专利名称：血管内皮生长因子表达的反义抑制物的制作方法
相关申请的交叉参考文献本中请优先权依据一项暂时共同未决的申请，其申请的序列号60/015,752/，提交日期1996年4月17日关于联合研究或开发发起人的声明不适用发明背景发明领域本发明涉及利用寡核苷酸的血管内皮生长因子表达的细胞抑制。本发明的寡核苷酸可与目标mRNA以序列特异性的方式结合，并阻碍其编码的VEGF基因的表达。公开了为提高稳定性和结合效率所作的寡核苷酸化学修饰。该寡核苷酸组合物可用于离体治疗巨噬细胞，或者通过注射、吸入或局部治疗或其它给药途径用于体内治疗。
相关技术的说明书血管内皮生长因子(VEGF)也称为血管通透因子，包括一族同源双螺旋的分泌糖蛋白，其分子量介于34-46Kda。它可由多种类型的细胞应答缺氧和特定调控因子而分泌。目前已知有四种VEGF的同型体。它们是由同一基因编码的mRNA通过不同的剪切方式形成的。(Keck等人，1989；Leung等人，1989；Connolly和Plander,1989；Tischer等人，1991)VEGF对于生长和发育过程中血管的形成和组织恢复是必需的(Ferrera，等人，1996；Carmeliet等人，1996；Thomas,1996；Dvorak等人，1995a,b；Folkman,1995；Ferrera等人,1992)。这种生长因子诱导血管的通透性，是单核细胞和成骨细胞的趋化因子，并且是内皮细胞的一种选择性促分裂原。VEGF的受体蛋白(在人中为KDR和Flt-1)属于跨膜酪氨酸激酶家族(Terman等人，1992；de Vires等人，1992)。受体的激活可引发导致血管内皮细胞生长速度明显地提高以及最终新血管生成的一系列的事件。VEGF比其它参与血管发生的蛋白质因子在诱导内皮细胞生长上更有选择性。不幸的是，在特定情况下VEGF的存在可能会有有损于健康的效应。
异常高浓度的VEGF常常与一些以高度的血管形成和血管通透性增加为特征的疾病有关。这些疾病包括糖尿病性视网膜病，侵袭性肿瘤，牛皮癣，类风湿性关节炎及其它的一些炎症情况(D′Amore,1994；Dvorak等人，1995a,b；Folkman,1995)。因此需要一些组合物和方法用于选择性地降低不正常的高VEGF浓度以减少VEGF介导的新血管形成。这些方法和组合物可被用于减缓以新血管形成和血管通透性为特征的疾病进程。
一种用于降低VEGF浓度的方法包括利用反义寡核苷酸(Wagner,1994)。这一技术的关键优势在于可以实现特异性的抑制。有效的寡核苷酸被认为可以结合于mRNA特异的序列上，并干扰其编码基因的表达。蛋白质表达的减少可能是由于对核糖体功能的抑制，降低了可转录的底物mRNA的浓度或者其它的机制。此外，寡核苷酸可通过一种寡核苷酸介导的促进mRNA分子降解速度的增加来降低mRNA的浓度。通常长约15个碱基的寡核苷酸就足够提供与目标RNA靶点的序列特异性的结合，虽然短一些的寡核苷酸有时也能结合(Uhlman和Peyman,1990)。然而，在体外实验中用于降低蛋白质表达的反义寡核苷酸长度一般为11-30个碱基(综述Uhlman和Peyman,1990)。
要将反义治疗方案的潜在优势用于疾病的治疗手段，还必须克服一系列障碍。例如，反义寡核苷酸是一些大的亲水性化合物(大约3,000到10,000D)，而在它们结合于细胞质或细胞核中的目标之前，必须穿过疏水性细胞膜(Ulhmann和Peyman,1990；Miligan等人，1993)。因此，需要促进VEGF反义寡核苷酸穿过细胞膜的运输方法。治疗所用的寡核苷酸也必须是无毒的，且不能干扰正常的细胞代谢。为了减少这些非特异性效果，它们与其识别的序列结合必须要有高度的特异性和亲和力。
具有天然磷酸二酯骨架的寡核苷酸对血清及细胞核酸酶高度敏感。随机的17个碱基长的寡核苷酸在血清中的半衰期小于3分钟(Bishop等人，1996)。在能用作治疗新血管形成疾病的治疗手段之前需要增加寡核苷酸的稳定性。利用硫代磷酸酯替换磷酸二酯基团能提高寡核苷酸的半衰期。它们应为化学惰性的，且在多种化学环境下有核酸酶抗性。然而，这种寡核苷酸此前从未表明以选择性方式抑制VEGF的表达。
以前已知的硫代磷酸酯寡核苷酸的一种缺陷是，为了降低VEGF的表达这种寡核苷酸的浓度要达到1μM(Nomura等人，1995；Robinson等人，1996)。在这种浓度下，这些寡核苷酸有毒性(Woolf等人，1992；Stein和Cheng,1993；Stein和Kreig,1994,Wagner,1994；Fennewald等人，1996)。且观察到的效果可能是这种非特异性毒性造成的(Fennewald等人，1995)。需要一种新型寡核苷酸抑制物，通过在无毒的浓度下抑制VEGF的表达证明一种真正的反义效果。这些寡核苷酸可能有相对于现有的VEGF反义寡核苷酸来说有更高的结合常数和/或对其目标mRNA序列增加的特异性。
关于现有的VEGF反义寡核苷酸有限的效果有几种可能的解释。一种可能性是目标RNA序列可被限制在一个大分子结构中，该结构从空间上阻碍了寡核苷酸的结合。例如，RNA结合蛋白和蛋白质翻译复合物可能会阻碍寡核苷酸的结合。此外，寡核苷酸可能无法与一种不利构象的mRNA结合。另外，有效的目标序列的位置是多变的。有效的目标序列可能位于目标mRNA转录本的任何位置上，且以翻译起始密码子或5’非翻译区为靶的寡核苷酸就并不是总是有效的(Wanger等人，1993；Fenster等人，1994)。寡核苷酸与其它分子如蛋白质之间的非特异性相互作用也同样可以导致不同的生物学活性(Woolf等人，1992；Stein和Cheng,1993)。而且，寡核苷酸本身也许会采用一种意想不到的三级或四级结构在意料之外的位置上与DNA结合。这些不正常的结合可能会产生一些意外的生物学效果(Chaudhary等人，1995)。
在寻找有效的反义寡核苷酸的过程中还遇到过其它的困难。寡核苷酸与目标RNA之间的亲和力随着片段长度和G-C含量的增加而增加。然而，较长的寡核苷酸易于与RNA或其它的寡核苷酸片段进行非特异性的结合。而且，高G组份的寡核苷酸易形成G-四聚体，从而减少反义结合所必需的自由-螺旋状态的寡核苷酸的数量(Bioshop等人，1996)。因此，寡核苷酸应该是比较短且对于其目标序列有较高的亲和力，即使有较高的G含量也不会形成G-四聚体。
如前所述，寡核苷酸是一种大的亲水性化合物，它必须穿过疏水性细胞膜才能同细胞质或细胞核中的目标结合(Uhlmann和Peyman,1990；Milligan等人，1993)。但是由于它们比较大的尺寸、亲水性本质以及带有负电荷，寡核苷酸不能有效地穿过细胞膜。在没有细胞吸收增强剂的存在下，寡核苷酸倾向于在受试细胞的前核内质网成分中积累(Fisher等人，1993；Guy-Caffey等人，1995)。在这种情况下，寡核苷酸穿过质膜或内质网膜的输运限制了其内化的速度和其活性。因此，需要一种新的组合物和方法以促进寡核苷酸穿过脂双层的速度。
一类脂类吸收增强剂包括一个能与核酸结合的带正电荷的头部基团，以及一个能够与膜成分相互作用的膜相互作用性尾巴。这些组合物可以通过瞬时性扰动细胞膜来促进寡核苷酸穿过细胞膜。不幸的是，许多阳离子脂制剂，例如Lipofectin，一种阳离子脂DOTMA与融合脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(Life Technologies，公司，Gaithersburg,MD)按1∶1(质量比)的混合物，对许多因素如核酸的组成和数量，靶细胞的类型，以及细胞培养基中血清的浓度等敏感。此外，一些制剂本身有细胞毒性。这些强制因素严重地限制了这些化合物在动物体系中作为寡核苷酸输运剂用于治疗用途。因此必须确立一种适应于寡核苷酸的改进的运输系统。
总之，许多疾病的过程与VEGF的过度表达所引起的血管生成和血管通透性增加有关。需要能特异性地降低VEGF表达的新组合物和方法以用于这些疾病的治疗。反义寡核苷酸治疗是一种有吸引力的途径，因为它具有潜在的选择性。
不幸的是，许多已知的VEGF反义寡核苷酸只有在对细胞有毒的浓度下才有效，并且仅表现出非特异性的效果。而且，现有的反义寡核苷酸是化学和生物学不稳定的，而那些更加稳定的却表现出对其目标序列的低至不能接受的低亲和力，且不易穿过细胞膜，因此很难到达其生物学目标。最后，高G含量的寡核苷酸易形成G-四聚体。
需要一种无毒的、对其目标mRNA序列有较高的亲和力的新寡核苷酸组合物。这些组合物应该有更高的生物学稳定性，包括抵御核酸酶降解的能力的增加。此外，有用的寡核苷酸无论其序列如何均不应聚合。还需要一种能帮助寡核苷酸穿过细胞膜的新组合物。
发明概述本发明提供了用于减缓与血管生成和血管通透性增加有关的疾病过程的组合物和方法。这种反义寡核苷酸组合物在选择性抑制产生细胞的VEGF表达上优于现有的反义寡核苷酸，且意在用于对此类疾病的治疗。本发明的选择性来自于可特异性地结合于VEGF mRNA分子上并阻碍VEGF表达的反义寡核苷酸。
本发明提供了这些寡核苷酸以及利用化学修饰来提高其对于目标mRNA序列的亲和力和特异性的制造和使用它们的方法。本发明的寡核苷酸均有较高的生物学稳定性和对目标序列的亲和力。这些寡核苷酸无论是在疏水环境还是在亲水环境下都对化学的和生物学的作用不敏感。并且不管其序列如何，不易形成聚合体。
本发明提供了有效且无毒的VEGF反义寡核苷酸。特别的，本发明用于一种新的寡核苷酸组合物，这种组合物以低于1μM的浓度处理细胞可导致VEGF的细胞产量降低。在这些浓度下本发明的反义寡核苷酸无毒且不会干扰细胞代谢。
本发明同时也提供了一种使寡核苷酸易于穿过细胞膜到达其生物学目标的组合物及方法。这是通过在提供制备和使用反义寡核苷酸同时使用细胞吸收增强剂的方法来实现的。细胞吸收增强剂无毒，并且与VEGF反义寡核苷酸相容，能促进寡核苷酸有效地穿过细胞膜。
用于本发明目的的“寡核苷酸”一词包括核酸多聚体以及与核酸多聚体相似的化学结构。在寡核苷酸中核糖或脱氧核糖的等效物可被置换入其结构中，只要结合的碱基的成分可维持其具有与目标序列特异性结合所需的氢键。类似地，寡核苷酸中可含有磷酸二酯骨架的化学等效物如硫代磷酸酯键。此外，寡核苷酸中还可包括经过化学修饰的碱基成分。特别的，寡核苷酸可包括但不局限于C5-(丙炔基或己炔基)尿苷或胞苷残基，6-氮杂尿苷或胞苷残基，以及经C5或6-氮杂修饰的嘧啶。
“VEGF”一词包括已知属于血管内皮生长因子家族的所有蛋白质。VEGF包括至少四种已知的人类VEGF的同源体，据认为这四种分子来源于同一种mRNA的不同剪切产物，以及任何有相似生物学功能的同源蛋白质。已知的蛋白质包括那些编码自mRNA剪切体的本领域已知的VEGF206、VEGF185、VEGF165和VEGF121。
本发明的反义寡核苷酸是用下面的方法制备的。长度大约为15-30个碱基的核苷酸序列，优选的长度约19个碱基，其序列与编码VEGF的mRNA一致。这些VEGF mRNA的序列为本领域已知。此RNA序列可以是编码VEGF家族中蛋白质的任意一种的mRNA上的任意一段序列。更优选的应是与编码人VEGF206、VEGF185、VEGF165和VEGF121 mRNA互补的反义寡核苷酸。最优选的是可以与所有VEGFmRNA上均有的序列结合的寡核苷酸(见表1)。抗-VEGF寡核苷酸 表1
+人VECF mRNA序列源自Leung等人．，science,246:1306,1989．起始密码子位于57碱基。*硫代磷酸脂键。-磷酸二脂键。1C,U代表修饰过的碱基。
制备了一系列互补的或“反义”寡核苷酸。为了本发明的目的，“反义”是指具有序列与mRNA的序列互补的寡核苷酸，因此它们能与那些序列以一种特异性氢键结合方式结合。然而，只要寡核苷酸在浓度低于1μM时具有抗VEGF的活性，它就有可能有错配或者不完全正确的氢键方式结合。
本发明的反义寡核苷酸包括一些提高其生物学稳定性的修饰。其生物学稳定性的提高是通过在不同的或所有的核苷酸残基中掺入核酸酶抗性键如硫代磷酸酯键。本发明的寡核苷酸还包括在不同的或所有的嘧啶位置上的化学修饰。这些修饰过的碱基包括5-丙炔基嘧啶、C5-己炔基嘧啶或6-氮杂嘧啶或结合C5和6-氮杂嘧啶的衍生物，这些修饰可进一步稳定本发明的寡核苷酸。
在本发明的反义寡核苷酸包括可增加其对于目的序列结合亲和力的修饰。通过在嘧啶碱基中掺入不同的化学成分提高结合亲和力。这些寡核苷酸包括在不同的或所有嘧啶位置上的化学修饰的碱基。这些经修饰的碱基包括C5-丙炔基嘧啶，C5-己炔基嘧啶或既有C5又有6-氮杂的嘧啶衍生物。
反义寡核苷酸可与天然的mRNA相结合也可与化学合成的与VEGFmRNA上的序列相同的RNA序列结合。这种结合可以通过多种方法证实。其中一种观察结合的方法如实施例Ⅲ中描述。这种方法包括将反义寡核苷酸同一些化学合成的等长的mRNA分子相互混合，使该寡核苷酸在最初的加热和冷却步骤中退火，观察混合物加热时在260nm处吸光值的变化。还可以利用其它的方法对结合进行检测，例如核酸酶保护实验，寡核苷酸延伸实验，NMR，凝胶电泳或其它本领域技术人员已知的一些技术。
为了本发明的目的“改善的结合亲和力”或“稳定性”是指该寡核苷酸与其目标序列结合时的解链温度(Tm)比一种没有经过修饰的寡核苷酸要高。如实施例Ⅲ中所描述的解链温度的检测方法用于此项检测。本发明采用了那些可以提高反义寡核苷酸/mRNA目标序列双螺旋的结合亲和力的化学修饰。一般地，在所述的方法中反义寡核苷酸的Tm高于45℃。更优选的寡核苷酸Tm＞50℃。
本发明的特定寡核苷酸包括经过化学修饰的活性高于那些已知VEGF反义寡核苷酸。活性提高意味着体内抑制VEGF表达所需的寡核苷酸浓度较低。虽然本发明并不局限于这些修饰作用的模式，目前所关注的寡核苷酸增加的活性至少有一部分原因是由于增加的结合亲和力和生物学稳定性。如前所述，这些特异性的化学修饰可用于提高此寡核苷酸的活性。
本发明所关注的反义寡核苷酸在浓度低于大约1μM时无毒。参照实施例V所述方法测定毒性。
本发明的反义寡核苷酸降低处理的细胞中的VEGF产量。在一种方法中，将细胞与寡核苷酸组合物直接接触，使寡核苷酸能够被内化入细胞并且到达其目标mRNA序列。在处理之前，此寡核苷酸先在一种液体中溶解或悬浮，或使之掺入一种固体。合适的液体或固体的制剂为本领域已知，且可用周知的方法选择。配制成的寡核苷酸直接与细胞接触。在其它方法中，将按配方制成的寡核苷酸定位使该寡核苷酸可通过扩散、分散或类似方式到达其靶细胞。本发明不要求寡核苷酸制剂直接接触目标细胞。发明仅要求此核苷酸到达目标细胞。例如，可将一种寡核苷酸导入血液中，但是它可能在到达目标肿瘤细胞，关节炎细胞等等之前已从血液中扩散出去了。另外，寡核苷酸可被混入一种粉末直接用于皮肤且扩散到下面的细胞中。
用本发明的反义寡核苷酸处理过细胞在同样条件下最多大约可以产生相对于未经处理过的细胞的90％的VEGF。且在寡核苷酸溶液浓度低于约1μM时即可观察到该效果。
一种测定VEGF产量降低的方法如实施例Ⅵ中所述。但是，也可以用其它的方法测定VEGF产量的下降，只要它们和实施例V中所述方法一样敏感。通过测量经过处理和未经过处理的细胞产生VEGF的量确定由经过处理的细胞产生的VEGF的百分比。用处理过的细胞的产量除以未经处理的细胞的产量再乘以100即为相对于处理过的细胞的产量百分比。其中处理过的细胞与未处理过的细胞除了在培养基中是否存在寡核苷酸制剂的方面之外在各方面都是相同的。因此检测中所用的细胞应该有相同的类型、传代数、表型以及处在细胞生长的同一时期。细胞在相同的条件下生长，包括培养基(除了是否加入了寡核苷酸制剂本身的变化)，温度和相同的气体条件。在这些条件下，经本发明的寡核苷酸处理过的细胞的VEGF的产量最多可以达到未经处理过的细胞的产量的约90％。当反义寡核苷酸溶液中的浓度高达1μM时，如果是用固体制剂也要达到相似的摩尔百分数。
优选的寡核苷酸掺入能够提高其核酸酶降解抗性的一些化学修饰。在这些实施方案中化学修饰的设计是指对在寡核苷酸中常见的天然存在的化学物的修饰。本发明的特定化学成分包括硫代磷酸酯键。这些修饰可位于一些或全部核苷酸残基之间。最优选的寡核苷酸含有10个硫代磷酸酯和8个磷酸二酯键。除了核苷酸键之外，对碱基组分的化学修饰能提高对核酸酶的降解抗性。更特别的，对吡啶环的修饰包括C5-丙炔基和己炔基基团和/或6-氮杂吡啶的修饰。
测定核酸酶抗性的一种方法是通过检测寡核苷酸在血清中的半衰期。这是采用本领域周知的标准方法完成的。为本发明的目的，可以采用一种降低反义寡核苷酸的核酸酶降解速率的化学成分，如果带有该组分的寡核苷酸比无此组分的有更长的血清半衰期。含有硫代磷酸酯的寡核苷酸血清半衰期大大超过24小时。而与其相对应的仅含有磷酸二酯键的寡核苷酸的半衰期不超过3小时。
所设计的寡核苷酸在其嘧啶环上带有化学修饰。最优选的寡核苷酸包括有C5-丙炔基嘧啶、C5-己炔基嘧啶和/或6-氮杂嘧啶。这些修饰提高了它们的Tm值，生物学稳定性和活性。带有修饰的寡核苷酸前体的合成如实施例Ⅰ所述。从这些或其它受保护的核苷酸合成寡核苷酸采用本领域周知的标准亚磷酰胺化学方法。
本发明中特定的实施方案是指能提高寡核苷酸活性的细胞吸收增强组合物。一般地，这些组合物可促进一种液体穿过液体双层的运输。在一些实施方案中，将寡聚物与一种亲脂的分子共价连接。这可改善寡核苷酸与膜的结合和穿透性质，如胆固醇、脂肪酸或其它亲脂性链。这些分子可以通过本领域周知的标准方法与寡核苷酸化学性连接。
在另一些实施方案中，可利用阳离子脂质体或脂质体制剂作为吸收的增强剂。这些试剂因为其适应性所以有吸引力。这些实施方案的优势在于同一个运输载体可用于寡核苷酸混合物的导入。一种实施方案中特别选用了脂质体制剂Cellfectin。其它的实施方案中包括一类多氨基脂吸收增强剂，包括亚精胺-胆固醇(SpdC)。后一种化合物具有在血清存在下同样有效地发挥作用的优势。带有细胞吸收增强剂的反义寡核苷酸的制备方法及组合物如实施例Ⅳ,Ⅵ和Ⅶ中所述。
本发明的特定寡核苷酸是盐的形式。此盐形式是一种寡核苷酸与带有正电荷(阳离子)的原子或分子结合的形式。合适的阳离子包括但不局限于钠离子，钾离子，铵根离子，亚精胺或多氨基脂，如亚精胺-胆固醇等等。
本发明的特定实施方案还包括一种脂质体。适宜的脂质体为本领域周知。本发明特定的脂质体特别包括Cellfectin。其它的组合物包括混有DOPE的亚精胺-胆固醇。采用本领域已知方法制备脂质体制剂。
本发明的特定实施方案通过持续释放系统运输其寡核苷酸组合物，包括但不局限于一些寡聚体释放载体，例如聚己酸内酯或聚己酸内酯与甲氧基聚乙二醇的混合物。用于本发明的反义寡核苷酸掺入到持续释放系统中的方法和组合物为本领域周知。
附图的简要说明
图1．表示本发明中反义寡核苷酸合成中用以替换天然碱基的本发明的修饰的碱基。
图2．制备5-(1-己炔基或丙炔基)-6-氮杂-2’脱氧尿苷亚磷酰胺(参见图1)图3．反义寡核苷酸对培养的正常人角质细胞VEGF产生的影响。
图4．施用带有或没有Cellfectin的反义寡核苷酸(序列编号NO.2)对角质细胞VEGF表达的影响。
图5．施用带有或没有Cellfectin的反义寡核苷酸(序列编号No.27)对角质细胞VEGF表达的影响。
图6．不同的细胞吸收增强剂对T30639(序列编号NO.2)的角质细胞活性的影响。
图7．细胞短期暴露于本发明寡核苷酸制剂以及VEGF表达的长期抑制。
图8．细胞短期暴露于本发明寡核苷酸制剂以及VEGF表达的长期抑制。
图9．细胞短期暴露于本发明寡核苷酸制剂以及VEGF表达的长期抑制。
图10．带有末端修饰的、VEGF反义寡核苷酸嵌合体在有无吸收增强剂的存在下对VEGF表达的影响优选的实施方案的说明优选的实施方案包括一种反义寡核苷酸，其能与一种编码mRNA分子的多种VEGF的共同序列结合并且能够在体内抑制VEGF的表达。优选的寡核苷酸含有在几个磷酸二酯键位置上的硫代磷酸酯键，以及其它用以提高寡核苷酸与其目标mRNA序列亲和力的化学修饰。在优选的组合物中寡核苷酸与能够提高它们穿过细胞膜的能力的细胞吸收增强剂一起做成制剂。
本发明的寡核苷酸的长度范围从约17-30个碱基。优选的寡核苷酸长度为19个核苷酸。其序列的选定是基于与编码VEGF基因的mRNA分子互补的原则。mRNA分子上与寡核苷酸互补的区域称为目标序列。优选的反义寡核苷酸能够与四种已知的VEGF mRNA分子包括VEGF206,VEGF185,VEGF165和VEGF121上共有目标序列互补。
设计的寡核苷酸带有一些提高它们与目标mRNA结合亲和力的化学修饰。优选的寡核苷酸带有C5-丙炔基嘧啶，C5-己炔基嘧啶和/或6-氮杂嘧啶。优选的修饰提高寡核苷酸与其目标序列解离时的温度。带有这些修饰的核苷酸前体的合成如实施例Ⅰ中所述。按照本领域已知的标准亚磷酰胺化学法从被保护的核苷酸合成寡核苷酸。
优选的寡核苷酸掺入一些增加其核酸酶降解抗性的化学修饰。虽然本发明并不局限于这种抗性机制，经过化学修饰的核苷酸认为可以通过在核酸酶的底物结合口袋处干扰与寡核苷酸的结合来抵抗核酸酶的降解。这些优选的核酸酶抗性的寡核苷酸在至少一些核苷酸残基之间含有硫代磷酸酯键。最优选的寡核苷酸包括10个硫代磷酸酯和8个磷酸二酯键。
在优选的组合物中，本发明的寡核苷酸是与能提高其穿过细胞膜的能力的细胞吸收增强剂一起配制或混合的。本发明所使用的细胞吸收增强剂包括二油酰磷酯酰乙醇胺，Cellfectin，亚精胺-胆固醇等。最优选的组合物是按质量比1∶1混合的亚精胺-胆固醇和二油酰磷酯酰乙醇胺。根据本领域已知的方法将此制剂与10nM-1μM浓度的寡核苷酸混合。
本发明的寡核苷酸组合物是根据它们体内的活性选择的。优选的组合物在寡核苷酸浓度高达1μM时基本上无细胞毒性。用于此检测的标准细胞毒性检测的方法如实施例Ⅰ所述。还要证明这种组合物在浓度低于1μM时有降低细胞VEGF产量的能力。
本发明在已建立的意在包括用于实践本发明优选模式的具体实施方案中加以阐述。本领域技术人员应当知晓，按照本公开的精神，可以在不超出本发明的范围的情况下对具体的实施方案进行多种修饰和变化。所有这些修饰均认为落在后附的权利要求的范围内。
实施例实施例Ⅰ制备用于掺入合成寡核苷酸的修饰过的碱基的方法这些用于提高合成的寡核苷酸的结合亲和力和/或特异性的修饰过的碱基如图1所示。图2给出的是制备5-(1-己炔基或丙炔基)-6-氮杂-2’脱氧尿苷亚磷酰胺的合成示意图。此合成为制备含有6-氮杂尿苷的反义寡核苷酸提供了构件块。6-氮杂胞苷的合成也采用相似的示意图。制备5-(1-己炔基)-6-氮杂-2’-脱氧尿苷亚磷酰胺详细的合成方法如下所述。用同样的方法可从5’-碘代衍生物7制备5’-丙炔基衍生物。
3’-5’-双-氧-对-甲苯基-5-碘代-6-氮杂-2’-脱氧尿苷(7a)将0.5ml的氯三甲基硅烷加入到5-碘代-6-氮杂尿嘧啶(5.8g,33.47mmol)的1,1,1,3,3,3-六甲基二硅烷胺(HMDS,80ml)溶液中，回流加热6小时。将反应混合物冷却到室温，真空中使HMDS蒸发。残余物在高度真空下抽干4小时。将干燥好的甲硅烷基衍生物溶解在二氯甲烷(60ml)中。在此溶液中加入1-氯-2-脱氧-3,5-双-氧-对-甲苯基-b-D-赤-呋喃戊糖(6,16.3g,42mmol)和氯化锌(0.46g,3.35mmol)在氩气中搅拌混合24小时。用二氯甲烷(250ml)稀释该反应混合物，并用水饱和的NaHCO3溶液(100ml)洗涤二氯甲烷溶液。用二氯甲烷(4×100ml)抽提水相，合并的有机相用Na2SO4干燥并蒸发。残余物用硅胶柱(4×15cm)层析纯化。产物用含有0-5％甲醇的二氯甲烷洗脱。经干燥的异头体产物重15g。纯的b异头体可以通过与二氯甲烷和甲醇(4∶1,200ml)的混合物研制而获得。通过过滤和蒸发收集固体。重复此研制过程可得10.5g纯的b异头体。熔点204-205℃。1H NMR(DMSO-d6):d2.35,2.37(2s,6H,2CH3),2.80(m,2H,C2’H和C2”H),4.43(s,3H,C4’H,C5’H2),5.55(brs,1H,C3H),6.39(t,J=6.0Hz,1H,C1’H),7.28(t,4H,Tol),7.85(t,4H,Tol),12.42(brs,1H,NH)C24H24IN3O7的元素分析计算值为C,48.58；H,4.08；N,7.08，实验值C,48.85；H,3.80；N,6.92。
3’,5’-双-氧-对-甲苯基-5-(1-己炔基)-6-氮杂-2’脱氧尿苷(8a):
3’,5’-双-甲苯基-5-碘代-6-氮杂-2’-脱氧尿苷(7,3.84克，6.5毫摩尔)与干DMF(25ml)共蒸发干燥后溶解在DMF(30ml)中并在氩气条件下加入CuI(0.25g,1.3mmol)，三乙胺(1.82ml,13mmol),1-己炔(2.23ml,19.5mmol)以及四(三苯基膦)钯(0.75g,0.65mmol)。该反应混合物在室温下搅拌18小时并加入0.5g四(三苯基膦)钯。48小时后蒸发溶剂，残留物与甲苯共蒸发。用硅胶层析柱纯化残留物，产物用含有0-5％乙酸乙酯的二氯甲烷洗脱得到0.9g的标题化合物。熔点198-200℃。1H NMR(DMSO-d6):d 0.87(t,3H,CH3),1.45(m,4H,2,CH2),2.37,2.39(2s,6H,2CH3),2.45(m,3H,CH2和C2”H),2.84(m,1H,C2’H),4.45(s,3H,C4’H,C5’H2),5.59(brs,1H,C3’H),6.49(t,J=6.3Hz,1H,C1’H),7.31(dd,4H,Tol),7.88(dd,4H,Tol),12.40(br s,1H,NH)。C30H33N3O7的元素分析计算值C,65.80；H,6.07；N,7.68，实验值C,65.61；H,5.73；H,7.29。
6-氮杂-5-(1-己炔基)-2’脱氧尿苷(9a):
3’,5’-双-氧-对-甲苯基-5-(1-己炔基)-2’-脱氧尿苷(8a,0.8g,1.47mmol)和甲醇(55ml)及甲醇钠(25％的甲醇溶液，1.28ml)的混合物在室温下搅拌2小时，加入Dowex 50X8(H+)树脂终止反应。该树脂通过过滤除去，蒸发滤液。残留物可用硅胶柱层析纯化，用含有0-4％甲醇的二氯甲烷洗脱产生0.38g(84％)的高度吸水的标题化合物。
1HNMR(DMSO-d6):d0.88(t,3H,CH3),1.47(m,4H,2,CH2),2.02(m,1H,C2″H),2.33(m,1H,C2′H),2.46(m,2H,CH2),3.40(m.2H.C5′H2),3.68(m,1H,C4′H,),4.21(br s,1H,C3′H),4.61(t,1H,C5′OH),5.17(d,1H,C3′OH),6.49(dd,1H,C1′H),12.27(br s,1H,NH).
5’-氧-(4,4’-双甲氧三酰基)-6-氮杂-5-(1-己炔基)-2’脱氧尿苷(10a):
4,4’-双甲氧三酰氯(0.51g,1.5mmol)加入5-(1-己炔基)-6-氮杂-2’脱氧尿苷(0.38g,1.24mmol)的干吡啶(10毫升)溶液中。搅拌6小时后，加入0.5g DMT-Cl，该反应混合物搅拌过夜。该反应混合物用二氯甲烷(100毫升)稀释，用水(20毫升)洗该有机溶液。水相用二氯甲烷抽提，合并有机相用Na2SO4干燥并蒸发。残留物与甲苯(10毫升)共蒸发，用硅胶层析柱(2×10cm)纯化残留物。产物用含有0-1.5％甲醇的二氯甲烷洗脱，得到0.45g。
1H NMR(DMSO-d6):d0.85(t,3H,CH3),1.37(m,4H,2,CH2),2.08(m,1H,C2″H),2.37(m,3H,CH2and C2′H),3.06(m,2H,C5′H2),3.72(s,6H,2OMe),3.87(m,1H,C4′H,),4.20(m,1H,C3′H),5.23(d,1H,C3′OH),6.35(dd,1H,C1′H),6.83(m,4H,DMT),7.16-7.25(m,9H,DMT),12.30(br s,1H,NH).
5’-氧-(4,4’-双甲氧三酰基)-6-氮杂-5-(1-己炔基)-2’脱氧尿苷-3’-氧-(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(11a):
5’-氧-(4,4’-双甲氧三酰基)-6-氮杂-5-(1-己炔基)-2’脱氧尿苷(10a)在二氯甲烷中在N,N-二异丙基乙胺以周知的方法提供亚磷酰胺11a时与2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺反应。
实施例Ⅱ寡核苷酸的设计与合成选择能够与所有VEGF mRNA的剪切变体共同的mRNA目标序列互补结合的反义寡核苷酸序列。表1给出了一些合成的寡核苷酸的序列的例子。为了提高它们对于mRNA目标的结合亲和力，这些寡核苷酸用带有C5-丙炔基或C5-己炔基基团的嘧啶合成，如图1所示(Wagner等人，1993)。还考虑包括6-氮杂脱氧尿苷和6-氮杂脱氧胞苷等其它修饰过的碱基(图2)，也考虑这些修饰的组合。寡核苷酸T30691(序列编号NO.27)与反义寡核苷酸T30639(序列编号No.2)互补，在下面的实验中用作对照。其与T30639(序列编号No.2)的大小相同，含有相同的骨架以及碱基的修饰。
实施例Ⅲ反义寡核苷酸-RNA异源双螺旋相互作用的Tm值检测反义寡核苷酸RNA双螺旋的温度(Tm)可用来评估结合亲和力。Tm值用一个装有温度控制的二极管阵列分光光度计测定(HewlettPackard Model 8452)。反义寡核苷酸与合成的同等大小的RNA目标(每一种1μM)，在含2mM的磷酸钠pH7.0,18mM NaCl和1mM EDTA溶液中混合。该溶液在分光光度计的小室中加热到90℃,10分钟，并用多于10分钟时间冷却到20℃。然后平衡10分钟使双螺旋形成。为了检测双螺旋的解链温度(Tm)，小室的温度以1℃/min的速度慢慢地从20℃加热到80℃，测定在260nm处的吸光值作为温度的函数。吸光值信号的升高意味着双螺旋的解链或打开成单链寡聚体。可利用如标准方法所述的方程从熔解曲线上求出双螺旋形成的Tm值(Puglisi和Tinoco,1989)。Tm值如表2所示。掺入C5-丙炔基或C5-己炔基修饰碱基的硫代磷酸酯寡核苷酸导致Tm值比未经修饰的寡核苷酸明显升高。这显示了反义寡核苷酸对其目标序列的亲和力显著增加。
表2T30807(反义DNA
<p>实施例Ⅳ吸收增强剂的制备无协助的反义寡核苷酸的细胞吸收很低低(Ficher等人，1993；Guy-caffey等人，1995)。为了提高进入细胞的能力采用了多种商品化的吸收增强剂以及由本发明人合成的新型多氨基脂制剂。
实施例Ⅴ细胞毒性的检测细胞以500个细胞/孔的密度接种到96孔板中。接种一天后，用一系列稀释的寡核苷酸制剂处理细胞(每个稀释度作四个平行孔)。处理1天后或4天后用一种非放射性检测系统测定细胞存活力的影响(Cell Titer96 Aqueous cell proliferation assay,Promega公司)。本发明的寡核苷酸浓度在低于1μM时未观察到毒性。
实施例Ⅵ寡核苷酸的细胞学检测用培养的人角质细胞来评价反义寡核苷酸、其修饰过的对应物和不同制剂的活性。角质细胞是一种初级细胞系，它可在正常的培养条件下分泌VEGF(Bauaun等人，1995；Frank等人，1995)。细胞按50-100,000个细胞/孔/0.5mlKGM培养基(Clonetics)的密度接种到48孔板上。用一种灵敏的、以ELISA检测为基础的蛋白检测系统(R&D Systerm)来测定细胞上清中的VEGF蛋白质水平。初步的检测表明当NHEK细胞在建议的培养基中生长时，0.5ml培养基中的50,000个细胞在15个小时内产生大约150-200pg VEGF(即未经处理的细胞上清中大约300-400pg/ml)。细胞和寡核苷酸制剂一起培养15个小时。四种抗VEGF寡核苷酸中有三种在0.2μM的浓度范围内有活性(在有10μg/mlCellfectin存在的情况下)。而对照的有义(sense)寡核苷酸对细胞没有影响(结果没有给出)，结果如图3所示。
为了评价反义的效果，在加入或不加入细胞吸收增强剂的情况下向细胞施用寡核苷酸。在最初的实验中，不带有碱基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸在浓度低于1μM时有效，并且无载体对其活性没有明显的影响(结果未给出)。当浓度大于1μM时寡核苷酸易于非特异性抑制VEGF的表达(结果未给出)。这些非特异性的效果为本领域已知(Stein等人，1993；Wagner,1994)。为了避免这些非特异性的效果，将吸收增强剂与寡核苷酸混合。Cellfectin是一种用四棕榈酰亚精胺(Tm-TPS)与二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)(Tm-TPS/DOPE，按质量比1∶1.5 LifeTechnologies公司)的一种脂质体制剂，它比经检测的其它一些商品化运输介质的活性更高，毒性更低。与多氨基脂SpdC的脂质体制剂配制的寡核苷酸更有效(Guy-Caffey等人，1995；SpdC/DOPE,1∶1质量比)。在典型的细胞培养实验中，寡核苷酸(10nM-1μM)在室温下溶解在大约20-40μl吸收增强剂的水溶液中，并孵育约10分钟。将上述溶液与0.5ml的温热过的培养基混合并加入到细胞中。细胞在寡核苷酸存在下培养15小时。培养之后收集细胞上清，立即用于ELISA检测或于-80℃储存以用于将来的检测(未发现未经冷冻的样品与经过冻融的样品中VEGF水平的明显差别)。如图4所示，在Cellfectin存在下反义寡核苷酸T30639(序列编号No.2)活性更强，而对照的“有义”寡核苷酸T30691(序列编号NO.27)在所用的最高浓度下也没有什么效果。如图5所示。
图6给出了利用多种阳离子脂质体制剂SpdC，亚精胺-胆固醇(Guy-Caffey等人，1995)；DC-Chol(Gao和Huang,1991)；CS，胆酸酯-亚精胺；DCS，脱氧胆酸酯-亚精胺；cF,Cellfectin施用0.1μM或0.2μM寡核苷酸(序列编号No.2)的效果。每种阳离子脂质体制剂是将其与融合脂质DOPE(质量比1∶1)混合制得，冻干后储存备用。使用前先将脂质体重悬在5％葡萄糖(1mg/ml的浓度)中，4℃贮存2周内使用。按上所述的方法，进行细胞处理之前将寡核苷酸与阳离子脂质体制剂混合。
图7-9给出了用不同浓度的反义寡核苷酸T30639(序列编号No.2)，以及其磷酸二酯-硫代磷酸酯嵌合体T30848(序列编号No.6)的细胞培养结果(见表1)。图7给出的是0.1μM寡核苷酸的效果，图8给出的是0.2μM寡核苷酸的作用效果，图9给出的是0.4μM寡核苷酸作用效果。在每个实验中，细胞用补加同SpdC/DOPE预混的反义寡核苷酸的培养基处理4小时。然后将培养基换成新鲜的未补加的培养基。图(graph)1给出的是寡核苷酸组合物被洗掉16小时后VEGF的表达被抑制的百分数。图(graph)2是洗掉寡核苷酸40小时后的结果。图(graph)3是寡核苷酸洗掉64小时后的结果。然后检测收集的培养基中VEGF水平的量。在约3天的培养期结束后细胞的形态正常，图7-9给出了寡核苷酸对VEGF表达的长效影响。在这些图(graph)中符号(Δ)表示的是0.1μM的T30848(序列编号NO.6)；符号()表示的是0.1μM T30639(序列编号NO.2)。
图10给出的是用带有亲脂性基团的寡核苷酸衍生物所作的类似实验的结果。S96-5296(序列编号NO.20)其分子的3’末端用一个C-16脂基修饰且其含有8个磷酸二酯和11个硫代磷酸酯键。S96-5297(序列编号NO.21)有相同的骨架且3’末端的修饰是3’芘成分。这些疏水性成分可以提高与Cellfectin混合时寡核苷酸被吸收的程度及活性，且这些磷酸二酯键可以提高这些寡核苷酸的活性。符号()表示S96-5296(序列编号NO.20)，符号()表示S96-5296(序列编号NO.20)与10μg/mlCellfectin，符号(o)表示S96-5297(序列编号NO.21)，符号(·)表示S96-5297(序列编号NO.21)与10μg/ml Cellfectin，符号(□)表示0.2μM T30639(序列编号No.2)与10μg/ml的Cellfectin。
实施例Ⅶ反义寡核苷酸的抗VEGF活性含有不带碱基修饰的硫代磷酸酯反义寡核苷酸对细胞VEGF的产生无明显的影响，除了浓度超过1μM时一些序列不依赖性特异性抑制(数据未给出)。这些结果同其它研究相符，表明低的亚微摩剂量的单纯硫代磷酸酯寡核苷酸不是有效的抑制物，在高浓度下这种寡核苷酸表现出对细胞代谢的非特异性效果(综述Stein和Cheng,1993；Wagner,1994)。但是，含有C5-丙炔基修饰嘧啶(Wagner等人，1993)硫代磷酸酯的寡核苷酸特异性抑制细胞产生VEGF。见图3。
这些经过修饰的寡核苷酸的解链温度比其它未修饰的寡核苷酸的解链温度高出约15℃。见表2。这表明经修饰的寡核苷酸与其目标的亲和力要高于那些未经修饰的形式。
最适的寡核苷酸与Cellfectin的比例细胞对于寡核苷酸-阳离子脂质体混合物的吸收部分取决于制剂中各个成分的化学性质，部分取决于其浓度及其相对的质量比，另一部分取决于目标细胞的内吞能力。将寡核苷酸T30639(序列编号NO.2)与Cellfectin共同施于NHEK细胞，寡核苷酸与TMTPS的比例为1∶3(质量比)，可达到最佳的活性。在一个相关实验中，改变寡核苷酸的浓度但保持寡核苷酸与阳离子脂质的比例，测定相对于“有义”对照物T30691(序列编号NO.27)对VEGF表达的影响。寡核苷酸T30639(序列编号NO.2)表现出特异的抗VEGF活性而对照寡核苷酸则没有效果(见图4和图5)。
亚精胺-胆固醇+DOPE或DC-Chol+DOPE(脂质体制剂，重量比1∶1)制剂对于寡核苷酸功效的影响有多种吸收增强剂被用于核酸治疗中(Behr,1994；Guy-Caffey等人，1995,Lewis等人，1996)。其中的一种化合物是亚精胺-胆固醇偶联物(SpdC)(Guy-Caffey等人，1995)。这种化合物在远远高于本发明所需要的浓度下对细胞无毒，并且连续处理啮齿动物1周以上也无毒性。另一种阳离子脂质体DC-Chol(Gao和Huang,1991)被证明能用于基因治疗，并且在细胞体系中也相对无毒。将脂质体制剂SpdC/DOPE和DC-Chol/DOPE(SpdC或DC-Chol与二油酰磷酯酰胆碱)的质量比范围为1∶0.5,1∶1,1∶1.5和1∶2，其中1∶1的比例在与NHEK细胞的抗VEGF的检测中最有效。见图5。带阳离子试剂的组合物效果比带Cellfectin的活性要高20％-40％(图6。)。
寡核苷酸制剂对细胞的短期处理就足以产生对VEGF产生的长期抑制效果。经较短暂暴露于本发明所公开的组合物后VEGF的表达下降。例如，4小时孵育所表现出的抗VEGF的活性要超过过夜暴露于寡核苷酸的效果。见图7-9。令人惊讶地，在全部实验过程中该效果至少持续3天。图7-9。
其它的实验表明含有硫代磷酸酯和磷酸二酯嵌合骨架的反义寡核苷酸是一种有效的VEGF表达抑制物。特别的，含有10个硫代磷酸酯和8个磷酸二酯键T30639的嵌合变体(序列编号NO.2)以及脂质末端修饰的S96-5296(序列编号NO.20)和S96-5297(序列编号NO.21)在有SpdC/DOPE的存在下表现出极佳的活性(图7)。在仅4小时培养后VEGF的抑制长于3天(图7)。在没有SpdC存在时，这种嵌合寡核苷酸骨架不能影响VEGF表达。因此减少寡核苷酸的硫代磷酸酯键可以提高功效，并减少非特异性影响。吸收对寡核苷酸的功效至关重要。实施例Ⅷ体内VEGF的抑制。
A．特定的目的。
血管内皮生长因子(VEGF)的表达升高常参与与增生性糖尿病视网膜病，新生血管性青光眼及许多其它致盲性条件相关的眼血管新生的过程。视网膜的局部缺血导致血管生成蛋白质VEGF合成的增加，这就引发了血管内皮细胞的增生，并导致了视网膜、视神经和虹膜中血管的大量不正常形成。然而至今对这种情况尚未有一种可以被接受的治疗手段。我们的总体目标是通过合理的设计和检测手段建立一种新的、有潜在治疗性的反义寡核苷酸VEGF表达抑制物，其目的在于治疗人的与视网膜局部缺血相关的新血管增生。我们最新的在人细胞培养体系上的体外实验结果表明，我们能够制备特异性的寡核苷酸制剂，其在亚微摩浓度范围内即可抑制超过50％的VEGF细胞表达，我们为此目的的目标是将我们的体外发现推广到VEGF相关的新血管增生大鼠模型中。我们特殊的目的是1．合成一个直接拮抗大鼠VEGF mRNA的反义寡核苷酸“库”。有三种主要的和一种次要的VEGF剪接体。十种寡核苷酸将以这些RNA序列的共同区域为靶。它们将也含有核酸酶抗性骨架以及能够提高其与目标mRNA结合亲和力的修饰过的碱基。
2．建立大鼠细胞单层和球状体模型以检测这些反义寡核苷酸及其制剂的活性和毒性。在此采用了C6神经胶质瘤细胞系，因为其已被广泛地用于研究VEGF的功能。球状体(细胞团)将用于评价我们的寡核苷酸是否能够穿过细胞层。
3．用各种细胞吸收增强剂评价寡核苷酸的效率。在Aronex所开发的各种化合物与许多商品化的试剂加以比较。
4．建立一种经得起检验的检测方法以获得支持反义机制的数据。设计这一体外实验是为验证我们是否能够特异性地击中仅仅一种VEGF同型体，以便回答我们的寡核苷酸是否是通过预想的模式起作用的。这将有助于将来对反义寡核苷酸的设计。
5．用大鼠的体内虹膜血管增生模型来检测最有希望的反义寡核苷酸。这些研究将与在Harvard的Dr.Anthony Adamis共同完成。
在完成有目的的研究之后，我们希望获得关于1-2种寡核苷酸体内功效的大量信息。也可获得一些关于剂量、可能的作用机理、细胞有效性以及潜在的毒性等信息。如任何一种寡核苷酸能够在体内降低血管的形成和/或VEGF表达的20％，我们就认为是一种阳性进展且在Ⅱ期研究过程中在动物模型中作更详细的研究。
选择寡核苷酸，非特异性地与其它RNA结合的风险非常高，而高G含量序列的选择可导致不期望的G-四聚体的形成，这将导致结合中所需的游离螺旋形式的减少(Bishop等人，1996)。有意采用的另一种方法是用含有C5-丙炔基嘧啶的选择性修饰过的寡核苷酸，其修饰可以导致无明显毒性的十分有效的结合(Wagner等人，1993；Fenster等人，1994)。我们最近已发现丙炔基修饰的效果相当好(见最初的结果)。
提高寡核苷酸核酸酶抗性的方法含有天然的磷酸二酯骨架的寡核苷酸对血清和细胞核酸酶高度敏感。我们已确定一种随机序列17碱基长的寡核苷酸在血清中的半衰期小于3分钟(Bishop等人，1996)。另一种方法是采用带有硫代磷酸酯骨架的寡聚体(Stein等人，1991)，这种修饰可将寡核苷酸的血清半衰期显著地提高到1天或更长。硫代磷酸酯键的使用认为在高水平下会导致一些非特异性的效果，但是正如以下的讨论所说，我们希望合成一种经过特异性修饰的寡核苷酸，其在一个很低的浓度下就可产生效果，因此减少了非特异性相互作用的风险。也测试过其它骨架的寡核苷酸，但是都有比硫代磷酸酯寡核苷酸有更大的非特异性效果。
一种提高寡核苷酸细胞吸收的方法亚细胞性分布研究表明，经荧光寡核苷酸处理的细胞中，其大多聚集在核周围的内质网中(Guy-Caffey等人，1995)。内化过程中的限速步骤似乎是寡核苷酸穿过质膜或内质网膜的运输。有两种可能的途径可以促进寡核苷酸穿过膜脂双层的运输。在第一个途径中，可将寡聚体与一种可以改善其与细胞膜亲和及通透性质的化合物共价偶联，例如与胆固醇偶联(Letsinger等人，1989)。我们最近提出了一种新型的适当修饰，一种亲脂的二茂铁链(见实验设计)，这种物质明显地提高了反义寡核苷酸的功效。此外，也可采用其它的吸收增强剂如阳离子脂质或脂质体制剂等。这些试剂有吸引力是因为它们是多功能的，即用同一个运输载体可以同时导入多种寡核苷酸。这些阳离子脂质的设计掺入一个带正电荷的与核酸结合的头部基团，以及一个能与膜相互作用的尾巴，这一部分意在与融合脂质相互作用且/或导致细胞膜的不稳定。许多阳离子脂质制剂(如Lipofectin)的活性受多种因素例如核酸的组成和质量、细胞类型以及细胞生长培养基中血清的浓度等的影响。此外有些制剂是有细胞毒性的。这些缺陷严重地限制了这些的化合物用作治疗性寡核苷酸的运输剂在动物体系中的应用，而且迫切需要有效的吸收增强剂。我们合成了一种新的运输载体，亚精胺-胆固醇(SpdC)，即使在有血清的情况下，也可提高寡核苷酸细胞吸收以及穿过细胞膜的能力(Guy-Caffey等人，1995)。对使用这种化合物的制剂将作为目的研究的一部分进行评价。
我们的目的是确立一种能够抑制眼球细胞VEGF表达并同时降低与疾病相关的血管增生的反义寡核苷酸制剂。这些研究受到我们最近的一个发现的鼓舞，那就是，经化学修饰的反义寡核苷酸在亚微摩的剂量下有很强的抑制活性。此外，利用Dr.Adamis所建立的VEGF相关血管增生的动物模型，我们将能够在体内检测其中最有效的化合物。初步的结果总结我们最初一系列的连续的实验的目标是发现和/或验证一些细胞基础的VEGF表达模型中提高反义寡核苷酸活性的普遍原理和方法。初步的，我们的目标是·建立一种定量的细胞水平的筛选检测反义寡核苷酸对VEGF蛋白质水平的效果的方法。·合成一些带有结构性修饰使其提高对目标mRNA的结合亲和力、核酸酶抗性以及特异性的寡核苷酸。·检测用新的吸收增强剂(有些在Aronex合成)促进施用的寡核苷酸的细胞内化和膜穿透的制剂。
寡核苷酸的设计由于我们期望我们的化合物中的一种最终能在人体中测试，本发明一开始就使用直接针对人VEGF mRNA的反义寡核苷酸。为了达到最大抑制表达的效果，我们选择了能与四种VEGF mRNA的共同序列互补的反义寡核苷酸(表3)。
反义寡核苷酸(起始密码子AUG在mRNA序列．57)T30638:mRNA seq.87-105 5’-a*g*a*g*C*a*g*C*a*a*g*g*C*g*a*g*g*C*t-3T30639:mRNA seq.185-023 5’-g*C*g*C*U*g*a*U*a*g*a*C*a*U*C*C*a*U*g-3T30640:mRNA seq.204-222 5’-C*g*a*U*U*g*g*a*U*g*g*C*a*g*U*a*g*C*t-3T30641:mRNA seq.232-250 5’-U*a*C*U*C*C*U*g*g*a*a*g*a*U*g*U*C*C*a-3全部的硫代磷酸酯(*)骨架具有核酸酶抗性。
C5-丙炔基嘧啶以提高对目标RNA的结合亲和力。
表3．直接针对人VEGF的反义寡核苷酸与初始报告一致(Wagner等人，1993)，我们发现C5-丙炔基嘧啶碱基替换提高了指示链间亲和力的双螺旋形成的Tm值，可以从未经修饰的寡核苷酸的-60℃升高到超过80℃。作为一种对照，我们同时还合成了一个大小相同及相同的修饰的“有义”寡核苷酸T30691。
寡核苷酸的细胞检测采用培养的人角质细胞，一种分泌VEGF的初级细胞系评价反义寡核苷酸、其修饰过的对应物及不同的制剂的活性。细胞按50,000个细胞/孔的密度接种到0.5ml的KGM培养基的46孔板上(Clonetics)。用酶联免疫吸附鉴定(ELISA)方法测定分泌到生长培养基中的VEGF的水平(R&D Systems)。这种检测在5-1000pg/ml范围内呈线性。我们的检测表明NHEK细胞在推荐的培养基中生长时，接种在0.5ml培养基中100,000个细胞15个小时内能产生大约150pgVEGF(在未经处理的对照上清中大约300pg/ml)。
大多数的细胞水平的检测采用一种商品化的阳离子脂质体制剂，作为一种向细胞内运输基因的一种转染剂来完成。(Cellfectin，购自LifeTechnologies)。发现其它商品化的转染试剂或有毒或效果相对较差(7次检测)。一种Cellfectin的难以理解的效果是当单独施于细胞时，作为对照，它实际上促进VEGF产生。其中的原因未知。最近我们开始采用亚精胺-胆固醇制剂(Guy-Caffey等人，1995)。
在最早的实验中，使用了不带有C5-丙炔基修饰的硫代磷酸酯反义寡核苷酸，我们发现其对VEGF水平无影响(甚至在高达5μM的胞外浓度下，无论是否加入了吸收增强剂)。在更高水平上，有很少的似乎为非特异性抑制(数据未给出)。当用含有C5-丙炔基嘧啶(Wagner等人，1993)来替换胞嘧啶和胸腺嘧啶核苷后，在体内测得的Tm值提高20℃，这表明寡核苷酸与其合成的目标RNA的亲和力大大高于未经修饰的变体(数据未给出)。我们在有无吸收增强剂的情况下检测这些寡核苷酸的效果，并改变吸收增强剂与寡核苷酸的比例以期获得一个最佳的配方。我们发现不同的寡核苷酸对VEGF水平有不同的影响。
图3．四种寡核苷酸中的三种在有10μg/ml Cellfectin时在0.2μM的范围内有活性。对照有义寡核苷酸没有效果(没有给出)。其中最有效的所测寡核苷酸，T30639，已用于后面的优化研究。
最适的寡核苷酸和吸收增强剂的比例在下面的实验中，我们将寡核苷酸(反义的T30639和有义的T30691对照)与阳离子脂质体成分cF的质量比维持在1∶3，并检测对VEGF产生的影响。T30639+cF又一次表明了有特异性抗VEGF活性，而对照寡核苷酸则没有效果。图11．
图11．寡核苷酸Cellfectin(1∶3)制剂对VEGF表达的影响。
在高浓度下，表现出非特异性的效果(未给出)。需要注意的是我们并没有试图将游离的吸收增强剂与绑缚材料分开。当我们改变一种与另一种的相对比例时这肯定会有影响。
寡核苷酸大小的影响在下一个实验中，我们探寻是否可以在减少寡核苷酸大小的情况下维持其特异性抗VEGF活性。短寡聚体的合成也较便宜。但是，用同样的NHEK检测，我们发现19个碱基的寡核苷酸要比16个或14个碱基的衍生物更有效，所有寡核苷酸都与10μg/mlCellfectin一起施用。改变Cellfetin与寡核苷酸的比例并不会改变其相对活性(未给出)。
亚精胺-胆固醇+DOPE或DC-chol+DOPE(脂质体制剂，重量比1∶1)的制剂对寡核苷酸功效的影响最近，我们已开始开发一种Cellfetin的替代物，因为长期使用Cellfetin会对细胞产生某些毒性。已发现一种吸收增强剂亚精胺-胆固醇偶联物(SpdC)(Guy-Catfey等人，1995)在所使用的水平上对细胞无毒，且在所处理的啮齿动物身上使用长达1周也无可测出的毒性。阳离子脂质DC-Chol(Gao等人，1991)已被批准用于基因治疗的临床试验，且其在细胞体系中有很低的毒性。最初的数据表明这种新型的脂质体制剂比在平行实验中Cellfetin的效率高20％-40％。
寡核苷酸制剂对细胞的短期处理就足以获得对VEGF产生的长期抑制效果在所有以上实验中，我们曾经将细胞与寡核苷酸及吸收增强剂共同孵育过夜。随后我们探寻，用寡核苷酸对细胞处理较短的时间是否也能达到相同的抗VEGF活性水平。我们发现确实是这样的处理4小时之后洗去，更换成新鲜的未补加的培养基，并不会降低抗VEGF活性(图12)。而且，此效果可持续长达3天(实验的时间)。
图12．用四种寡核苷酸+cF处理，然后换成纯的培养基。这种抑制几乎可以持续3天。而对照有义寡核苷酸无明显的抑制(结果未给出)。
实际上，相对于对照(无寡核苷酸)来说，抑制效果比以前所观察到的要好。其中一个原因可能是，在一次培养实验中，VEGF质蛋白可通过原先已存在的mRNA不断地被合成(如果仍未被反义寡聚物所阻断)，并在培养基中积累。通过在4小时后更换培养基，可以消除“背景”VEGF的来源。这些实验数据对于体内实验体系很重要，因为这种长效反义效果表明并不需要经常施用药物。这一点还需经特意的体外和体内实验的验证。
二茂铁偶联的寡核苷酸我们最近发现一种经金属茂修饰的寡核苷酸与吸收增强剂的制剂在我们的体外实验中是最有效的VEGF抑制物，并且在使用浓度范围内几乎无毒性(图13)。这种与Cellfetin一起配成的寡核苷酸制剂在20μM浓度时有特异性抗VEGF活性。这种二茂铁链已被设计用于提高寡核苷酸对膜的结合力(D.Mulvet,Aronex，个人通讯)。此外，我们推测这种亲脂的铁成分可能通过利用细胞的主动运输系统帮助寡核苷酸的细胞定位和穿膜运动。对于修饰机制的进一步研究已超过了本专利的范围，且可作为另一研究的目的。但是，我们已发现这种经二茂铁修饰的寡核苷酸的高活性，提示当我们在体内模型中检测寡核苷酸时也应探索这一途径。
图13.T0639(反义)经二茂铁偶联的变体的强烈反义抑制效果。
如实验设计一节中的详细描述，成年大鼠虹膜血管增生模型为定量检测反义寡核苷酸的活性提供了一个方法。在这一检测中，将大鼠置于低氧舱中1-21天，用数字成像定量测定虹膜中增生的血管数量。如数据所示(图14.)，随着孵育时间的延长，有清晰的血管增生的过程。视网膜RNA水平也增高但未达到相同的程度(图15)。受到初步的实验结果以及大鼠模型数据的鼓舞后，我们现在意在体内的血管增生模型中获取相似的概念性证明。
C.相关经验。
主要研究者Nilabh Chaudhary，理学博士，在细胞生物学和分子生物学领域有着丰富的经验。他于1984年在加拿大的伦敦市WesternOntario大学获得了生物化学的博士学位。随后他又获得了DamonRunyon-Walter Winchell癌症基金会的一项资助，以在Rockefeller大学Dr.Gunter Blobel的实验室继续进行他的博士后研究。在1986年他被任命为Howard Hughes医学研究所的同一实验室的助理。Chaudhary博士于1992年作为研究科学家加入了Triplex(最近改名为Aronex)以开始一项细胞生物学的研究计划，其目标是开发一种能提高细胞和细胞核对核酸治疗的吸收能力的技术。他与一支有机化学家队伍紧密合作，共同设计、合成并测试新的寡核苷酸修饰和吸收增强剂。Chauahary博士是关于有治疗潜力的寡核苷酸的结构-功能相互关系等科学论文的共同作者并设计了改善其细胞内化和功效的途径。他在设计基于细胞的检测体系，免疫化学技术，蛋白质的微量定量技术，核酸纯化以及分子克隆技术，亚细胞器分离，膜蛋白质与脂的分离以及荧光显微镜技术等方面有丰富的经验。
Anthony P.Adamis，医学博士，是这一课题的合作者和顾问。它是Harvard医学院眼科系的助教授以及波士顿儿童医院外科系的研究助理。Adamis博士和他的同事于1994年首次证实了眼VEGF水平的增加、血管增生以及导致失明的主要原因之一的增生性糖尿病视网膜病过程之间的相关性。在由那时起进行的研究中，他证实了在刺激VEGF表达导致眼中血管增生中缺氧的生理作用。他广泛的研究经验包括病人的临床研究，设计基于细胞的概念性证明的啮齿动物疾病模型的开发以及分子生物学和克隆技术的应用。他已经发表了20多篇文章，其中10篇关于血管增生的领域。
D．实验设计和方法。
方法概述这一设计的目标是证实抗VEGF反义化合物在血管增生动物模型中的功效。为此，我们准备进行一系列的体外实验，以便找到最有希望用于体内实验的反义制剂。我们将以大鼠VEGF mRNA为目标的10种候选的反义寡核苷酸(19个碱基)“文库”中开始筛选。这些寡核苷酸含有C5-丙炔基嘧啶，以提高其与目标mRNA的结合亲和力，且硫代磷酸酯核苷酸间键会赋予核酸酶抗性。
为了进行细胞检测，我们计划使用大鼠C6(神经胶质瘤)细胞，其在低氧条件下产生丰富的VEGF mRNA和蛋白质。在96孔板上进行检测，其格式用于筛选各种反义或对照寡核苷酸制剂的活性。它们对于细胞外培养基中分泌的VEGF水平的影响的时间过程用ELISA方法监测。为了提高细胞的吸收，将寡核苷酸与新型的吸收增强剂一同施用。测定核酸与脂质体之间的不同比率。此外，从中选出两种“最佳的”反义序列用于与3’亲脂的二茂铁偶联，这种修饰可促进反义寡核苷酸进入细胞。还用Northern杂交来确定这两种最佳的寡核苷酸(或其制剂)对VEGF mRNA水平的影响(与恰当对照的效果比较)。
在试图提供反义机制的证据时，设计了一系列的相对独立的体外实验。分别用特异设计的VEGF同型体特异性反义寡核苷酸即其以一种或两种VEGFmRNA(大鼠中3种主要的和一种次要的)为目标处理C6细胞。用RNA酶保护实验用于测定每种VEGF mRNA的相对水平。原则上，如果这种反义效果确有序列特异性，只有目标同型体的表达被下调。不同序列的寡核苷酸无效。
最有效的反义化合物的细胞毒性在两种不同细胞系中检测，其中毒性最小的制剂将用于C6细胞球状体模型中，此模型用于确定这些寡核苷酸是否能通过细胞层。球状体中连续的细胞层中VEGF mRNA的水平用原位杂交方法测定。吸收增强剂和链的使用也将在此模型中进行检测。具有最强抗VEGF寡核苷酸的抗血管增生活性将用大鼠眼球的虹膜血管增生模型在动物中进行检测。将白化病大鼠放入低氧舱中(长达两周)，并用一种非侵害性定量数字成像系统监测虹膜中血管的增生。在此模型中缺氧条件下仅1-2天后可观察到血管生成的增加。将被检测的寡核苷酸(或其制剂)直接引入大鼠的一只眼睛中，另一只眼睛作为未经处理的对照。处理长达l周后，测定对血管生成的任何影响。视网膜中(玻璃体，如果可能的话)VEGF蛋白质和mRNA水平的改变分别用ELISA和Northern杂交方法检测。注意观测出现的任何副作用。根据最初的结果，可以采用多剂量实验。也检测对照寡核苷酸的效果。然后将毒性最低最有效的制剂(抑制＞20％新血管形成)用于扩展的一系列动物实验，作为这些研究第Ⅱ期的一部分。
反义和对照寡核苷酸的选择为了达到VEGF表达的最大抑制，我们将合成能结合到大鼠中所有VEGF同型体的10个共同区上的反义寡核苷酸(Conn等人，1990)。合成10种基本上随机选择的寡核苷酸(其中没有明显的发卡结构或G-富集区)，以用于第一轮的筛选。其中有5种是大鼠特异性的，另外5种选择也可与人mRNA结合的。并不清楚进化上保守的位点作为反义的靶点是好还是不好，虽然大多数最近的证据表明对于反义结合优选的靶点不能预测。所有合成的寡核苷酸都含有C5-丙炔基嘧啶(以提高其对目标的结合亲和力)以及硫代磷酸酯键(核酸酶抗性)(Wagner等人，1993,Fenster等人，1994)。我们已经有几种“不相关”的寡核苷酸用作对照，但是如果需要，我们将合成一种与反义序列有相同的大小以及碱基组成的对照寡核苷酸。这些寡核苷酸将由在Aronex的寡核苷酸合成小组完成合成、纯化(＞95％，用HPLC)和鉴定工作。
用于作用机制研究的寡核苷酸为了获得支持反义作用机制的数据，将制备几种(大约4种根据其效果)20个碱基的同型体-特异性寡核苷酸。一种寡核苷酸是直接针对VEGF-165mRNA上的一种序列的就不应与VEGF-120的mRNA结合。类似地，一个20碱基的寡核苷酸与VEGF-120的剪切连接体互补(即每个外显子中10个碱基)，就不该也与VEGF-165结合。合成带有重复序列的寡核苷酸(两部分序列反向重复)用作对照。这些寡核苷酸对VEGF表达的影响将通过比较不同的mRNA的相对水平加以确定。用RNA酶保护性实验测定每种mRNA的相对水平(Ambiou,Austin,TX)。此中的探针(长度大约为150-250碱基)已用大鼠mRNA序列特异性引物和RT-PCR技术(Perkin Elmer)制备。
细胞培养生物学筛选将在从大鼠神经胶质瘤中衍生的C6胶质瘤细胞中进行。在此细胞系中主要的VEGF同型体是VEGF-165(氨基酸)和VEGF-120(各个46％)，而VEGF-188只占大约8％(Bacic等人，1995)。这种细胞系已被广泛地用于研究VEGF的结构和功能。为了通过低氧条件刺激诱导VEGF的合成，将细胞置于一个低氧舱中(GasPakPlus厌氧培养箱)(BBL.Micobilology System)，用氢和钯催化剂去掉所有的氧分子。(Stein等人，1995)。典型的孵育时间范围为6-8小时。或者用100-300μM的氯化钴处理培养物，氯化钴干扰血红素依赖性低氧反应系统并激活一种诱导VEGF mRNA转录的低氧反应因子。
反义寡核苷酸活性的体外评价生长成单层的C6细胞用含5％胎牛血清和抗生素的Dulbecco培养基维持。为了初步测定抗VEGF的寡核苷酸，将细胞按10,000或20,000个细胞/孔的密度接种于96孔平板上。恢复1天后，用寡核苷酸处理细胞(在0.25ml培养基中)。测试2种类型的培养基常规的含血清的C6培养基或Optimen(Life Technologies)，这是一种血清少的培养基，通过减少血清成分中的干扰经常用于提高转染的效率。经在低氧舱中不同的培养时间之后，将上清转移到用于ELISA检测一个新的平板。作为一条原则，检测一种新的制剂时我们都利用显微镜观察细胞的形态以找出异常的改变或任何明显的毒性信号。
为了RNA分析，用一定量的制剂处理大量的细胞(＞2×106-107，在T75摇瓶中)。寡核苷酸处理之后(且经低氧处理，等等)，再次收集上清以备ELSA检测，并分离RNA用下面的方法进行分析。
VEGF ELISA检测尚未有一种适用于啮齿动物系统的商品化检测试剂盒，因此我们用已知能够与大鼠VEGF(RDI-1020或RDI-4046购自Research Diagnostics公司，其它则购自R&D Systerms)充分反应的抗体设计了一个。其它针对VEGF的抗血清也能用，因此我们选择了最佳的组合。ELISA试剂(酶联二抗，底物)购自Pierce。
RNA提取、Northern杂交、RNA酶保护实验以及杂交探针VEGF mRNA的大小在3.8-4千碱基范围内，主要是由于长的非翻译区。为作RNA分析，用RNAzol方法(Tel-Test公司，Friendswood,TX)从处理过或未处理过的细胞中分离总RNA。为用作探针，采用C6 RNA和VEGF特异性引物通过联合反转录酶-PCR(RT-PCR试剂盒，PerkinElmer)，然后根据来源于不同的mRNA的cDNA的大小筛选，再用同型体特异性引物进行选择性扩增，最后获得了相应于共同区域和同型体特异性探针的VEGF特异性片段。将这些探针克隆到PCRⅡ质粒克隆载体中(Invitrogen)，通过测序确证这些序列(测序酶，USB)。这种PCRⅡ载体允许放射性标记的RNA探针的RNA聚合酶不依赖性产生用于RNA酶保护性实验，(试剂盒购自Ambion,Austin,TX)。用β-肌动蛋白探针标定RNA的量。为了Northern杂交，将RNA(多达20μg)在甲酰胺凝胶上分离，转移到尼龙膜上，再利用放射性标记探针按照标准的方法进行检测，用β-肌动蛋白标定RNA的量。在所有的RNA分析中，光学成像仪(富士，光学成像仪)用于放射性相对水平的定量。
支持反义作用机制的实验本研究的反义寡核苷酸与编码VEGFmRNA的mRNA序列互补。然而，它们在生物体系中的抑制效果不一定证明反义作用机制。事实上，最近的分析表明许多寡核苷酸可非特异性干扰细胞代谢，尤其是当浓度超过1μM时(综述见Stein和Cheng,1993)。关于反义作用机制的证据似乎很难找到，而且目前只有一些间接的证据。我们目前已设计了实验，(虽然是间接的)意在获得可能反义机制的证据。简单地说，我们已合成用于大鼠基于细胞的检测，以选择性抑制单一VEGF变体表达的“同型体特异性”反义寡核苷酸。大鼠C6细胞(来源于神经胶质瘤)可产生三种主要类型VEGF同型体。RNA酶保护性实验已表明C6细胞中约45％的VEGF是120个氨基酸的变体，45％是165个氨基酸的变体，其余的是188个氨基酸的变体(Bacic等人，1995)。用针对一种或多种VEGF同型体的反义寡核苷酸处理细胞，再用低氧或加入可模拟低氧的200μM的氯化钴刺激mRNA的转录。处理9小时以后，VEGF mRNA的细胞水平用RNA酶保护性实验加以监测(Ambion,Austin,TX.)。重要的是，用我们通过RT-PCR技术获得的同型体特异性探针(长度大约为100-200个碱基)来确定每一种VEGF mRNA的水平，并且用相对于β-肌动蛋白的水平进行标定。如果反义作用机制成立，且用单一同型体特异性寡核苷酸，则只有一种VEGF的表达相对于其它种类而言降低。另一方面，一种与所有VEGF共同区域互补的寡核苷酸应可以减少每一种VEGF的表达。
二茂铁偶联的寡核苷酸的合成经过前几轮的筛选之后，活性最高且副作用最小的寡核苷酸通过3′端加上一个二茂铁链，以期进一步提高寡核苷酸的吸收和特异性活性(见初步结果，T30781(+二茂铁)对T30639(未经修饰))。如果有效，比较这种寡核苷酸与一种随机序列的且含有同样链的对照的活性。我们假设这种二茂铁成分可使寡核苷酸通过利用细胞的主动运输或通透系统(铁离子？)，但是这种机制尚未进行研究。
吸收增强剂的使用在大多数情况下，为了便于进入细胞，常在有阳离子脂质体试剂存在的情况下将寡核苷酸导入细胞。作为基因运输的转染剂，现已有许多商品化的阳离子脂质体，然而在我们的检测中(已实验的7种主要的脂质体)，只有Cellfectin(Life Technologies)表现出一致的效果。Cellfectin是一种多氨基脂四棕榈酰亚精胺和二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)按1∶1.5(wt/wt)的脂质混合物。我们还使用了另一种脂质体DC-chol，这是由Leaf Huang(Gao和Huang,1991)所研制的，并且已批准用于基因治疗的临床试验(Rgene Therapeutics,The Woodlands,TX)。此外，我们还设计并合成了(Guy-Caffey等人，1995)一系列能够明显提高寡核苷酸的细胞吸收，不受血清影响的且没有明显相关毒性的新型多氨基脂吸收增强剂。其中最有效的一种是SpdC(亚精胺-胆固醇)。当静脉注射入小鼠时，SpdC可促进寡核苷酸对许多组织的运输，且当向小鼠以SpdC的浓度高达100/mg/kg/天，连续注射1周以上时未见毒性(数据未给出)。
我们已制备了脂质体制剂SpdC/DOPE和DC-chol/DOPE(SpdC或DC-chol与二油酰磷酯酰胆碱)质量比范围从1∶0.5,1∶1,1∶1.5到1∶2。在我们较早的NHEK细胞的抗VEGF检测中对于两种阳离子脂质体最有效的比率为1∶1。我们正意在研究这些制剂在C6细胞系、C6球状体以及最终在眼球模型中对于抗VEGF寡核苷酸活性的增强作用。
关于这些吸收方式的确切的作用机制依然存在着争论。将阳离子脂质体与核酸混合几乎总会产生一些微小的沉淀，这些沉淀能有效地进入细胞。为了保持一致性，以及为了找到一个潜在的原理，我们用一种Coulter颗粒大小仪器来监视这些颗粒的大小。
用于体内注射的制剂我们使用一个不很严谨的名词“制剂”是为了说明在给药过程中所使用的多成分混合物。但是，当我们进行体内测试阶段时，设计用于注射入眼球内的最佳制剂是慎重的，尤其是包括吸收增强剂时。另一些需要考虑的参数是反义的数量和浓度、盐、颗粒大小、pH值和载体。Dr.Joe Wyse帮助我们选择和制备最佳的制剂。
细胞毒性检测将细胞按500个细胞/孔的密度接种于96孔板上。接种一天后，用系列稀释的寡核苷酸制剂处理细胞(每个稀释度4个孔)。处理1天或4天后，用一种非放射性检测系统监测对细胞的存活的影响(CellTiter96 Aqueous细胞增殖检测，Promega公司)。对最有效的寡核苷酸，在三种不同的细胞系上进行此检测(包括C6,NHEK及成纤维细胞系)。
在球状体中反义活性的评价C6细胞通常生长成单层(4.5g葡萄糖/L,DMEM,5％FCS加抗生素)，可以被诱导长成约0.4-0.8mm细胞球状体或聚集体。了解我们的反义寡核苷酸，与脂制成制剂的或其它的反义寡核苷酸能否穿过球状体的细胞层并且仍有生物活性很有意义。利用Stein等人(1995)所述的方法制备球状体。将C6细胞从汇合生长的培养基转移到非贴壁性的细菌培养皿，生长48小时。将出现的球状体转移到旋转摇瓶中，继续生长10天(80转/分)，经过一个10ml的取液器吸头沉淀分选得大小一致的球状体。继续生长6周，每隔一天更换一次培养基。每天往摇瓶中充入95％的空气和5％的CO2，以保证有足够的氧气和pH。
用反义制剂或合适的对照处理球状体，然后置于低氧中长达1天以诱导VEGF合成，随后用原位杂交检测球状体中VEGF mRNA的水平。为此，用4％的多聚甲醛固定球状体，冷冻，切成10μm厚的片，用前述的方法以35S标记的DNA或RNA探针作原位杂交检测产生的VEGF。
这些加工过的切片用苏木精和cosin染料进行复染，经过几天的放射自显影(Guy-Caffey，等人)将这些切片通过亮视野和暗视野照明检测。
VEGF RNA的分布将反映出反义寡核苷酸所达到的抑制程度。理想的，在所有层中VEGF mRNA的水平都很低。最可能的，在表层的VEGF较低，这或是因为药物未透入细胞层，或是因为在中央的细胞更加缺氧，因而产生更多的VEGF。如果运输只能进入表层，我们将试图设计新的给药途径。
VEGF反义寡核苷酸抗血管增生的体内活性评价成年啮齿动物VEGF-相关虹膜血管增生模型成年大鼠在低氧环境中刺激新血管在虹膜中生成。血管的增生在时间上与视网膜中VEGF mRNA水平的上调相关联。这种眼球事件的顺序在猴虹膜潮红模型和人的虹膜新生血管增生中同样可见，其中已知局部缺血的VEGF视网膜是虹膜血管增生的原因。我们意在利用这一模型检测可降低血管增生的反义化合物的活性。动物实验，包括动物的处理、外科手术、照相、计算机定量分析以及VEGF mRNA的Northern分析将在Adamis实验室中进行。
350-400g成年Kingston群体白化病Sprague-Dawley大鼠(雌性)置于低氧舱中(1％的氧气)1-21天。在培养前后进行生物显微检查和常规的裂隙照相机成像。记录下在低氧环境中虹膜血管扩张、扭曲、以及血管密度增加的过程。在这些白化病动物中可以很清楚地看到虹膜的血管。将虹膜的标准照片扫描输入计算机程序(NIH图像，1.54D软件)并用象素分析以模糊方式定量新生血管的面积。虹膜血管在14天中表现出渐进式增加。增殖细胞核抗原(PCNA)和第Ⅷ因子的免疫染色也证明内皮细胞增生始于第2天；证明增加血管代表血管增生。分离的用于Northern杂交的视网膜证实缺氧条件动物的视网膜中稳态的VEGF mRNA水平升高。总之，成年大鼠在低氧环境中刺激虹膜中新血管的生长。我们的目的是利用这一模型检测候选的抗VEGF制剂的效果。
确定中断的低氧条件对新血管形成的效果的实验上述大鼠模型仅用于连续的低氧处理。因为如果低氧处理可以被中断的话这种模型会更加实用，例如，为了反复给药，我们希望确定这些动物每天脱离低氧的条件一小段时间后虹膜血管增生的程度。我们预计这种短暂的移出会增加新血管增生，因为如果用这种方法处理新生大鼠将比在恒定氧压下的动物有更强的血管增生反应(Reynaud和Dorey,1994)。缺氧的视网膜再给氧后会产生活性氧中间物，已知这种中间物将增加视网膜VEGF mRNA蛋白质(Kuroki等人，1995)。
将大鼠置于低氧舱中(10％的氧气)1,3,5,7,14和21天(每个时间点3只动物，一共18只)。将它们每天移出1小时，并置于正常室内氧中(含氧量21％)。培养结束后，拍摄标准的虹膜照片。处死动物并将眼球的前半部分用于PCNA染色和光学显微镜检查。分离视网膜用于32p标记的558bp VEGF cDNA随机引物标记探针进行Northern杂交。
在21天的过程中，视网膜VEGF mRNA的上调与虹膜新血管生成的照片以及免疫组化的数据相关。血管的面积可以从标准照片定量，并可与处于连续低氧条件下的动物比较。从这个实验，我们可以预期在不影响低氧效果的前提下，可以从低氧舱中取出动物的最大允许的次数及每一次的时间长度。
体内反义作用效果的评价在第0天拍摄基线的照片。随机的选择麻醉动物的一只眼睛，向其注射VEGF反义化合物。另一只眼睛不作处理。给药剂量要参照体外研究的结果，但是给药不超过20μl。动物置于不中断的低氧环境中7天。在首次实验时，每种制剂处理6只动物(4种制剂只加寡核苷酸；寡核苷酸+链，以及以上两种分别再加入吸收增强剂)。目的是确定这些化合物是否确实有效。如果血管增生有明显的降低，就用更多的动物。下表总结了所需动物的统计基础。总之，每种处理方式要用大约20只大鼠。
表1．所需大鼠的数量在此模型中90％的大鼠有新生血管增生。假定有显著意义的水平为0.05(α=0.05)，权为0.8(1-β=0.80)，则每一实验组眼睛的数量可根据不同的血管增生抑制剂的效率来确定。
对照组实验组 所需眼睛数量904038905024906017907012这些实验中新血管的增生抑制定义为与对照的眼睛相比实验组眼睛中血管形成的面积减少20％。假设某一试剂的效果很好，则实验组发生虹膜血管增生的眼球比率就低，那么用以获得有统计学意义的眼睛的数量就可大大的降低。
在第7天，照相并处死动物。收集视网膜用作Northern杂交(单独的)。用光学成像仪(Moleular Dyamics)对VEGF恒定态mRNA进行定量并用28S核糖体RNA信号标定。虹膜血管进行定量并比较经过处理的和对照的眼球。
F．脊椎动物处理程序所有动物过程将在Harvard医学院的儿童医院进行，并严格遵守视觉和眼科研究协会所制定的使用动物进行研究的规章，以及Massachusattes眼睛和耳朵医学动物保护委员会建立的规章。总共将使用120只白化病的雌性Kingston群体Sprague-Dawley大鼠。它们将被麻醉且用30号的针头向玻璃体内注射20μl的寡核苷酸或对照制剂。注射之后将施以硫酸庆大霉素。将动物在10％氧环境下维持长达3周。在实验结束后它们吸入CO2处死。所有的实验都将符合OPRR的规章。
引用的文章Adamis,A.P.,等人，1994，(分子眼科学报)Arch.Ophthalmol.118:445-450Adamis,A.P.,等人，1993，(生物化学与生物物理研究通讯)Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:631-638Adamis,A.P.,等人，1996，(眼科学报)Arch.Ophthal.114:66-71Bacic等人，1995(药学新闻)Pharm.News 2:V,(abst)Bioshop等人，1996，(生物化学杂志)J.Bio.Chem.271:5698-5703.conn,(3.等人，1990，(美国科学院院刊)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2628-2632D′Amore,P.A.,1994,Investigative Ophthai.Vis.Sci.35:3974-3979deYries,C.,等人，1992，(科学)Sicence 255:989-991Fenster,S.D.,等人，1994，(生物化学)Biochemistry 33:8391-8398Ferrera,N.,等人，1992，(内分泌综述)Endocrine Reviews 13:18-31Guy-Caffey等人，1995，(生物化学杂志)J.Biol.Chem.270:31391-31396Gao,X.,和Huang,L.1991，(生物化学与生物物理研究通讯)Biochem.Biophys.Res.Comm.179:280-285Miller,J.等人，1994，(美国眼科杂志)Am.J.Pathol.145:547-584.Milligan,J.F.等人，1993(医学化学杂志)J.Med.Chem.36:1923-1937.Plate,K.H.,等人，1992，(自然)Nature 359:845-848Shima,D.T.,等人，1995，(分子医学)Molecular Med.2:64-75Shweiki等人，1992，(自然)Nature 362:841-844Stein,C.A.等人，1991，(药物治疗)Pharmac.Ther.52:365-384Stein,C.A.和Cheng,Y.C.,1993，(科学)Science 261:1004-1012Terman等人，1992，(生物化学与生物物理研究通讯)Biochem.Biophys.Res.Comm.187:1579-1586Uhlmann,F和Peyman,A,1990，化学综述(Chem.Rev.)90:543.Wagner,R.W.等人，1993,260:1510-1513Wagner,R.W.,1994，(自然)Natre 372:333-335引用的参考文献下面的参考文献提供了在这里提及方法的细节补充，此外引用作为参考。Ballaun,C.,Weninger,W.,Uthman,A.,Weich,H.,Tschachler,E.(1995)J.Invest.Ital.Dermatol.104,7-10.Behr,J.(1994)Ital.Bioconjugate Chem.5,382-389Bioshop,J.S Guy-Caffey,J.K.,Ojwang,J.O.,Smith,S.R.,Hogan,M.E.,Cossum,P.A.,Rando.R.F.,Chaudhary,N.(1996)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.271,5698-5703Carmeliet,P.,Ferreriera,V.,Breier,G.,Pollefeyet,S.,Kieckens,L.,GertTsenstein,M.,Fahrig,M.,Vandenhoeck,A.,Harpal,K.,Eberhardt,C.,Decler cq,C.,Pawling,J.,Moons,L.,Collen,D.,Risau,W.,Nagy,A.(1996)(自然)Nature 380.435-439Chaudhary,N.,Bishop,J.S.,Jayaraman,K.,Guy-Caffey,J.K.(反义寡核苷酸用于治疗时的导入手段)Delivery Strategies For AntisenseOligonucleotide Therapeutics,S.Akhtar,编(CRC出版社，BocaRaton，1995)39-60.Connolly,D.T.,Plander,J.V.(1989)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.264,20017-20024D′Amore,P.A.(1994)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.35,3974-3978de Vries,C.,Escobedo,J.A.,Ueno,H.,Houck,K.,Ferrera,N.,Williams,L.T.(1992)(科学)Science255,989-991Dvorak,H.F.,Brown,L.F.,Detmar,M.,Dvorak,A.M.(1995a)(美国病理学杂志)Am.J.Pathol.146,1029-1039Dvorak,H.F.,Detmar,M.,Claffey,K.P.,Nagy,J.A.,van der Water,L.,Senger,D.R.(1995b)Int.Arch.Allergy Immunol.107,233-235Fenster,S.D.,Wagner,R.W.,Froehler,B.C.,Chin,D.J.(1994)(生物化学)Biochemistry 33,8391-8398Ferrera,N.,Houck,K.,Jakeman,L.,Leung,D.W.(1992)(内分泌综述)Endocr,Rev.13,18-32Ferrera,N.,Carver-Moore,K.,Chen,H.,Dowd,M.,Lu,L.,O′Shea,K.S.,Powell-Braxton,L.,Hillan,K.J.,Moore,M.W.(1996)(自然)Nature 380,439-442Fisher,T.L.,Terhorst,T.,Cao,X.,Wagner,R.W.(1993)(核酸研究)Nuc.Acids.Res.21,3857Folkman,J.(1995)Nat.Med.1,27-31Frank,S.,Hubner,G.,Breier,G.,Longaker,M.T.,Greenhalgh,D.G.,Werner,S.(1995)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.270,12607-12613Gao,X.,Huang,L.(1991)(生物化学与生物物理研究通讯)Biochem.Biophys.Res.Commun.179,280-285Gao,X.,Huang,L.(1991)(生物化学与生物物理研究通讯)Biochem.Biophys.Res.Commun.179,280-285Guy-Caffey,J.K.,Bodepudi,V.,Bioshop,J.S.,Jayaraman,K.,Chaudhary,N.(1995)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.270,31391-31396Keck,P.J.,Hanser,S.D.,Krivi,G.,Sanzo,K.,Warren,T.,Feder,J.,Connolly,D.T.(1989)(科学)Science 246,1309-1312Ledley,F.(1994)(最新视觉生物技术)Curr.Opin.Biotechol.5,626-636Leung,D.W.,Cachianes,G.,Kuang,W.J.,Goedddel,D.V.,Ferrera,N.(1989)(科学)Science 246,1306-1309Lewis,J.G.,Lin,K-Y.,Kothavale,A.,Flanagan,W.M.,Matteucci,M.D.,DePrince,R.B.,Mook,J.,R.A.,Hendren.R,W.,Wagner,R.W.(1996)(美国科学院院刊)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,3176-3181Milligan,J.F.,Matteucci,M.D.,Martin,J.C.(1993)(医学化学杂志)J.Med.Chem.36,1923-1937Nomura,M.,Yamagishi,S.,Harada,S.,Hayashi,Y.,Yamashima,T.,Yamashita,J.,Yamamota,H.(1995)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.270,28316-28324Puglisi,J.D.,Tinoco,J.,I.(1989)(酶学方法)Methods Enzymol.180,304-325Robinson,G.S.,Pierce,E.A.,Rook,S.L.,Foley,E.,Webb,R.,Smith,L.E.H,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4851-4856Stein CA,Cheng Y-C(1993)(科学)Science 261 1004-1012SteinC.A.,Kreig A.M.,(1994)Antisense Res Dev 467-69Terman,B.I.,Dougher-Vermazen,M.,Carrion,M.E.,Dimitrov,D.,Armellino,D.C.,Gospodarowicz,D.,Bohlen,P.(1992)(生物化学与生物物理研究通讯)Biochem.Biophys.res.Commun.187,1579-1586Thoms,K.A.,(1996)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.271,603-606Tischer,E.,Mitchell,R.,Hartman,T.,Silva,M.,Gospodarowicz,D.,Fiddes,J.C.,Abraham,J.A.,(1991)(生物化学杂志)J.Biol.Chem.266,11947-11954Uhlmann,E.,Peyman,A.(1990)(化学综述)Chemical Reviews.90,543-548Wagner,R.W.,Matteucci,M.D.,Lewis,J.G.,Gutierrez,A.J.,Moulds,C.,Froehler,B.C.,(1993)(科学)Science,260,1510-1513Wagner,R.W.(1994)(自然)Nature 372 333-335Winternitz,C.I.,Jackson,J.K.,Oktaba,A.M.,Burt,H.M.,(1996)(药学研究)Pharm.Res.13,368-375Woolf,T.M.,Melton,D.A.,Jennings,C.G.B.(1992)(美国科学院院刊)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,7305-7309
序列表(1)基本信息(ⅰ)申请人Chaudhary,NilabhRao,T.SudhakarRevankar,Ganapathi R.
Cossum,Paul A.
Rando,Robert F.
Peyman,AnuschUhlman,Eugen(ⅱ)发明题目血管内皮生长因子表达的反义抑制物(ⅲ)序列数目21(ⅳ)联系地址(A)地址Conley,Rose&Tayon,P.C.
(B)街道600 Travis,Suite 1850(C)城市Houston(D)州Texas(E)国家美国(F)邮政编码77002-2912(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统Windows 95(D)软件Microsoft Word 7.0a(ⅵ)最近的申请数据(A)申请数量(B)提交日期(C)分类(ⅶ)在先申请日期
(A)申请数量(B)提交日期(ⅷ)代理人/代理信息(A)姓名McDaniel,C.Steven(B)登记号33,962(C)文献/卷号码1472-07200(ⅸ)电信信息(A)电话713/238-8010(B)电传713/238-8008(2)SEQ ID NO.1序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型合成核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(E)反义是(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(C)其它信息/注释=“每个残基之间的硫代磷酸酯键”(ⅹ)序列描述序列编号NO.1:GCGCTGATAG ACATCCATG19(2)SEQ ID NO.2的序列信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“每个残基之间的硫代磷酸酯键,C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.2:
GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.3序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“每个残基之间的硫代磷酸酯键,C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.3CGAUUGGAUG GCAGUAGCCT19(2)SEQ ID NO.4序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“每个残基之间的硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.4:UACUCCUGGA AGAUGUCCA19(2)SEQ ID NO.5序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置6-7；9-10；10-11；13-14(D)其它信息/注释=“所指残基之间的硫代磷酸酯键”(ⅹ)序列描述序列编号NO.5:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.6序列的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置3-4；5-6；6-7；9-10；10-11；13-14(D)其它信息/注释=“除去所指残基之间的硫代磷酸酯键”(ⅹ)序列描述序列编号NO.6:GCGCUGAUAG ACAUCCAUUG19(2)SEQ ID NO.7序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置6-7；10-11；(D)其它信息/注释=“除去所指残基之间的硫代磷酸酯键”
(ⅹ)序列描述序列编号NO.7:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.8序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“所有残基之间的硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.8:GAAGAUGUCC ACCAGGGUC19(2)SEQ ID NO.9序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19
(D)其它信息/注释=“所指残基之间的硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.9:AGGAAGCUCA UCUCUCCUA19(2)SEQ ID NO.10序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D) 拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.10:UACACGUCUG CGGAUCUUG19(2)SEQ ID NO.11序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是
(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶定”(ⅹ)序列描述序列编号NO.11:UAACUCAAGC UGCCUCGCC19(2)SEQ ID NO.12序列的信息(ⅱ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.12:CCAUGAACUU CACCACUUC19(2)SEQ ID NO.13序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.13:GACAUCCAUG AACUUCACC19(2)SEQ ID NO.14序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.14:GGCUGGCAGU AGCUGCGCU19(2)SEQ ID NO.15序列的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.15:GGAUGGCAGU AGCUGCGCU19(2)SEQ ID NO.16序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基胞嘧啶残基”(ⅹ)序列描述序列编号NO.16:GCGCTGATAG ACATCCATG19(2)SEQ ID NO.17序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基尿嘧啶残基”(ⅹ)序列描述序列编号NO.17:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.18序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，在残基8，12,14和15处的C5-丙炔基嘧啶”
(ⅹ)序列描述序列编号NO.18:GCGCTGAUAG ACAUCCATG19(2)SEQ ID NO.19序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，在残基2,5,8,12,15和18处的C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.19:GCGCUGAUAG ACATCCAUG19(2)SEQ ID NO.20序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature
(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶，3’末端连接于脂质链”(ⅹ)序列描述序列编号NO.20:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.21序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，除去残基1-5,8-9,12-13,14-15和16-19之间；3’末端芘；C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.21:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.22序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性
(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-己炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列编号NO.22:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.23序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基嘧啶”ⅹ)序列描述序列编号NO.23:GCGCUGACAG ACAUUCAUG19(2)SEQ ID NO.24序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义否(ⅹ)序列描述序列编号NO.24:CATGGATGTC TATCAGCGC19(2)SEQ ID NO.25序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义否(ⅹ)序列描述序列编号NO.25:CATGGATGTC TATCAGCGC19(2)SEQ ID NO.26序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-feature
(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基胞嘧啶残基”(ⅹ)序列描述序列编号NO.26:AGAGCAGCAA GGCGAGGCT19(2)SEQ ID NO.27序列的信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ⅳ)反义是(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-featute(B)位置1-19(D)其它信息/注释=“硫代磷酸酯键，C5-丙炔基胞嘧啶残基”(ⅹ)序列描述序列编号NO.27:CAUGGAUGUC UAUCAGCGC19
权利要求
1．一种减少所处理的细胞中细胞VEGF产生的反义寡核苷酸，用该反义寡核苷酸在低于大约1μM的浓度下处理；处理过的细胞产生的VEGF不超过未经过处理的细胞产生的约90％。
2．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸能与编码VEGF的mRNA上的RNA序列结合。
3．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸能与至少两种编码VEGF的mRNA上的RNA序列结合。
4．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸能与VEGF206的mRNA上的RNA序列结合。
5．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸能与VEGF185的mRNA上的RNA序列结合。
6．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸能与VEGF165的mRNA上的RNA序列结合。
7．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸能与VEGF121的mRNA上的RNA序列结合。
8．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含降低该反义寡核苷酸被核酸酶降解的速率的化学成分。
9．权利要求1的反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含硫代磷酸酯基团和磷酸二酯基团。
10．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含一对与抗核酸酶降解的化学部分相连的相邻残基。
11．权利要求8的反义寡核苷酸，其中所述的降低该反义寡核苷酸被核酸酶降解的速率的成分是硫代磷酸酯基团。
12．权利要求8的反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每个残基是以硫代磷酸酯基团相连。
13．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸包含选自C5-丙炔基尿苷，C5-丙炔基胞苷，C5-己炔基尿苷，C5-己炔基胞苷，6-氮杂尿苷和6-氮杂胞苷中选取的核苷酸残基。
14．权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸含有硫代磷酸酯基团和选自C5-丙炔基尿苷，C5-丙炔基胞苷，C5-己炔基尿苷，C5-己炔基胞苷，6-氮杂尿苷和6-氮杂-胞苷中的核苷酸残基。
15．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含C5-丙炔基尿苷残基。
16．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含C5-丙炔基尿苷残基和硫代磷酸酯基团。
17．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含C5-丙炔基胞苷残基。
18．权利要求1中的反义寡核苷酸，其包含C5-丙炔基胞苷残基和硫代磷酸酯基团。
19．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含C5-己炔基尿苷残基和硫代磷酸酯基团。
20．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含C5-己炔基胞苷残基。
21．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含C5-己炔基胞苷残基和硫代磷酸酯基团。
22．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含6-氮杂脱氧尿苷残基。
23．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含6-氮杂脱氧尿苷残基和硫代磷酸酯基团。
24．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含6-氮杂脱氧胞苷残基。
25．权利要求1的反义寡核苷酸，其包含6-氮杂脱氧胞苷残基和硫代磷酸酯基团。
26．一种含有一种反义寡核苷酸的组合物，用该寡核苷酸在浓度低于约1μM时处理细胞，所处理的细胞产生的VEGF减少，该经过处理的细胞最多产生由未经处理的细胞产生的VEGF的约90％，该组合物还含有一种细胞吸收增强剂。
27．权利要求26的组合物，其中所述的细胞吸收增强剂是一种亲脂成分。
28．权利要求27的组合物，其中的亲脂成分含有胆固醇。
29．权利要求1的组合物，其中所述的寡核苷酸还包含与阳离子形成一种盐的离子键。
30．权利要求29的组合物，其中所述的阳离子是阳离子脂。
31．权利要求30的组合物，其中所述的阳离子脂是一种多氨基脂。
32．权利要求31的组合物，其中所述的多氨基脂是亚精胺-胆固醇。
33．权利要求26的组合物，其中所述的细胞吸收增强剂含有一种脂质体。
34．权利要求33的组合物，其中所述的脂质体含有Cellfectin。
35．权利要求33的组合物，其中所述的脂质体含有与DOPE混合的亚精胺-胆固醇。
36．一种能与VEGF mRNA结合并含有硫代磷酸酯基团以及选自C5-丙炔基尿苷，C5-丙炔基胞苷，C5-己炔基尿苷，C5-己炔基胞苷，6-氮杂脱氧尿苷和6-氮杂-脱氧胞苷的核苷酸残基的反义寡核苷酸，其中所述的反义寡核苷酸的双螺旋解链温度比相同的但无化学修饰的嘧啶残基的反义寡核苷酸至少要高约5℃；该反义寡核苷酸减少了在用浓度低于约1μM的该寡核苷酸处理过的细胞中细胞的VEGF的生产；该处理过的细胞产生不超过由未处理过的细胞产生的VEGF的约90％。
37．一种含有一种能与VEGF mRNA结合且带有硫代磷酸酯基团以及选自C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-己炔基尿苷、C5-己炔基胞苷、6-氮杂脱氧尿苷和6-氮杂脱氧胞苷中的核苷酸残基的反义寡核苷酸的组合物，其中该反义寡核苷酸的双螺旋解链温度比相同的但无化学修饰的嘧啶残基的反义寡核苷酸至少高约5℃；该反义寡核苷酸减少了在用浓度低于约1μM时的该寡核苷酸处理过的细胞中细胞的VEGF的生产，该处理过的细胞产生不超过由未处理过的细胞产生的VEGF的约90％；该组合物也含有聚合的持续释放的化合物。
38．在含有硫代磷酸酯键以及能与编码VEGF的mRNA结合的一种反义寡核苷酸的改进体中包含在反义寡核苷酸中含有选自C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-己炔基尿苷、C5-己炔基胞苷、6-氮杂脱氧尿苷和6-氮杂脱氧胞苷中的核苷酸残基；其中该改进体增加了一种反义寡核苷酸的双螺旋解链温度至少约5℃。
39．一种减少在细胞中细胞VEGF产生的方法，其包含用权利要求1的反义寡核苷酸接触一种细胞，该细胞产生最多不超过由来处理过的细胞产生的VEGF的约90％，该寡核苷酸浓度不超过1μM。
40．一种选自序列编号No.2-22的反义寡核苷酸。
41．一种包含具有序列编号No.2的反义寡核苷酸的组合物。
42．一种包含具有序列编号No.3的反义寡核苷酸的组合物。
43．一种包含具有序列编号No.4的反义寡核苷酸的组合物。
44．一种包含具有序列编号No.6的反义寡核苷酸的组合物。
45．一种包含具有序列编号No.10的反义寡核苷酸的组合物。
46．一种包含具有序列编号No.20的反义寡核苷酸的组合物。
47．一种包含具有序列编号No.21的反义寡核苷酸的组合物。
48．一种包含具有序列编号No.22的反义寡核苷酸的组合物。
全文摘要
本发明涉及利用寡核苷酸抑制血管内皮细胞生长因子的表达。本发明的寡核苷酸可与目标mRNA以序列特异性的方式结合,并阻碍其编码的基因表达。公开了为提高其稳定性和结合效率的寡核苷酸化学修饰。这些修饰的方法可以提高本发明所设计的寡核苷酸的稳定性和功效。该寡核苷酸组合物可用于离体疗法治疗巨噬细胞,或者通过注射、吸入或局部治疗或其它给药途径用于体内治疗。
文档编号C07H19/173GK1222192SQ97194721
公开日1999年7月7日 申请日期1997年4月17日 优先权日1997年4月17日
发明者N·考德哈里, T·S·劳, G·R·雷范卡, P·A·柯萨姆, R·F·兰多, A·佩曼, E·尤尔曼 申请人:德国赫彻斯特马里奥罗塞尔有限公司, 阿罗尼克斯药物公司