bursts，萃取周期0.7秒)E.coli细胞液中培养圆片24小时，然后用1％的BSA/T-PBS阻塞剩余的位点。血清与圆片保温、取血清、离心后、并在4℃贮存备用。
λ库的免疫筛选用1∶50稀释的噬菌体感染噬菌体感受态E.coli Y1090。在室温下培养20分钟之后，将细胞铺在含氨苄青霉素的LB琼脂板上并在42℃培养，直到能看到噬菌斑(约3小时)。已在10mM的IPTG中浸泡过并在空气中干燥的硝化纤维素圆片被轻轻置于上述板上，它们的位置由三个针状刺标出。将上述板在37℃下培养4小时，然后小心地取下硝化纤维素圆片，在1％的BSA/T-PBS中阻塞过夜，用预吸附的牛抗血清(1∶500的稀释液)进行测试。在T-PBS中洗涤之后，抗体用碱磷酸酯标记的抗牛IgG和NBT和BCIP底物检测结合的抗体。阳性噬菌斑表现为紫色圆圈。用无菌巴斯德吸管将这些噬菌斑作为琼脂栓移去，转移到1ml噬菌体缓冲液中(10mM MgSO4、100mM NaCl、20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.4)，并在4℃下扩散过夜。单个的噬菌体重新铺板并再重复两次抗体筛选，或直到获得纯的噬菌斑，即板上所有噬菌斑都与抗体进行反应。
3．λ溶胞产物的制备和DNA的分离被分离的噬菌斑放入200微升0.1xSM缓冲液中(0.01％明胶，8mMMgSO4,100mM NaCl,50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.5)4℃下培养过夜，100微升用于感染竞争体Y1090细胞，这些细胞是如同上述方法铺板的，并在42℃下培养直到观察到溶菌为止(约5小时)。4毫升0.1xSM缓冲液加到该板上，在4℃下培养过夜之后移去缓冲液。加入氯仿(最终浓度为0.5％)，溶胞产物在4℃贮存备用。
4．λDNA的PCR分析使用通用λ引物，多聚酶链反应(PCR)用于分离和测定从噬菌体库插入物的大小。这些引物来自λgt11载体的EcoRⅠ克隆位的侧面序列。20微升储备λ溶胞产物加入到180微升的水中并煮沸10分钟，然后，每50微升PCR使用1微升该溶胞产物。每个PCR管装有下列混合物10x多聚酶缓冲液 5.0微升dNTP(每种1mM)5.0微升MgCl2(25mM) 6.0微升无菌蒸馏水 30.7微升λ进向引物(50ngμl-1) 1.0微升λ反向引物(50ngμl-1) 1.0微升Taq多聚酶(5U μl-1) 0.3微升λ溶胞产物DNA1.0微升每个混合都用70微升的矿物油复盖，放入Hybaid OmnigeneThermal Cycler中，PCR如下进行阶段1(变性作用)94℃下4分钟阶段2(变性作用)94℃下30秒(退火) 55℃下1分钟(延伸) 74℃下1分30秒阶段2重复35次阶段3(延伸)74℃下4分钟按照Sambrook等的详细描述(1989)，用琼脂糖凝胶电泳分析25微升的PCR反应物。
5．PCR片段的亚克隆PCR扩增的基因片段从凝胶上切下。用玻璃珠破碎该琼脂糖，回收的DNA用WizardTMDNA纯化系统(Promega)进行纯化。然后，该片段直接亚克隆到pGem-T质粒，如下所述1微升(25ng)pGem-T载体，8微升连接酶缓冲液(10mM ATP,100mM MgCl2,100mM DTT,300mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.8),1U T4 DNA连接酶和100ng插入DNA缓慢混合，并允许该连接于4℃下继续过夜。
感受态细胞用下列方法之一进行制备(a)氯化钙转化对数生长期的E.coli JM109细胞培养液被等分，放在冰上5分钟，以12,000xg离心2分钟，然后移去上清液。该细胞用1ml冷却CaCl2缓慢再悬浮并在冰上培养30分钟。该细胞再次离心并再次悬浮于0.5ml的冷却CaCl2中。10微升的连接混合物缓慢加入到50微升的细胞等分液中并在冰上再放置30分钟。然后将该细胞在42℃加热振荡90秒钟，再返回到冰上放置2-5分钟。转化之后立即加入950微升的预热LB培养液，并将该细胞在37℃下培养1小时。细胞经过离心浓缩并铺在含有100μgml-1氨苄青霉素、0.5mM IPTG和40μg ml-1X-Gal(用于蓝/白选择)的LB板上。
(b)电激对数生长期的E.coli XL1-蓝色电激感受态细胞经离心浓缩后等分。2.5微升的连接反应物加入到300微升细胞中，缓慢混合并置于0.2μm的电激杯中。该细胞在下列条件下通过电激转化脉冲发生器设置为25μF、2.48kV和200Ω。这种设置下的一个脉冲导致一个12.5kV cm-1、时间常数约为4秒的脉冲。在如前所述的浓缩和铺板之前，立即加入1ml的预热SOC(含有20mM的葡萄糖)培养液，并将该细胞在37℃下培养1小时。带有转化细胞的板在37℃下培养过夜。
6．重组质粒的筛选采用X-Gal和IPTG颜色筛选，重组克隆应为白色，而无插入DNA的为蓝色。白色克隆放入2ml的含有100μg ml-1氨苄青霉素(和15μg ml-1用于蓝细胞的四环素)的LB板中，并在37℃下培养过夜。用Sambrook等(1989)描述的煮沸或碱法从1ml这种微量制备培养液中分离质粒DNA。该DNA用限制酶SacⅠ和ApaⅠ双酶切，并在琼脂糖凝胶电泳上观察插入物。
7．质粒DNA测序用WizardTMλpreps进一步纯化来自阳性克隆的纯化的质粒DNA。该DNA送到Durham大学生物学系或都柏林Trinity学院的BioResearchIreland进行序列分析。
8．融合蛋白的制备序列分析表明克隆B1是一种新的吸虫抗氧化剂蛋白质(过氧氧化还原酶)，因此对其进行了进一步表征。通过板洗涤上清液方法从λB1克隆中制备了融合蛋白。用10,000pfu重组噬菌体感染噬菌体感受态E.coli Y1090，并于室温下培养20分钟，然后倒入含氨苄青霉素的LB板上。该板在42℃培养3小时(溶菌几乎连合)，然后将含有1mM EDTA、1mMPMSF、1mM碘乙酰胺和10mM IPTG的5ml噬菌体缓冲液加入到该板上并在37℃培养过夜。将缓冲液回收，而将顶部琼脂刮入离心管中。旋转振荡20秒钟之后以10,000xg在4℃离心10分钟。将上清液移到microfuge管中再在12,000xg的条件下离心。将上清液于-20℃贮存备用。
该融合蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过银染和用抗-β半乳糖苷酶第一抗体进行免疫印迹分析。
9．放射性标记DNA探针的制备通过比较过氧氧化还原酶抗氧化剂家族的蛋白质序列，用下列一致的引物从克隆B1 DNA对一个400碱基对的片段进行PCR扩增。这些引物复盖编码保守的活性中心区域半胱氨酸47(VCP47)和半胱氨酸168(VCP168)。
VCP47进向引物(Shem F)5’GAT TTY ACW TTY GTN TGT CCW ACW GAR-3’
VCP168反向引物(Sm TSAR)5’GGW CAN ACY TCW CCA TGY TC-3’这里，Y=T或C,W=A或G,N=TC、A或G该PCR产物从琼脂糖凝胶切下来并按前文所述进行纯化。采用Promega Prime-a-Gene系统通过随机引物用α32P标记该片段。该反应混合物如下5X标记缓冲液 10微升(250mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0，25mM MgCl2,10mM DTT,1mM HEPES,pH6.6，26A260单位ml-1随机六脱氧核糖核苷酸)dCTP dGTP dTTP(每种100mM)的混合物2微升乙酰化BSA 10mg ml-12微升变性DNA探针 25ng无菌水 25微升α32P dATP(50μCi,3,000Ci mMol-1) 5微升Klenow酶 5U将反应管缓慢混合并于室温下保温1小时。加入200微升的0.5MEDTA，通过煮沸2分钟使反应终止。现在探针就准备好可用于杂交反应。
10.RNA的分离和northern blottinga．成年吸虫RNA的分离成熟吸虫在pH7.3，含有2％葡糖、30mM HEPES和25mg/l的庆大霉素的RPMI-1640中培养过夜，以便清除可能含有寄主细胞的肠道容留物。将大约10个吸虫(1克组织)置于离心管中，加入5ml RNAzolTM，用一种Thyristor Regler TR50匀浆器以最快速度使吸虫匀浆化30秒。加入1ml的氯仿，剧烈摇动该溶液15秒，然后置于冰上5分钟。等分至microfuge试管之后，以13,000xg的离心力于4℃对该溶液离心15分钟，形成两层。将上部水相移至一个新试管，加入等体积的异丙醇，然后将该样品于4℃放置15分钟(或等分用于在-80℃下长期贮存)。将它们再次离心15分钟，移去上清液，用75％乙醇清洗RNA小球，然后进行干燥并用200微升0.1％的DEPC处理过的水进行重悬浮。采用相同步骤，以1克新鲜牛肝作为初始材料分离牛的RNA。按照Sambrook等人(1989)所述，采用含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳分析RNA。
b．Northern blotting电泳之后，用DEPC处理过的水淋洗凝胶以除去甲醛，采用Sambrook等人(1989)所述的毛细管转移法将RNA转移至硝化纤维素膜上。在缓冲液的流动中，RNA片段从凝胶中流出并沉积于硝化纤维素表面。转移之后，通过在一个烘箱中于80℃2小时，使RNA固定至膜上。
c．放射性标记探针的杂交硝化纤维素膜浸泡至6X SSC(0.9M NaCl,90mM柠檬酸钠，pH7.0)中直到完全润湿并置于一个热封袋中。然后，在该袋中加入200ml预杂交溶液(6X SSC、5X Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg ml-1变性的、裂成片段的鲑鱼精DNA)。从密封袋中挤出尽可能多的空气，并将该袋于68℃保温过夜。保温之后，通过除去一个角而打开该袋，并小心加入放射性标记探针之后，将该密封袋置于第二个密封袋中并于68℃培养24小时。缓慢将该杂交溶液倒入一个合适的容器中，将膜并立即浸入300ml的2X SSC和0.1％SDS中。该膜于室温下缓慢搅拌保温15分钟。清洗液更换两次并重复保温。然后，将0.1X SSC和0.5％SDS加到膜上，并于68℃进一步保温1小时。用0.1X SSC淋洗膜以便除去SDS，用纸巾将膜上溶液简单地吸掉并用保鲜膜包裹，然后在-80℃进行X-射线胶片感光以获得放射自显影图象。要获得一个好图象，需要用一个增光屏在-80℃感光24小时。
11．用于新型抗氧化剂活性的成熟吸虫萃取物的试验通过监测抑制谷氨酰胺合成酶的硫醇/铁/氧中介的失活的能力来测定成熟肝吸虫萃取物中的抗氧剂活性。在失活溶液和保护质蛋白(肝吸虫匀浆)存在或不存在条件下，在含有0.5U谷氨酰胺合成酶〔E.coli〕的100微升反应体积的微滴板中进行测试。失活溶液由15μM FeCl3和5mM DTT或14mM 2-硫氢基乙醇(最终浓度)组成。于37℃保温10分钟之后，通过加入100微升的γ谷氨酰基转移酶测试混合物来测定剩余谷氨酰胺合成酶的活性。这含有在50mM咪唑盐酸中的0.4mM ADP、150mM谷氨酰胺、10mM砷酸钾、0.4mM氯化镁、20mM氯化羟铵组分，pH7.0。该反应于37℃保温30分钟之后，通过加入50微升终止混合物来终止反应，该终止混合物由每升55克FeCl3.6H2O、20克三氯乙酸和21ml浓盐酸组成。在540nm处测试γ谷氨酰基羟胺-Fe3+络合物的吸光度。在缺少“保护质蛋白”条件下，70至100％的谷氨酰胺合成酶活性都失掉。
12．肝片吸虫cDNA库的免疫筛选和通过PCR和限制酶酶切对分离的克隆进行分析以及限定性消化来自疫苗试验的牛血清用于筛选λgt11噬菌体构建的肝片吸虫cDNA库。所用的血清库是在用血红蛋白分部(Hf)免疫的动物接种寄生物第11周那天得到的。这些动物表明抵抗寄生攻击的平均水平为43.8％。该血清应当含有能与血红蛋白和任何其它存在于免疫分部中的抗原反应的抗体。
采用1∶1500稀释的预吸附血清进行初筛时使用了十个板，每个板上有约2,000pfu。选择了30个阳性噬菌斑再进行三到四轮的筛选，直到板上所有的噬菌斑都是阳性的，这表明为纯克隆。然后制备阳性噬菌斑的溶菌产物，并使用λ进向和逆向引物通过PCR分析DNA。在所选择的30个阳性噬菌斑中，只有20个产生PCR产物；故忽略掉剩下的10个。根据PCR片段(图1)的大小将克隆分组。
组号 PCR片段的大小克隆1 ～1700bpD62 ～1600bp B5和D53 ～1400bpA1、A4、A5、B1、B4、B6、E34 ～1100bpC45 ～1000bp C2、D1、D7、E26 ～900bp D87 ～700bp C1和D38 ～650bp A89 ～550bp E413.噬菌体插入物的亚克隆用第一组克隆(1700bp)的D6和第三组(1400bp)的B1进行亚克隆。这两个克隆的λPCR产物被直接亚克隆到pGem-T质粒上。选取白色克隆并用SacⅠ和ApaⅠ限制酶双酶切进行筛选。从D6中分离出一个带有一个1600-1700bp插入的克隆，从克隆B1中获得了一个带有一个1400-1500bp插入的克隆。
14．克隆D6的序列分析来自重组质粒的DNA在纯化后用WizardTMλprep进行了商业测序。从克隆D6获得了约420碱基的部分序列。推导出的141个氨基酸序列与现有数据库的序列进行了比较，并发现与来自各种生物的β-微管蛋白的C-末端有明显的同系性。β-微管蛋白是长度为440-450个氨基酸的蛋白质，对应于约1320个碱基，故约1700个碱基的克隆D6可能含有整个肝片吸虫的β-微管蛋白基因。图2显示了部分D6序列与来自弓形虫属gondii的β-微管蛋白的对位情况。在重叠部位，D6序列显示了与来自原虫的微管蛋白C-末端有64％的一致性和73％的相似性。
15．克隆B1的序列分析通过使用λ引物的PCR扩增估算克隆B的插入长度为约1400bp。近似地，该插入物的1200个碱基以5’到3’方向上排序。这揭示了一个起始密码ATG和一个约580碱基的开放阅框架，一个在框内的终止密码TAG。终止密码的下游是约20个腺嘌呤残基(PolyA尾部)，其前面是两个多腺嘌呤化序列，AAAATAAA和AATA，说明该克隆在其3’端结束。该DNA具有一个约200碱基的5’非转译的部位和一个约700碱基的3’非转译的部位。
预期克隆B1编码一个具有计算分子量为21,646Da的194个氨基酸的蛋白质。当用于筛选蛋白质序列数据库时，预期的氨基酸序列显示了与一种新型的抗氧剂蛋白质家族的高度同一性，该家族为过氧氧化还原酶家族。图3所示为克隆B1与鼠硫醇特异抗氧剂(TSK，基因库编号为P35704)、人的天然杀伤细胞增强因子B(NKEF B，编号为P31945)、人的增殖相关基因(PAG，编号为X67951)、人类TSA(Lim等，1994，编号为P35701)、和盘尾丝虫属肠扭转TSA(编号为009385)的排位图。
具有最高同一性的蛋白质为大鼠TSA；57％和74.6％相似性。其它同一性如下人NKEF B 56.9％，(71.5％类似性)人PAG 53.8％(73.0％类似性)，人TSA 53.7％(71.0％类似性)和盘尾丝虫属肠扭转TSA2.0％(33.7％类似性)。在该序列的整个长度都观察到相似性，并观察到两个高度保守区域。第一个是在约40-60部位的16个氨基酸，-F Y P L DF T F V C P T E I I A-。第二个发现在约165-175部位的短区域一H G E V C P A-。
16.克隆B1对融合蛋白的表达板清洗上清液方法用于从克隆B1噬菌体中制备融合蛋白。在还原SDS PAGE上分析了所得的上清液和从已感染野生型噬菌体的E.coli所得的上清液(图4A)。在野生型制品中，观测到了具有与β-半乳糖苷酶相同分子量的一种蛋白质(道1)。在B1上清液中，没有这个蛋白，但是观测到一个分子量约为160kDa的较大蛋白质(道2)。该蛋白在野生型中未观测到。为确定这个蛋白是否是融合蛋白，将凝胶吸至硝化纤维素纸上，并用抗β-半乳糖苷酶抗体(图4B)进行探测试。该抗体与大蛋白结合证实了作为β-半乳糖苷酶融合蛋白(道2)的同一性。抗体也将野生型β-半乳糖苷酶分子(道1)和许多其它蛋白共同结合至这两个上清液中。
17．Northern分析从抗氧化剂蛋白的保守区(在约50-170部位的VCP motifs周围)设计的引物用于扩增一个长度约为400bp的DNA片段。该片段是32P标记的，用于探测肝片吸虫和牛RNA，在一种琼脂糖凝胶上对其进行了分析。在肝片吸虫RNA(图5，道1)中发现了一个约750kb的单个转录。在牛RNA(图5，道2)中未观测到类似过氧氧化还原酶结合。
18．成熟吸虫萃取物的抗氧剂活性抗氧剂活性是通过一个混合的铁硫醇失活系统作为肝吸虫萃取物阻止谷氨酰胺合成酶失活的能力被测定的。图6显示了在各种浓度的肝吸虫匀浆(LFH)存在条件下，谷氨酰胺合成酶被铁和DTT失活。用铁和DTT与谷氨酰胺合成酶保温导致了70％的酶活性损失。LFH的存在提供与剂量有依赖关系的保护，用0.3mg、0.6mg和0.9mg的LFH分别恢复50％、61％和75％的谷氨酰胺合成酶活性。
文献目录Lim.,Y.S.,Cha,M.K.,Kim,H.K.和Kim,I.H.1994，来自于人脑的硫醇特异抗氧剂蛋白质基因克隆和保守的半胱氨酸部位分析。基因，140,279-284。
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Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.1989.分子克隆实验室手册，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press。
UK专利号为2169606BWO94/09142WO94/2892权利要求
1．一种用于抗哺乳动物的肠虫寄生感染的疫苗配方，其特征在于抗原材料包括一种过氧氧化还原酶和/或一种β一微管蛋白分子，至少为部分纯化形式，或一种抗原片段或抗原决定簇、组分、前体、类似物、变异体或与其功能相当的衍生物，还有一种载体和/或佐剂一起组成的抗原材料。
2．根据权利要求1所述的一种疫苗，其特征在于所述抗原材料取自于大片吸虫或双腔吸虫种。
3．根据权利要求1或2所述的一种疫苗，其特征在于所述抗原材料取自于肝片吸虫。
4．根据权利要求1至3任何一条所述的疫苗，其特征在于参入疫苗的所述抗原分子至少为75％的纯度。
5．根据权利要求4所述的一种疫苗，其特征在于参入所述的疫苗的抗原分子至少为95％的纯度。
6．根据权利要求1至5任何一条所述的疫苗，其特征在于进一步包括一种或多种的抗原决定簇形成一种多价疫苗。
7．根据权利要求6所述的一种疫苗，其特征在于可以是组织蛋白酶L型抗原和/或二肽酶抗原和/或一种血蛋白抗原的抗原决定簇。
8．在制备用于抗哺乳动物的肠虫寄生感染的疫苗配方中使用的是吸虫的过氧氧化还原酶和/或一种β-微管蛋白分子。
9．一种抗哺乳动物的肠虫寄生感染的方法，其特征在于包括所述权利要求1至7任何一条定义的哺乳动物疫苗，其施用量能有效抵抗所述感染。
10．一种依权利要求1至7定义的任何一种疫苗的制备工艺过程，其特征在于包括纯化了的过氧氧化还原酶和/或一种β-微管蛋白分子和一种或多种佐剂或载体。
11．编码β-微管蛋白分子和/或过氧氧化还原酶分子的DNA分子或一个片段或其同源物的核苷酸序列如图1、2所示。
12．一种如图2或图4所示的氨基酸序列的蛋白质或其多肽片段。
13．一种载体，其特征在于包括一种或多种如权利要求11所定义的核苷酸序列。
14．一种转化的寄主细胞，其特征在于包括权利要求13所述的载体。
15．一种合成多肽，其特征在于包括，一种或多种组成一种过氧氧化还原酶和/或一种β-微管蛋白分子的氨基酸序列及其抗原部分的氨基酸序列，本质上对应于图2和/或图4所示的氨基酸序列的全部或一部分，或与其功能相当的变异体。
16．一种制备重组过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白多肽或其抗原片段或抗原决定簇的工艺过程，其特征在于包括培养转化了的寄主细胞并从该培养细胞中分离出所述的过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白多肽或片段或抗原决定簇。
17．一种活的或失活的疫苗配方，其特征在于包括一种减毒或有毒性病毒，或一种寄主细胞，该寄主细胞已经插入一种如权利要求11所述的核酸分子，并能激起一种对由插入核酸分子编码的多肽的免疫应答。
18．当施用单克隆或多克隆抗体给哺乳动物时，能够诱导对过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子的免疫性，所述抗体具有对一种或更多种抗体的可变区域具有亲和性，所述更多的抗体是对所述过氧氧化还原酶和/或β-微管蛋白分子具有亲和性。
全文摘要
本发明涉及含有过氧氧化还原蛋白酶和/或β－微管蛋白抗原物质所组成的疫苗。肝片吸虫或双腔吸虫的疫苗较适合用在抗哺乳动物肠虫的寄生传染。进一步涉及编码过氧氧化还原蛋白酶和/或β－微管蛋白分子的核苷酸序列及其氨基酸序列,包含新述的核苷酸序列的载体以及用该载体转化的细胞。
文档编号C07K14/435GK1221451SQ9719542
公开日1999年6月30日 申请日期1997年6月11日 优先权日1996年6月11日
发明者约翰·派厄斯·多尔通, 斯图尔特·约翰·安德鲁斯 申请人:约翰·派厄斯·多尔通, 斯图尔特·约翰·安德鲁斯