一种血管生长抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法

专利名称：：一种血管生长抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法
技术领域：
：本发明涉及一种血管生长抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法。
背景技术：
：全世界每年约有500万人死于肿瘤。早在20世纪70年代，folkman就提出，肿瘤生长是血管依赖性的。血管的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段到有血管的快速生长阶段。血管的生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。血管的生成主要依赖血管生成刺激因子和抑制因子的调节。在肿瘤治疗领域抑制占主导地位的是直接杀伤肿瘤细胞的策略，即先进行肿瘤切除手术或通过放疗使原发瘤消退，再进行放化疗，以消除体内残留的癌细胞。这种策略的缺点是特异性不高，对病人的副作用太大，甚至有时治疗手段可以加速病人的死亡，而且癌细胞反复暴露于化疗下会产生抗药性，严重影响治疗效果，所以很多肿瘤专家的注意力从肿瘤细胞本身转移到总体肿瘤组织，尤其是血管生成过程。以肿瘤组织的血管为耙目标与直接针对肿瘤细胞本身相比有两个显著的优点首先，由于许多固体瘤(或许还有某些白血病)是血管生成依赖的，因而这种方法不必为某种特定的肿瘤而制定特定的治疗方案。其次，抗血管生成药物只是阻止新生血管的生长，不攻击健康血管，理论上对正常血管无害并且不产生抗药性。正常成年人体内新生血管的生成处于相对静息的状态，只有0.01%左右的内皮细胞处于分裂期，而肿瘤血管处于分裂周期的内皮细胞比例要高出2一3个数量级，因此，抑制内皮细胞增殖对正常组织影响非常小。人纤维蛋白溶酶原是一种血管生成抑制因子，由790个氨基酸残基组成，分子量92X103。它是一种含有5个Kringle结构域和一个丝氨酸蛋白酶去的分泌性糖蛋白，每个环由76—80个氨基酸组成，K5环即其中的一个环，其分子量大小14大约为92kD。有人从荷瘤的小鼠尿液和血清中分离到血管抑素，它与人纤维蛋白溶酶原Kringle1-4区有高度的同源性。随后有实验证明血管抑素能特异性的抑制血管内皮细胞的增殖，也可以抑制原发瘤以及转移瘤组织中的血管生成1996年Cao等人比较了血管抑素中各个Kringle区的抗血管增生活性，发现每个独立的ringle片段都能不同程度地抑制内皮细胞增殖，而且单独的k5片段抗血管活性更强，它是目前所知道的抑制内皮细胞增殖和迁移最有效的纤维蛋白溶酶原片段。Kl，K2，K3具有抑制活性而k4具有低的抑制活性，Kl和k3的抑制活性又要强于k2。有意思的是，在研究K2-K3片段活性时，其活性要比K2强而弱于K3.当把K2、K3同时作用于内皮细胞时其抑制活性明显升高。纤维蛋白溶酶原不能自发地发挥作用，需要有纤溶酶原激活剂(PA)的激活。它们共同组成一个所谓的纤溶系统。体内PA主要是组织型PA(tissue-typePA)简称t-PA.此外还有尿激酶型PA(简称u-PA),双链u-PA，即为尿激酶(urokinase)。它们也都是糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶类。人t-PA，相对分子量为70X103，含527个残基，分子由5个结构域指形区，生长因子区，两个环饼区和一个丝氨酸蛋白酶区组成。纤维蛋白溶酶原经PA，如t-PA作用，断去部分肽链转变成纤维蛋白溶酶。纤维蛋白溶酶专门断裂血纤蛋白棒状连接区中的肽链，此酶能通过水性通道进入血纤蛋白凝块内部，以接近其中的棒状连接区。编码t-PA的基因已被克隆并在培养的哺乳细胞中表达。重组DNA方法长生的t-PA已在临床上得到应用。采用静脉注射t-PA方法lh内形成的冠状动脉血栓，可被溶开，明显地提高心肌梗塞病人的存活率。完整的Kringle结构对纤维蛋白原水解片段抗血管增生能力有重大影响。有研究证实破坏血管抑素Kringle环之间和环内部的二硫键能显著降低其抗内皮细胞增殖的活性。但是对K5的Kringle结构研究则有不同的看法。用还原和垸基化处理的K5比K5本身具有更强的抗内皮细胞增生能力。其原因可能是Kringle结构"掩盖"了K5中某些功能性基团与内皮细胞的有效作用。另外，K5还可以抑制内皮细胞的运动，它可以使内皮细胞分裂周期停止和促进细胞调亡。K5是通过调节血管生成的调节因子发挥作用的。K5可使血管壁细胞和和15视网膜中的血管内皮生长因子减少，还可使血管生成抑制因子色素表皮生长因子增多，且存在剂量依赖关系。内源性的血管生成刺激因子的下调和血管生成抑制因子的上调，引起血管生成平衡失调，可能是k5抑制血管活性的机制。因为K5具有强的抑制内皮细胞增生的活力，且它的氨基酸序列较短，被认为在治疗肿瘤疾病中有较大的应用潜力。应用现代生物技术，根据已报道的K5的氨基酸残基序列和大肠杆菌遗传密码的偏爱性，可人工合成纤维蛋白溶酶原K5全基因。运用基因工程相关原理，K5基因在大肠杆菌中的表达是有可能实现的。但是实现K5的大批量生产会遇到一些难题，比如怎样实现它的高效表达，怎样实现其发酵条件的优化以及K5的分离纯化技术的优化。K5基因在大肠杆菌中的高效表达可为K5的活性机理研究和新型抗血管生成药物开发奠定基础。
发明内容本发明提供了一种血管生长抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法，进行了目的序列扩增，成功连接于载体并导入细胞，双酶切鉴定确认。小型发酵诱导蛋白表达，SDS-PAGE鉴定确认，Kringle5蛋白以包涵体形式存在。获得肿瘤血管生长抑制因子K(5)基因的克隆产物，表达产物及其工程菌。成功构建pET28a(+)-K5基因的非融合表达载体。为K5基因在大肠杆菌中的非融合表达的研究奠定了基础。本发明技术解决方案如下一种血管生长抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鉴定和表达方法，其特殊之处是包含以下步骤l]、ThioA/L15/7和E.coliPET32(载体)质粒DNA的制备(1)质粒提取试剂溶液I:每瓶约100毫升，含50認ol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL(PH8.0)，10mmol/LEDTA(PH8.0，)在6.895*104Pa灭菌15min，储存于4。C;溶液Ih0.2mol/LNa0H(临用前贮存液现用现配)1%SDS;溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml;溶液I，溶液III于150kg/cm2，灭菌20分钟；以上试剂均为国产分析纯；(2)操作在超净工作台中将2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基加入到容量为l5ml试管中，接入ThioA/L15/7单菌落，于37。C剧烈振摇下培养过夜，吸取l.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余贮存于4"C。含有l0Oug/ml氨卞抗生素的LB培养基在上述沉淀中加入100ul用冰预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全分散；在加入20Oul新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；在加入l50ul用冰预冷的溶液ni，盖紧管口，温和振荡io秒，使溶液m在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后置于冰上5min，加入RNAase3ul，于60。C水浴20min,12000g离心5min，将上清转入另一加入200ul苯酚和200ul24:1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合使双链DNA沉淀，室温下放置2min，在于12000g离心3min，吸取上清液于另一离心管中，用800ul纯乙醇洗涤双链DNA，摇匀，在冰箱冷冻区静置两小时，12000g离心5min,除去上清，贴壁缓慢加入70%冰预冷的乙醇，12000g离心5min，尽量除去上清放置于37。C烘箱烘干，用25ul无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取5ul做P/o琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-2(TC;载体pET32a质粒DNA制备同上；2]、目的基因Kringle5的PCR:(1)试剂引物序列上游引物5，GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3，NcoI25bp下游引物3，GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，EcoRI28bpTaq-DNApolyase是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有依赖于聚合作用的5'^3'外切核酸酶活性，最佳作用温度为75'C—80'C，需要在低于最适温度的条件下起始聚合反应，以免引物从模板上解离，Taq-DNApolyase作用时需要Mg2+.由于引物模板杂交体的解链和退火温度受二价阳离子的影响，需考虑扩增反应的最佳Mg2+浓度。磷酸盐缓冲液抑制Taq-DNApolyase活性，扩增反应通常在Tris缓冲液中进行，该缓冲液在室温下pH为8.3;(2)操作200ul离心管中加入10XBuffer5ul，dNTP4ul，引物P12ul，P22ul，模板质粒2ul,Taq-DNApolyase0.5ul，无菌水34.5ul，使反应体系总体积为50ul，最后用少量液体石蜡密封，在PCR仪上进行反应；PCR参数为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>取5ulPCR反应产物和lulmarker进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物大小。3]、PCR产物的抽提纯化(1)试剂TE(Ph二8.0):10腿ol/LTris-Hcl(PH=8.0)+lmmol/LEDTA(PH=8.0)(2)操作将PCR产物转移至1.5ml离心管，加入TE(PH8.0)补足140ul，加入苯酚和24:1的氯仿/异戊醇溶液各70ul，振摇，于15000g离心10min，取上清并向其中加入24:1的氯仿/异戊醇溶液140ul，振摇，于15000g离心10min，取上清并向其中加入14ul3MNaAc及420ul(3倍体积)无水乙醇，在-70°C冰箱中静置2小时，取出后于15000g离心15min。加入lml70%乙醇洗涤，于15000g离心15min，放入烘箱干燥，取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。4]、双酶切PCR产物以及载体质粒DNA:(1)试剂NcoI酶切位点5，..CTCATGG..3，3，..GGTACAC..5，热失活性65。C，20minEcoRI酶切位点5，..GTAATTC..3，3，..CTTAAAG..3，热失活性65°C，20min(2)操作向离心管中加入lOXBuffer2ul,0.1%BSA2ul，PCR产物14ul,NcoII.2ul,EcoRI0.8ul，总反应体积为20ul，向离心管中加入lOXBuffer2ul，0.1%BSA2ul，载体质粒DNA12ul，NcoII.2ul，EcoRI0.8ul，无菌水2ul，总反应体积为20ul，将上述两离心管于36°C士水浴过夜，将酶切产物全部进行2%琼脂糖凝胶电泳；5]、DNA凝胶回收(1)试剂DNA凝胶回收试剂盒包括DE-A:凝胶融化剂(含DNA保护剂)DE-B:高离液序列溶液(使大于lOObp的DNA片段选择性的结合到DNA制备Wl:洗涤液W2:洗涤液洗脱液2.5mMTris-Hcl，Ph=8.5(2)操作首先紫外灯下切下含有目的DNA的凝胶，用纸巾吸干并切碎，肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA凝胶重0.08g,载体DNA凝胶重0.llg，分别作为一个凝胶体积.分别向其中加入5个凝胶体积的DE-A溶液，混和均匀后于75'C加热，间断混合,直至凝胶完全融化.加入0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混合均匀，由于肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA分子量为300bp，向其中再加入异丙醇至终浓度为20%.分别吸取上述混合物，转移到DNA制备管中，放置于2ml离心管中，于3600rpm离心1min,如有残留，提速再离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，19加0.5mlWl溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。重复一次将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液,3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，最高速离心lmin。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ul洗脱液，室温静置lmin。最高速离心lmin洗脱DNA，分别得到目的基因Kringle5的双酶切片段和载体pET32a的双酶切片段；6]、制备重组载体pET32/kringle5(1)试剂T4ligase可催化双链DNA或RNA中的5'-磷酸和3，-羟基间形成磷酸二酯键，可连接两个平末端，可修复dsDNA,dsRNA，RNA/DNA的缺刻。热失活性65。C，10min，(2)操作10XBufferlul，Kringle5的双酶切片段4ul，载体pET32a的双酶切片段2ul，T4ligaselul,H202ul.总反应体积为10ul.16'C恒温过夜酶连;7]、感受态细胞的制备(1)试剂0.2mol/LCacl2溶液0.1mol/LCaCl厂甘油溶液25%甘油+0.1MCaCl2(2)操作从37-C培养16-20小时的BL21新鲜平板上挑取一个直径2-3mm的单菌落，转移到一个含有50ml培养基的1升烧瓶中，37°C300转/min振荡3小时，在超净台中，将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，继续在冰上放置10分钟。于4。C4000rpm离心10min回收细胞，倒去培养液，将管倒置1分钟使残留培养液流尽，用10ml用冰预冷的0.1mol/LCacl2重悬沉淀，放置于冰上，于4。C4000rpm离心10min，倒出培养液，倒置1min，使残留培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2-甘油重悬每份细胞沉淀，将此溶液分成200ul/每管，若做转化，直接使用，若保存，则每管中加入7ulDMS0(二甲基亚砜)，冰上放置15min，加7ulDMSO，直接放置于-7(TC冰箱中，或直接加水于-7(TC保存；208]、感受态细胞的转化从-7(TC冰箱中取出一管200ul的感受态细胞BL21，手中握化放置到冰上，每管中加入2ml重组载体pET32/kringle5，轻轻旋转，在冰上放置30mim，将管放到42。C水浴中慢慢振摇90s,快速转至冰浴中冷却2min，另取5ml小试管，每管加500ul未加抗生素的LB培养基，用水浴加温至37"C,将上面已经转化的感受态细胞BL21加入其中，放置于37'C摇床上220rpm以下温浴45分钟，使转化了的BL21复苏并且表达重组载体pET32/kringle5氨卞抗性标记基因，将上述lml温浴的培养液5000rpm离心5分钟，吸去上面的500ul，下面的200ul用于铺板，在超净工作台上，将此200ul已转化的感受态细胞转移到事先放于37'C烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB琼脂培养基上，平板倒置于37'C下培养14小时左右可出现菌落；9]、小型发酵及重组蛋白的诱导表达(1)试剂诱导剂IPTG，0.1MTris-HCl(PH8.0)，lmg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制备分离胶现配成5ml其中H201.434ml，30。/。丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，腦SDS0.05ml,10%(NH》2S2O80.05ml，TEMED(凝固剂)O.002ml.浓縮胶现配成2ml其中H201.434ml，30呢丙烯酰胺0.33ml，1.Omol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10%SDS0.02ml，10%(NH4)2S2080.02ml，TEMED(凝固剂)O.002ml.(2)操作挑取上述转化后的培养出的单菌落至含有7ml培养液的试管中，37°C300rpm振荡过夜，吸取200ul培养物以1:30接种于含100ug/ml氨卞的LB培养基中，37°C300rpm振荡3小时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为lmmol/ml，再于37°C300rpm振荡3小时，取1.5mli秀导菌，离心收集菌体，用200ul0.1MTris-HC1舰O)重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入100ul0.lMTris-HCl(ra8.0)重悬菌体，再加入50ullmg/ml溶菌酶，于-7(TC冰箱放置半小时，37"C水浴521分钟，再放入-7(TC冰箱5分钟，反复冻融五次后，于12000rpm离心10分钟，收集上清(为细胞质部分)，沉淀为包涵体部分，上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDS-PAGE，染色，脱色，成像；10]、培养并提取质粒，双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定挑取转化后的BL21单菌落于2ml含有l00ug/ml氨卞抗生素的LB培养基中，按照1.2.1提取质粒，按照1.2.4进行双酶切后，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。一种血管生长抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鉴定和表达方法，其特殊之处是包含以下步骤l]、根据K5基因全序列设计其编码区的上下游引物，引物中设计酶切位点以及保护碱基，上游引物为5，CATGCCATGGCAGCTCCCGGATGTAG3，下划线部分为yVco/酶切位点，下游引物为5，CCCAAGCTTTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，下划线部分为历/7rfffl酶切位点，引物为上海生物工程有限公司合成。2]、K5基因的TD-PCR扩增TD-PCR反应体系Volume10XBuffer514d證(10mM)414MgCl2314引物各2模板(cDNA)0.5WTaq酶1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>3]、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳(1)制胶称取0.40g的琼脂糖，置专用三角瓶，加入50ml的蒸馏水，加热至沸腾；待冷却后，加入少许溴化乙锭贮存液，混匀后倒入事先插好梳子的电泳槽中，待其冷却凝固后加入适量的电泳缓冲液，小心取出梳子。(加样孔的一端靠近阴极。)小心操作，千万不要让溴化乙锭接触自己或污染环境。(2)上样用微量移液枪吸取10x的loadingbuffer3rt,置于标签纸背面，再吸取PCR产物6W，混匀之后加入到加样孔中。在旁边的加样孔中加入DNAMarker做14cycks72。C7min延伸对照。注意枪头不要戳破凝胶。(3)电泳接通电泳池的电源调节电压至100v，待样品完全进入凝胶中调节电压为80v进行电泳。根据电泳检测的需要，待溴酚蓝指示剂泳至适当位置后调小并切断电源。(4)分析:在凝胶成像仪下观察。4]、pET28a+质粒DNA的小量制备(1)试剂溶液I:每瓶(100ml)含50rranol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-HCL(PH8.0)10咖ol/LEDTA(pH8.0)，6.895X104Pa灭菌15分钟后存储于4°C，溶液II:0.2mmol/LNa0H，1%SDS.(现用现配)，溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，6.895X104Pa灭菌20分钟后存储于4°C。以上试剂均为国产分析纯(2)操作在无菌操作台中将3ml含有lOOPg/mlAmp的LB培养基加入到容量为15ml的试管中，接入pET28a+菌液3014，于37"C激烈振荡培养过夜。吸取1.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余培养物贮存于4"C，在含有沉淀的试管中加入的溶液I(预冷)，剧烈振荡使沉淀完全分散；再加入20(^l新配制的溶液n，盖紧管口，快速颠倒5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；再加入预冷的溶液in，盖紧管口，温和振荡10秒使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后置于冰上5分钟加入Rnase于6(TC水浴20分钟，12000g离心5分钟,将上清转入另一加有20014苯酚和200W24:1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合是双链DNA沉淀，室温下放置2分钟，在12000g离心3分钟。小心吸取上清液于另一离心管中，用80014纯乙醇洗涤双链DNA，70%的冰预冷的乙醇，12000g离心5min，尽量除去上清放置于37。C烘箱烘干，用2514无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取5!4做1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-20'C;5]、双酶切PCR产物和载体质粒DNA反应体系:VolumeNocI1^1HindIII1)410XMBufferDNA或PCR产物歸l无菌水upto酶切温度为37-C，时间为3.5h。6]、DNA片断的琼脂糖凝胶检测以及胶回收。(1)试剂(DNA凝胶回收试剂盒)BufferDE-A:凝胶融化剂(含DNA保护剂)BufferDE-B:DNA结合溶液BufferWl:洗涤液BufferW2:脱盐液(使用前按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇)Eluent:2.5mMTris-HCl，PH8.5，DNA洗脱溶液(2)操作(2.1)首先在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用至今锡金凝胶表面液体。尽量减小凝胶体积，大体积的凝胶块需切成小块，以縮短步骤4中凝胶融化的时间。(2.2)称量凝胶重量，以lmg^yl换算凝胶体积。根据凝胶浓度，按表所提供的参数加BufferDE-A:凝胶浓度BufferDE—A体积■1.0%3个凝胶体积本实验需要回收的是双酶切pET28a+和K5片段，使用的胶都是0.8%，所以加人3个凝胶体积的BufferDE—A。(2.3)悬浮均匀后于75。C加热，每隔2—3分钟混合一次，直至凝胶块完全融化(约6—8分钟)。(2.4)按BufferDE—A体积的50%加入BufferDE—B混合均匀。当回收的DNA片段小于500bp时，添加异丙醇，使异丙醇的终浓度为20%。(2.5)将DNA-pr印Tube置于2mlMicrofugeTube中，将步骤5中的混合液移入DNA-pr印Tube中，5500rpm离心1分钟。(2.6)弃滤液，将DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入500ul已加无水乙醇的BufferWl，5500rpm离心1分钟(2.7)弃滤液，将DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入700ul已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1分钟，以同样的方法再用700ulBufferW2洗涤一次。(2.8)将DNA-pr印Tube置于1.5ml离心管中，12000Xg离心1分钟。(2.9)将DNA-pr印Tube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25—30ulEluent或去离子水，室温静置1分钟。12000Xg离心1分钟洗脱腿。7]、重组载体pET28a+/K5的制备反应体系入下表Volume回收的pET28a+质粒10Pi回收K5片段5W10XT4DNALigaseBuffer2Pi10XT4DNALigase1.514无菌水upto25Pi16卩保温过夜，一2(TC保存备用，8]、感受态细胞的制备(1)试剂-(1.1)CaCl2溶液(冰冷)0.lmol/LCaCl2溶液，使用一次性滤器过滤除菌后，-4X:冰箱存储备用，(1.2)0.lmol/ECaCl2甘油溶液25%的甘油+0.lMCaCL2。使用一次性滤器过滤除菌后，-4匸冰箱保存备用(2)操作(2.1)无菌条件下接种大肠杆菌BL21菌株单菌落入5mlLB液体培养基中，37r培养过夜。第二天，倒入250ml的LB液体培养基中，37〔振荡3.5h-4,0h(600=0.40.6)，停止培养，(2.2)将培养液分装到8个25ml预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置5_10分钟，然后4。C,8000rmp离心8min，(2.3)细胞沉淀用10ml冰冷的CaC12溶液重悬，4°C6000rmp离心5分钟，(2.4))弃上清后，加入10ml冰冷的CaC12溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4。C，6000rmp离心5分钟，(2.5)弃上清后，加入2ml冰冷的CaC12溶液重悬细胞，按每管200ul量分装于预冷的0.5ml离心管中，立即冻存于-75匸冰柜中备用，9]、重组质粒的转化以及保存(1)将10uL连接产物加到200uL感受态细胞悬液中，混匀，冰浴30-40分钟，42'C水浴保温90秒，立即置冰上l-2分钟，然后转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行对照培养，(2)将转化成功的大肠杆菌，挑取单菌落于液体培养基，进行纯化扩增培养，37。C剧烈振摇过夜。吸取过夜摇床培养的培养物500ul加入1.5ml的离心管中，再加40%的甘油500ul混合均匀后于-20或-7(TC保藏，定期进行活化重保藏，以防菌种退化或质粒丢失。10]、重组质粒的提取方法同前，11]、重组质粒的PCR检测27检测观察。本发明的优点为进行了目的序列扩增，成功连接于载体并导入细胞，双酶切鉴定确认。小型发酵诱导蛋白表达，SDS-PAGE鉴定确认，Kringle5蛋白以包涵体形式存在。获得肿瘤血管生长抑制因子K(5)基因的克隆产物，表达产物及其工程菌。成功构建pET28a(+)-K5基因的非融合表达载体。为K5基因在大肠杆菌中的非融合表达的研究奠定了基础。图1为纤维蛋白溶酶原结构示意图。图2为一种血管生长抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鉴定和表达方法流程图。图3为一种血管生长抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鉴定和表达方法流程图。图4为ThioA/L15/7和E.coliPET32a载体。图5为蛋白Kringle5带。图6为片断PCR扩增电泳图谱，其中CR产物，2为DNAMarker，3为PCR产物。图7为质粒中的目的片断的PCR鉴定电泳图谱，泳道1和泳道3是PCR产物，泳道2为DNAMarker，从上到下依次为2000bp,1000bp，750bp,500bp,250bp,100bp。具体实施例方式一种血管生长抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鉴定和表达方法(1.)目的构建angiostatinK5cDNA表达载体，并将其导入大肠杆菌中，提取后酶切鉴定。小型发酵诱导感受态细胞表达K5基因，SDS-PAGE鉴定表达产物K5。(2.)方法angiostatinK5cDNA在ThioA/L15/7菌株的质粒中，质粒提取后进行目的序列PCR扩增，产物提纯后双酶切，然后将目的基因连接于载体pET32a，重组载体pET32a/kringle5导入感受态细胞E.coliBL21，培养并提取质粒，最终双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。小型发酵，用IPTG诱导已转化的感受态细胞BL21表达K5基因，溶菌酶破碎菌体后SDS-PAGE鉴定表达产物K5蛋白。(3.)结果进行了目的序列扩增，成功连接于载体并导入细胞，双酶切鉴定确认。小型发酵诱导蛋白表达，SDS-PAGE鉴定确认，Kringle5蛋白以包涵体形式存在。(4.)结论获得肿瘤血管生长抑制因子K(5)基因的克隆产物，表达产物及其工程菌。1.1材料1.1.1菌株和质粒菌株E.coliBL21载体pET32a质粒目的基因-Kringle-5ofAngiostatin均由本实验中心保藏，提供。Kringle5蛋白序列CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQ隠AQEP臓SIFTPENPRAGLE證CRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQC1.1.2培养基LB培养基胰蛋白胨10酵母提取物5克氯化钠10克加水至1000毫升，150kg/cm2，灭菌20分钟琼脂培养基胰蛋白胨10克酵母提取物5克氯化钠10克琼脂粉15克加水至1000毫升，150kg/cm2，灭菌20分钟1.1.3DNA凝胶回收试剂盒DNAgelextractionkit杭州维特洁生化技术有限公司1.1.4酶切与酶连接试剂NcoI&EcoRIT4ligase宝生物工程(大连)有限公司1.1.5仪器离心机GTL-16AL高速台式离心机南京大学研制江苏省兴化市分析仪器厂生产离心机AvantiJ-25高速冷冻离心机Beckman公司生产PCR扩增仪T-GmdientThermoblock德国Biometra公司生产凝胶成像系统1.2方法1.2.1ThioA/L15/7和E.coliPET32(载体)质粒DNA的制备(1)质粒提取试剂溶液I:每瓶约100毫升，含50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL(PH8.0),10聽1/LEDTA(PH8.0，)在6.895*104Pa灭菌15min，储存于4。C溶液II:0.2mol/LNa0H(临用前贮存液现用现配)1%SDS溶液ni:配成100ml含5mol/Lkac60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml溶液I，溶液III于150kg/cm2，灭菌20分钟(以上试剂均为国产分析纯)(2)操作在超净工作台中将2ml含有l0Qug/ml氨卞抗生素的LB培养基加入到容量为15ml试管中，接入ThioA/L15/7单菌落，于37。C剧烈振摇下培养过夜。吸取l.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余贮存于4。C。含有l00ug/ml氨卞抗生素的LBi肯养基在上述沉淀中加入100ul用冰预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全分散；在加入20Oul新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；在加入l50ul用冰预冷的溶液m，盖紧管口，温和振荡l0秒，使溶液m在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后置于冰上5min，加入RNAase3ul，于60。C水浴20min，12000g离心5min，将上清转入另一加入200ul苯酚和200ul24:1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合使双链DNA沉淀，室温下放置2min，在于12000g离心3min。小心吸取上清液于另一离心管中。用800ul纯乙醇洗涤双链DNA，摇匀，在冰箱冷冻区静置两小时，12000g离心5min，除去上清，贴壁缓慢加入70%冰预冷的乙醇，函Og离心5min，尽量除去上清放置于37'C烘箱烘干，用25ul无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取5ul做iy。琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-2(TC。载体pET32a质粒DNA制备同上。1.2.2目的基因Kringle5的PCR:(1)试剂引物序列上游引物5，GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3，Ncol25bp下游引物3，GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，EcoRI28bpTaq-DNApolyase是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有依赖于聚合作用的5，+3，外切核酸酶活性。最佳作用温度为75。C--80°C，需要在低于最适温度的条件下起始聚合反应，以免引物从模板上解离。Taq-DNApolyase作用时需要M^.由于引物模板杂交体的解链和退火温度受二价阳离子的影响，需考虑扩增反应的最佳Mg2+浓度。磷酸盐缓冲液抑制Taq-DNApolyase活性，扩增反应通常在Tris缓冲液中进行，该缓冲液在室温下pH为8.3。(2)操作200ul离心管中加入lOXBuffer5ul，dNTP4ul,引物P12ul，P22ul，模板质粒2ul，Taq-DNApolyase0.5ul，无菌水34.5ul，使反应体系总体积为50ul，最后用少量液体石蜡密封，在PCR仪上进行反应。PCR参数为:95°C300s55°C120s72°C180s3130次循95°C30s55。C30s72°C60s，V95°C60s55°C120s72°C420s4°Cw取5ulPCR反应产物和lulmarker进行2。/。琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物大小。1.2.3PCR产物的抽提纯化(1)试剂TE(Ph=8.0):lOmmol/LTris-Hcl(PH二8.0)+lmmol/LEDTA(PH=8.0)(2)操作将PCR产物转移至1.5ml离心管，加入TE(PH8.0)补足140ul。加入苯酚和24:1的氯仿/异戊醇溶液各70ul，振摇。于15000g离心10min。取上清并向其中加入24:1的氯仿/异戊醇溶液140ul，振摇。于15000g离心10min。取上清并向其中加入14ul3MNaAc及420ul(3倍体积)无水乙醇。在-70°C冰箱中静置2小时。取出后于15000g离心15min。加入lml70%乙醇洗涤，于15000g离心15min。放入烘箱干燥。取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.4双酶切PCR产物以及载体质粒DNA:(1)试剂NcoI酶切位点5，..CTCATGG..3，3，..GGTACAC..5，热失活性65。C，20minEcoRI酶切位点5，..G'AATTC..3，3，..CTTAAAG..3，热失活性65。C，20min32向离心管中加入lOXBuffer2ul,0.1%BSA2ul，PCR产物14ul,NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul，总反应体积为20ul。向离心管中加入lOXBuffer2ul，0.1%BSA2ul，载体质粒DNA12ul，NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul,无菌水2ul，总反应体积为20ul。将上述两离心管于36°C土水浴过夜，将酶切产物全部进行2%琼脂糖凝胶电泳。1.2.5DNA凝胶回收(1)试剂DNA凝胶回收试剂盒包括DE-A:凝胶融化剂(含DNA保护剂)DE-B:高离液序列溶液(使大于lOObp的DNA片段选择性的结合到DNA制备膜上)Wl:洗涤液W2:洗涤液洗脱液2.5mMTris-Hcl，Ph二8.5(2)操作首先紫外灯下切下含有目的DNA的凝胶，用纸巾吸干并切碎，肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA凝胶重O.08g，载体DNA凝胶重O.llg,分别作为一个凝胶体积.分别向其中加入5个凝胶体积的DE-A溶液，混和均匀后于75t加热，间断混合，直至凝胶完全融化.加入0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混合均匀，由于肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA分子量为300bp，向其中再加入异丙醇至终浓度为20%.分别吸取上述混合物，转移到DNA制备管中，放置于2ml离心管中，于3600rpm离心lmin,如有残留，提速再离心lmin，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5mlWl溶液,3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。重复一次将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，最高速离心lmin。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ul洗脱液，室温静置1min。最高速离心lmin洗脱DNA。分别得到目的基因Kringle5的双酶切片段和载体pET32a的双酶切片段。1.2.6制备重组载体pET32/kringle5(1)试剂T41igase可催化双链DNA或RNA中的5，-磷酸和3，-羟基间形成磷酸二酯键，可连接两个平末端，可修复dsDNA，dsRNA，RNA/DNA的缺亥lJ。热失活性65。C，lOmin.(2)操作10XBufferlul，Kringle5的双酶切片段4ul，载体pET32a的双酶切片段2ul，T4ligaselul，H202ul.总反应体积为10ul.16。C恒温过夜酶连。1.2.7感受态细胞的制备(1)试剂0.3mol/LCacL溶液0.1mol/LCaCl厂甘油溶液25%甘油+0.1MCaCl2(2)操作从37。C培养16-20小时的BL21新鲜平板上挑取一个直径2-3咖的单菌落，转移到一个含有50ml培养基的1升烧瓶中，37°C300转/min振荡3小时。在超净台中，将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，继续在冰上放置10分钟。于4°C4000rpm离心10min回收细胞，倒去培养液，将管倒置1分钟使残留培养液流尽。用10ml用冰预冷的O.1mol/LCacl2重悬沉淀，放置于冰上，于4。C4000rpm离心10min，倒出培养液，倒置1min，使残留培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2-甘油重悬每份细胞沉淀，将此溶液分成200ul/每管。若做转化，直接使用，若保存，则每管中加入7ulDMS0(二甲基亚砜)，冰上放置15min，加7ulDMSO，直接放置于-7(TC冰箱中，或直接加水于-7(TC保存。1.2.8感受态细胞的转化从-7(TC冰箱中取出一管200ul的感受态细胞BL21，手中握化放置到冰上。每管中加入2ml重组载体pET32/kringle5，轻轻旋转，在冰上放置30mim。将管放到42t水浴中慢慢振摇90s,快速转至冰浴中冷却2min。另取5ml小试管，每管加500ul未加抗生素的LB培养基，用水浴加温至37°C。将上面已经转化的感受态细胞BL21加入其中，放置于37'C摇床上220rpm以下温浴45分钟，使转化了的BL21复苏并且表达重组载体pET32/kringle5氨卞抗性标记基因。将上述lml温浴的培养液5000rpm离心5分钟，吸去上面的500ul，下面的200ul用于铺板，在超净工作台上，将此200ul已转化的感受态细胞转移到事先放于37。C烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB琼脂培养基上，平板倒置于37。C下培养14小时左右可出现菌落。1.2.9小型发酵及重组蛋白的诱导表达(1)试剂诱导剂IPTG，0.lMTris-HCl(PH8.0)，lmg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制备分离胶现配成5ml其中H201.434ml，3(m丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，10%SDS0.05ml，10%(NH4)2S2080.05ml，TEMED(凝固剂)O.002ml.浓縮胶现配成2ml其中H201.434ml，3(F。丙烯酰胺0.33ml，1.Omol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10%SDS0.02ml，10%(NH4)2S2080.02ml，TEMED(凝固剂)O.002ml.(2)操作挑取上述转化后的培养出的单菌落至含有7ml培养液的试管中，37°C300rpm振荡过夜。吸取200ul培养物以1:30接种于含lOOug/ml氨卞的LB培养基中，37°C300rpm振荡3小时，加入诱导剂IPTG,使其终浓度为lmmol/ml，再于37°C300rpm振荡3小时。取1.5ml诱导菌，离心收集菌体，用200ul0.1MTris-HCl(PH8.O)重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液。加入lOOul0.1MTris-HC1(PH8.0)重悬菌体，再加入50ullmg/ml溶菌酶，于-7(TC冰箱放置半小时，37"C水浴5分钟，再放入-7(TC冰箱5分钟，反复冻融五次后，于12000rpm离心10分钟，收集上清(为细胞质部分)，沉淀为包涵体分，上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDS-PAGE，染色，脱色，成像。凝胶电泳鉴定挑取转化后的BL21单菌落于2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基中，按照1.2.1提取质粒，按照1.2.4进行双酶切后,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果获得ThioA/L15/7和E.coliPET32a(载体)质粒DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下分别观察到三条亮带。图2为载体目的基因Kringle5的PCR后，取5ulPCR反应产物和lulmarker进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察到PCR反应产物的亮带与marker的第四条带平齐，约为300bp，与资料数据相符。PCR产物的抽提纯化后，取5111进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。在紫外灯下观察到一条亮带，与marker的第四条带平齐，为目的提纯产物。见图2双酶切后将酶切产物全部进行2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下观察，载体双酶切后为一条很亮的约为5000bp的条带；目的基因双酶切后为一条约为300bp的亮带。图2DNA凝胶回收，分别得到目的基因Kringle5的双酶切片段和载体pET32a的双酶切片段.酶连后得到重组载体pET32/kringle5。制备感受态细胞后进行转化，37'C下培养过夜。共涂四个平板，平均长出菌落6-8个，挑取8个单菌落进行培养。选取3管培养物进行小型发酵。诱导表达后，收集破碎菌体，上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDS-PAGE,染色，脱色，成像。可清晰看出沉淀中有一条蛋白带，与marker的第四条带平齐，与资料中Kringle5蛋白数据相符，确认为Kringle5蛋白。而在上清中和未加诱导的对照中则没有该带，从而确认Kringle5蛋白以包涵体形式存在。图3血管抑素及其各个Kringle已经在多种系统中表达成功，陶亦敏等将Kringle5基因扩增后与载体pPIC9K相连，转化毕赤酵母GS115得到稳定表达的工程菌。Cao等人利用PRC/CMV质粒为载体，在小鼠T241成纤维肉瘤细胞中表达了重组小鼠血管抑素。张菊等将K1-4基因插入BactoBac杆状病毒表达系统，转染昆虫细胞sf9，表达血管抑素。吴景文等构建血管抑素Kl-3的真核表达载体pcDNA-SAK(1-3)，将其转染入SHG44人脑胶质瘤细胞表达。而利用大肠杆菌表达的例子很多，原因在于大肠杆菌具有繁殖快，营养要求低，操作简单等特点，对于勿需糖基化，磷酸化等修饰即呈现生物活性的蛋白来说，是首选表达系统。真核基因与原核基因融合，使转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌核苷酸控制，有利于真核基因的表达和产物的稳定。载体选择必须要求载体可在受体细胞内具有DNA独立复制的能力；分子量尽可能小，易于纯化；包含有多种限制性内切酶的单一切点，在切点内可与外源DNA重组；载体内有不影响其复制，生长的非必要区域；具有多种选择性标记。天然载体需要经过一系列的改造才能达到作为克隆载体的要求。PET32a是一原核融合型高效表达载体，有5900bp，表达效率很高。同时在酶切时使用双酶切可以避免单酶切产生的DNA扭转，是翻译不能正常进行，从而保证了表达的准确性。重组产物形成包涵体，易于纯化。下一步将对表达产物进行复性，纯化和血管生成抑制活性测定。在本次实验所选的方法中，如下实验要点直接影响实验的结果在质粒提取时RNA消化完全很重要，它直接影响到双酶切的效果；在加入纯乙醇后静置时间应尽可能长，使质粒完全沉淀。在加入70%乙醇时应贴壁缓慢加入，否则会使质粒随乙醇倒掉而流失。DNA凝胶回收时应勿将其长时间暴露在紫外灯下，为提高效率洗脱液可加热至60°C。在双酶切时由于NcoI和EcoRI所需条件不同，而NcoI更依赖于反应条件，所以选择NcoI所需条件。感受态细胞的制备关键在于低温操作，以保证感受态细胞的生物学活性。同时各种酶的催化活性均有最适温度，要严格控制温度。在培养细胞时，应在对数期收获，以获得最高活性和细胞量。Angiostatin作用的靶细胞是内皮细胞，它不具有细胞那种高度不稳定性，因此不易对Angiostatin产生抗药性。内皮细胞寿命很长，而且肿瘤血管内皮细胞增殖速度较正常组织内皮细胞增殖速度高50倍。因此对于肿瘤患者来说，在一定时间内使用Angiostatin，并不会对正常组织内的血管造成明显影响。Angiostatin为战胜肿瘤带来了希望，虽仍然需要通过临床实验进一步证实检验，但是可以预见Angiostatin与现有的化疗方法联合应用，会在肿瘤治疗方面取得重大突破。一种血管生长抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鉴定和表达方法，Kringle5是目前发现的抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的活性最强的纤溶酶原片段，特异性高而毒副作用小。在肿瘤的治疗方面具潜在的巨大价值和广阔的应用前景。本实验根据已发表的K5基因的序列图谱设计PCR引物，通过TD-PCR从已有的克隆载体扩增出人纤维蛋白溶酶原的K5部分基因，在Afco/和历/^///两酶切位点分别对K5和pET28a(+)基因序列双酶切，再将二者相连，成功构建pET28a(+)-K5基因的非融合表达载体。为K5基因在大肠杆菌中的非融合表达的研究奠定了基础。试剂及生产厂家如下-限制性内切酶、T4DNA连接酶、高保真Taq酶均购自大连宝生物技术工程有限公司，Taq酶购自MBI;DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。试验所用的菌株及质粒(1)大肠杆菌BL21(DE3)由本实验室保存(2)质粒pET28a(+)由本实验室保存主要仪器及生产厂家如下J-25型高速冷冻离心机Backman公司(美国)GTL-16A台式离心机南京新校园技术研究所(中国)PB2002-E型电子天平Metier公司(德国)TY-90S型脱色摇床南京大学(中国)PTC-150型PCR扩增仪MJ公司(美国)垂直平板电泳槽及电泳仪北京六一仪器厂2.2.1LB培养基胰蛋白冻10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，加水至1000ml。121.3。C灭菌20分钟。琼脂培养基胰蛋白冻10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g，加水至1000ml。121.3'C灭菌20分钟。1、K5基因上、下游引物的设计与合成根据已报道的K5基因全序列设计其编码区的上下游引物，引物中设计酶切位点以及保护碱基。上游引物为5，CATGCCATGGCAGCTCCCGGATGTAG3，下划线部分为y^o/酶切位点下游引物为5，CCCMGCTTTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，下划线部分为ffi/rfffl酶切位点引物为上海生物工程有限公司合成。2、K5基因的TD-PCR扩增TD-PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage40</image>_4。C保存_3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳3.1制胶称取0.40g的琼脂糖，置专用三角瓶，加入50ml的蒸馏水，加热至沸腾；待冷却后，加入少许溴化乙锭贮存液，混匀后倒入事先插好梳子的电泳槽中，待其冷却凝固后加入适量的电泳缓冲液，小心取出梳子。(加样孔的一端靠近阴极。)小心操作，千万不要让溴化乙锭接触自己或污染环境。3.2上样用微量移液枪吸取10x的loadingbuffer3W，置于标签纸背面，再吸取PCR产物6W，混匀之后加入到加样孔中。在旁边的加样孔中加入DNAMarker做对照。注意枪头不要戳破凝胶。3.3电泳接通电泳池的电源调节电压至100v，待样品完全进入凝胶中调节电压为80v进行电泳。根据电泳检测的需要，待溴酚蓝指示剂泳至适当位置后调小并切断电变性退火延伸14cycles72。C7min延伸源。3.4分析:在凝胶成像仪下观察。4、pET28a+质粒DNA的小量制备4.1试剂溶液I:每瓶(100ml)含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-HCL(PH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)，6.895X104Pa灭菌15分钟后存储于4。C。溶液II:0.2mmol/LNa0H,1%SDS.(现用现配)。溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，6.895X104Pa灭菌20分钟后存储于4°C。(以上试剂均为国产分析纯)4.2操作在无菌操作台中将3ml含有lOOPg/mlAmp的LB培养基加入到容量为15ml的试管中，接入pET28a+菌液30W，于37"C激烈振荡培养过夜。吸取1.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余培养物贮存于4"C。在含有沉淀的试管中加入的溶液I(预冷)，剧烈振荡使沉淀完全分散；再加入200W新配制的溶液n,盖紧管口，快速颠倒5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；再加入i5ow预冷的溶液ni，盖紧管口，温和振荡IO秒使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后置于冰上5分钟加入Rnase于60。C水浴20分钟，12000g离心5分钟，将上清转入另一加有200W苯酚和2001Ltl24:1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合是双链DNA沉淀，室温下放置2分钟，在12000g离心3分钟。小心吸取上清液于另一离心管中。用800W纯乙醇洗涤双链DNA，70%的冰预冷的乙醇，12000g离心5min，尽量除去上清放置于37t:烘箱烘干，用无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取做1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-2(TC。5、双酶切PCR产物和载体质粒DNA反应体系200810150873VolumeNocI114HindIII11410XMBufferDNA或PCR产物舰无菌水upto2014酶切温度为37t:，时间为3.5h。6、DNA片断的琼脂糖凝胶检测以及胶回收。6.l试剂(DNA凝胶回收试剂盒)BufferDE-A:凝胶融化剂(含DNA保护剂)BufferDE-B:DNA结合溶液BufferWl:洗涤液BufferW2:脱盐液(使用前按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇)Eluent:2.5mMTris-HCl，pH8.5，DNA洗脱溶液6.2操作(1)首先在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用至今锡金凝胶表面液体。尽量减小凝胶体积，大体积的凝胶块需切成小块，以縮短步骤4中凝胶融化的时间。(2)称量凝胶重量，以lmg^ia换算凝胶体积。根据凝胶浓度，按表所提供的参数加BufferDE-A:凝胶浓度BufferDE—A体积3个凝胶体积本实验需要回收的是双酶切pET28a+和K5片段，使用的胶都是0.8%，所以加人3个凝胶体积的BufferDE—A。(3)悬浮均匀后于75""C加热，每隔2—3分钟混合一次，直至凝胶块完全融化(约6—8分钟)。(4)按BufferDE~~A体积的50%加入BufferDE—B混合均匀。当回收的DNA片段小于500bp时，添加异丙醇，使异丙醇的终浓度为20%。(5)将DNA-pr印Tube置于2mlMicrofugeTube中，将步骤5中的混合液移入DNA-pr印Tube中，5500rpm离心1分钟。(6)弃滤液，将DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入500ul已加无水乙醇的BufferWl，5500rpm离心1分钟(7)弃滤液，将DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入700ul已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1分钟，以同样的方法再用700ulBufferW2洗涤一次。(8)将DNA-pr印Tube置于1.5ml离心管中，12000Xg离心1分钟。(9)将DNA-pr印Tube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25—30ulEluent或去离子水，室温静置1分钟。12000Xg离心1分钟洗脱DNA。7、重组载体pET28a+/K5的制备反应体系入下表Volume回收的pET28a+质粒10W回收K5片段51410XT4DNALigaseBuffer21410XT4DNALigase1.5W无菌水to251^1叩16-C保温过夜，一2(TC保存备用。8、感受态细胞的制备8.1试剂(1)CaClv溶液(冰冷)0.lmol/LCaCl2溶液，使用一次性滤器过滤除菌后，_4匸冰箱存储备用。(2)0.lmol/LCaCir^油溶液25%的甘油+0.lMCaCL2。使用一次性滤器过滤除菌后，-4。C冰箱保存备用8.2操作(1)无菌条件下接种大肠杆菌BL21菌株单菌落入5mlLB液体培养基中，37°C培养过夜。第二天，倒入250ml的LB液体培养基中，37"C振荡3.5h-4.0h(600=0.40.6)，停止培养。(2)将培养液分装到8个25ml预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置5-10分钟，然后4。C，8000rmp离心8min。(3)细胞沉淀用10ml冰冷的CaC12溶液重悬，4°C6000rmp离心5分钟。(4))弃上清后，加入10ml冰冷的CaC12溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4°C，6000rmp离心5分钟。(5)弃上清后，加入2ml冰冷的CaC12溶液重悬细胞，按每管200ul量分装于预冷的0.5ml离心管中，立即冻存于-75X:冰柜中备用。9、重组质粒的转化以及保存(1)将10uL连接产物加到200uL感受态细胞悬液中，混匀，冰浴30-40分钟，42'C水浴保温90秒，立即置冰上l-2分钟，然后转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行对照培养。(2)将转化成功的大肠杆菌，挑取单菌落于液体培养基，进行纯化扩增培养，37t:剧烈振摇过夜。吸取过夜摇床培养的培养物500ul加入1.5ml的离心管中，再加40%的甘油500ul混合均匀后于-20或-70'C保藏，定期进行活化重保藏，以防菌种退化或质粒丢失。10、重组质粒的提取方法于3.4的方法一样。11、重组质粒的PCR检测所用程序和反应体系与3.2中所用一致，然后进行琼脂糖凝胶电泳的检测观察。结果分析1目的片段的TD-PCR扩增我们从已有的克隆载体中通过TD-PCR扩增出目的片段的全基因，包含有保护碱基和酶切位点。图6是PCR产物通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳在紫外凝胶成像仪下的照片。从图7上可得知1号泳道的样品含有较多的目的片断DNA，是比较理想的，可以用来作为酶切的底物，3号泳道目的片断比较少，不适合作为酶切底物。2重组质粒转化的结果重组质粒转化感受态细胞后在加有抗生素氨苄的培养基中培养，并且用未转化的感受态细胞和空白做对照。结果显示在对照中没有菌落的生长，而在做过转化的培养基中能够长出菌落。表达载体pET28a+中含抗氨苄的选择标记基因，而原始的BL21菌种不含有这种选择标记基因，能够在加有抗生素氨苄的培养基中长出菌落表明转化是成功的。3抽提重组质粒进行目的片断的PCR检测将转化成功的大肠杆菌进行纯化扩增培养，抽提质粒后进行PCR扩增鉴定。琼脂糖凝胶电泳图谱如图6从图6上可见目的片断扩增效果比较好，条带单一且明亮。这初步证明了重组载体的构建是成功的。结果需要进行蛋白质电泳以及DNA测序的进一步鉴定.TD-PCR在本次试验中的运用是成功的。TD-PCf^代表了一种完全不同的PCR优化方法。它不是用很多的反应管和每管用不同的试剂浓度和循环参数，而是用一个反应管或者用以小组反应管在适合于扩增目的产物而不得到人为产物或者引物二聚体的循环条件下反应。设计多循环的程序以使相连循环的退火温度越来越低。这个策略有利于第一个引物一模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间，是一种潜在的一步法找到最佳扩增条件的方法。在本次试验中所用的PCR都是TD-PCR，效果是比较好的，对本次试验的顺利完成起了很重要的作用。4权利要求1、一种血管生长抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鉴定和表达方法，其特征在于包含以下步骤1]、ThioA/L15/7和E.coliPET32(载体)质粒DNA的制备(1)质粒提取试剂溶液I每瓶约100毫升，含50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL(PH8.0)，10mmol/LEDTA(PH8.0，)在6.895*104Pa灭菌15min，储存于4℃；溶液II0.2mol/LNaOH(临用前贮存液现用现配)i％SDS；溶液III配成100ml含5mol/Lkac60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml；溶液I，溶液III于150kg/cm2，灭菌20分钟；以上试剂均为国产分析纯；(2)操作在超净工作台中将2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基加入到容量为15ml试管中，接入ThioA/L15/7单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜，吸取1.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余贮存于4℃。含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基在上述沉淀中加入100ul用冰预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全分散；在加入200ul新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；在加入150ul用冰预冷的溶液III，盖紧管口，温和振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后置于冰上5min，加入RNAase3ul，于60℃水浴20min，12000g离心5min，将上清转入另一加入200ul苯酚和200ul24∶1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合使双链DNA沉淀，室温下放置2min，在于12000g离心3min，吸取上清液于另一离心管中，用800ul纯乙醇洗涤双链DNA，摇匀，在冰箱冷冻区静置两小时，12000g离心5min，除去上清，贴壁缓慢加入70％冰预冷的乙醇，12000g离心5min，尽量除去上清放置于37℃烘箱烘干，用25ul无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取5ul做1％琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-20℃；载体pET32a质粒DNA制备同上；2]、目的基因Kringle5的PCR(1)试剂引物序列上游引物5’GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3’NcoI25bp下游引物3’GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3’EcoRI28bpTaq-DNApolyase是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有依赖于聚合作用的5’→3’外切核酸酶活性，最佳作用温度为75℃--80℃，需要在低于最适温度的条件下起始聚合反应，以免引物从模板上解离，Taq-DNApolyase作用时需要Mg2+.由于引物模板杂交体的解链和退火温度受二价阳离子的影响，需考虑扩增反应的最佳Mg2+浓度。磷酸盐缓冲液抑制Taq-DNApolyase活性，扩增反应通常在Tris缓冲液中进行，该缓冲液在室温下pH为8.3；(2)操作200ul离心管中加入10×Buffer5ul，dNTP4ul，引物P12ul，P22ul，模板质粒2ul，Taq-DNApolyase0.5ul，无菌水34.5ul，使反应体系总体积为50ul，最后用少量液体石蜡密封，在PCR仪上进行反应；取5ulPCR反应产物和1ulmarker进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定产物大小。3]、PCR产物的抽提纯化(1)试剂TE(Ph＝8.0)10mmol/LTris-Hcl(PH＝8.0)+1mmol/LEDTA(PH＝8.0)(2)操作将PCR产物转移至1.5ml离心管，加入TE(PH8.0)补足140ul，加入苯酚和24∶1的氯仿/异戊醇溶液各70ul，振摇，于15000g离心10min，取上清并向其中加入24∶1的氯仿/异戊醇溶液140ul，振摇，于15000g离心10min，取上清并向其中加入14ul3MNaAc及420ul(3倍体积)无水乙醇，在-70℃冰箱中静置2小时，取出后于15000g离心15min。加入1ml70％乙醇洗涤，于15000g离心15min，放入烘箱干燥，取5ul进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。4]、双酶切PCR产物以及载体质粒DNA(1)试剂NcoI酶切位点5’..id="icf0002"file="A2008101508730004C1.tif"wi="7"he="4"top="139"left="81"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>ATGG..3’3’..GGTAC▲C..5’热失活性65℃，20minEcoRI酶切位点5’..id="icf0003"file="A2008101508730004C2.tif"wi="7"he="4"top="156"left="83"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>ATTC..3’3’..CTTAA▲G..3’热失活性65℃，20min(2)操作向离心管中加入10×Buffer2ul，0.1％BSA2ul，PCR产物14ul，NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul，总反应体积为20ul，向离心管中加入10×Buffer2ul，0.1％BSA2ul，载体质粒DNA12ul，NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul，无菌水2ul，总反应体积为20ul，将上述两离心管于36℃±水浴过夜，将酶切产物全部进行2％琼脂糖凝胶电泳；5]、DNA凝胶回收(1)试剂DNA凝胶回收试剂盒包括DE-A凝胶融化剂(含DNA保护剂)DE-B高离液序列溶液(使大于100bp的DNA片段选择性的结合到DNA制备膜上)W1洗涤液W2洗涤液洗脱液2.5mMTris-Hcl，Ph＝8.5(2)操作首先紫外灯下切下含有目的DNA的凝胶，用纸巾吸干并切碎，肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA凝胶重0.08g，载体DNA凝胶重0.11g，分别作为一个凝胶体积.分别向其中加入5个凝胶体积的DE-A溶液，混和均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全融化.加入0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混合均匀，由于肿瘤血管生长抑制因子K(5)DNA分子量为300bp，向其中再加入异丙醇至终浓度为20％.分别吸取上述混合物，转移到DNA制备管中，放置于2ml离心管中，于3600rpm离心1min，如有残留，提速再离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。重复一次将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，最高速离心1min。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ul洗脱液，室温静置1min。最高速离心1min洗脱DNA，分别得到目的基因Kringle5的双酶切片段和载体pET32a的双酶切片段；6]、制备重组载体pET32/kringle5(1)试剂T4ligase可催化双链DNA或RNA中的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键，可连接两个平末端，可修复dsDNA，dsRNA，RNA/DNA的缺刻。热失活性65℃，10min，(2)操作10×Buffer1ul，Kringle5的双酶切片段4ul，载体pET32a的双酶切片段2ul，T4ligase1ul，H2O2ul.总反应体积为10ul.16℃恒温过夜酶连；7]、感受态细胞的制备(1)试剂0.1mol/LCacl2溶液0.1mol/LCaCl2-甘油溶液25％甘油+0.1MCaCl2(2)操作从37℃培养16-20小时的BL21新鲜平板上挑取一个直径2-3mm的单菌落，转移到一个含有50ml培养基的1升烧瓶中，37℃300转/min振荡3小时，在超净台中，将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，继续在冰上放置10分钟。于4℃4000rpm离心10min回收细胞，倒去培养液，将管倒置1分钟使残留培养液流尽，用10ml用冰预冷的0.1mol/LCacl2重悬沉淀，放置于冰上，于4℃4000rpm离心10min，倒出培养液，倒置1min，使残留培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2-甘油重悬每份细胞沉淀，将此溶液分成200ul/每管，若做转化，直接使用，若保存，则每管中加入7ulDMSO(二甲基亚砜)，冰上放置15min，加7ulDMSO，直接放置于-70℃冰箱中，或直接加水于-70℃保存；8]、感受态细胞的转化从-70℃冰箱中取出一管200ul的感受态细胞BL21，手中握化放置到冰上，每管中加入2ml重组载体pET32/kringle5，轻轻旋转，在冰上放置30mim，将管放到42℃水浴中慢慢振摇90s，快速转至冰浴中冷却2min，另取5ml小试管，每管加500ul未加抗生素的LB培养基，用水浴加温至37℃，将上面已经转化的感受态细胞BL21加入其中，放置于37℃摇床上220rpm以下温浴45分钟，使转化了的BL21复苏并且表达重组载体pET32/kringle5氨卞抗性标记基因，将上述1ml温浴的培养液5000rpm离心5分钟，吸去上面的500ul，下面的200ul用于铺板，在超净工作台上，将此200ul已转化的感受态细胞转移到事先放于37℃烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB琼脂培养基上，平板倒置于37℃下培养14小时左右可出现菌落；9]、小型发酵及重组蛋白的诱导表达(1)试剂诱导剂IPTG，0.1MTris-HCl(PH8.0)，1mg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制备分离胶现配成5ml其中H2O1.434ml，30％丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，10％SDS0.05ml，10％(NH4)2S2O80.05ml，TEMED(凝固剂)0.002ml.浓缩胶现配成2ml其中H2O1.434ml，30％丙烯酰胺0.33ml，1.0mol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10％SDS0.02ml，10％(NH4)2S2O80.02ml，TEMED(凝固剂)0.002ml.(2)操作挑取上述转化后的培养出的单菌落至含有7ml培养液的试管中，37℃300rpm振荡过夜，吸取200ul培养物以1∶30接种于含100ug/ml氨卞的LB培养基中，37℃300rpm振荡3小时，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1mmol/ml，再于37℃300rpm振荡3小时，取1.5ml诱导菌，离心收集菌体，用200ul0.1MTris-HCl(PH8.0)重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入100ul0.1MTris-HCl(PH8.0)重悬菌体，再加入50ul1mg/ml溶菌酶，于-70℃冰箱放置半小时，37℃水浴5分钟，再放入-70℃冰箱5分钟，反复冻融五次后，于12000rpm离心10分钟，收集上清(为细胞质部分)，沉淀为包涵体部分，上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDS-PAGE，染色，脱色，成像；10]、培养并提取质粒，双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定挑取转化后的BL21单菌落于2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培养基中，按照1.2.1提取质粒，按照1.2.4进行双酶切后，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。2、一种血管生长抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鉴定和表达方法，其特征在于包含以下步骤l]、根据K5基因全序列设计其编码区的上下游引物，引物中设计酶切位点以及保护碱基，上游引物为5，CATGCCATGGCAGCTCCCGGATGTAG3，下划线部分为lo/酶切位点，下游引物为5，CCCMGCTTTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，下划线部分为历/7rfffl酶切位点，引物为上海生物工程有限公司合成。2]、K5基因的TD-PCR扩增TD-PCR反应体系Volume10XBufferdNTP(lOmM)MgCl2引物模板(c丽)Taq酶无菌水54各2<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3]、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳(1)制胶称取0.40g的琼脂糖，置专用三角瓶，加入50ml的蒸馏水，加热至沸腾；待冷却后，加入少许溴化乙锭贮存液，混匀后倒入事先插好梳子的电泳槽中，待其冷却凝固后加入适量的电泳缓冲液，小心取出梳子。(加样孔的一端靠近阴极。)小心操作，千万不要让溴化乙锭接触自己或污染环境。(2)上样用微量移液枪吸取10x的loadingbuffer3W，置于标签纸背面，再吸取PCR产物6W,混匀之后加入到加样孔中。在旁边的加样孔中加入DNAMarker做对照。注意枪头不要戳破凝胶。(3)电泳接通电泳池的电源调节电压至100v，待样品完全进入凝胶中调节电压为80v进行电泳。根据电泳检测的需要，待溴酚蓝指示剂泳至适当位置后调小并切断电源。(4)分析:在凝胶成像仪下观察。4]、pET28a+质粒DNA的小量制备(1)试剂溶液I:每瓶(100ml)含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-HCL(PH8.0)10咖ol/LEDTA(pH8.0)，6.895X104Pa灭菌15分钟后存储于4°C，溶液II:0.2mmol/LNaOH,1%SDS.(现用现配)，溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，6.895X104Pa灭菌20分钟后存储于4°C。以上试剂均为国产分析纯(2)操作在无菌操作台中将3ml含有100Pg/mlAmp的LB培养基加入到容量为15ml的试管中，接入pET28a+菌液3(H4，于37"C激烈振荡培养过夜。吸取1.5ml培养物于微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，剩余培养物贮存于4"C，在含有沉淀的试管中加入的溶液I(预冷)，剧烈振荡使沉淀完全分散；再加入200W新配制的溶液n，盖紧管口，快速颠倒5次，以混匀内容物，将离心管置于冰上；再加入150J4预冷的溶液III，盖紧管口，温和振荡io秒使溶液m在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后置于冰上5分钟加入Rnase3W于60。C水浴20分钟，12000g离心5分钟，将上清转入另一加有200)4苯酚和200W24:1的氯仿/异戊醇溶液的离心管中，振荡混合是双链DNA沉淀，室温下放置2分钟，在12000g离心3分钟。小心吸取上清液于另一离心管中，用800)4纯乙醇洗涤双链DNA，70%的冰预冷的乙醇，12000g离心5min，尽量除去上清放置于37X:烘箱烘干，用无菌水重新溶解核酸，振荡摇匀，取5^做1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余储存于-20°C;5]、双酶切PCR产物和载体质粒DNA反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>6]、DNA片断的琼脂糖凝胶检测以及胶回收。(1)试剂(DNA凝胶回收试剂盒)BufferDE-A:凝胶融化剂(含DNA保护剂)BufferDE-B:DNA结合溶液BufferWl:洗涤液BufferW2:脱盐液(使用前按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇)Eluent:2.5mMTris-HCl，pH8.5，DNA洗脱溶液(2)操作(2.1)首先在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用至今锡金凝胶表面液体。尽量减小凝胶体积，大体积的凝胶块需切成小块，以縮短步骤4中凝胶融化的时间。(2.2)称量凝胶重量，以lmg^ul换算凝胶体积。根据凝胶浓度，按表所提供的参数加BufferDE-A:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本实验需要回收的是双酶切pET28a+和K5片段，使用的胶都是0.8%，所以加人3个凝胶体积的BufferDE—A。(2.3)悬浮均匀后于75。C加热，每隔2—3分钟混合一次，直至凝胶块完全融化(约6—8分钟)。(2.4)按BufferDE—A体积的50%加入BufferDE—B混合均匀。当回收的DNA片段小于500bp时，添加异丙醇，使异丙醇的终浓度为20%。(2.5)将DNA-pr印Tube置于2mlMicrofugeTube中，将步骤5中的混合液移入DNA-pr印Tube中，5500rpm离心1分钟。(2.6)弃滤液，将DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入500ul已加无水乙醇的BufferWl，5500rpm离心1分钟(2.7)弃滤液，将DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入700ul已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1分钟，以同样的方法再用700ulBufferW2洗涤一次。(2.8)将DNA-pr印Tube置于1.5ml离心管中，12000Xg离心1分钟。(2.9)将DNA-pr印Tube置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25—30ulEl腦t或去离子水，室温静置1分钟。12000Xg离心1分钟洗脱DNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>16i:保温过夜，一2(TC保存备用，8]、感受态细胞的制备(1)试剂(1.1)CaCl2溶液(冰冷)`0.lmol/LCaCl2溶液，使用一次性滤器过滤除菌后，-41:冰箱存储备用，(1.2)0.lmol/ECaCl2甘油溶液25%的甘油+0.1MCaCL2。使用一次性滤器过滤除菌后，-4"冰箱保存备用(2)操作(2.1)无菌条件下接种大肠杆菌BL21菌株单菌落入5mlLB液体培养基中，37。C培养过夜。第二天，倒入250ml的LB液体培养基中，37。C振荡`3.5h-4.0h(600=0.4~0.6)，停止培养，(2.2)将培养液分装到8个25ml预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上置5-10分钟，然后4。C，8000rmp离心8min，(2.3)细胞沉淀用10ml冰冷的CaC12溶液重悬，4°C6000rmp离心5分钟，(2.4))弃上清后，加入10ml冰冷的CaC12溶液重悬细胞，冰浴半小时后，4°C，6000rmp离心5分钟，(2.5)弃上清后，加入2ml冰冷的CaC12溶液重悬细胞，按每管200ul量分装于预冷的0.5ml离心管中，立即冻存于-75。C冰柜中备用，9]、重组质粒的转化以及保存(1)将10uL连接产物加到200uL感受态细胞悬液中，混匀，冰浴30-40分钟，42X:水浴保温90秒，立即置冰上l-2分钟，然后转移到加有抗生素氨苄的培养基上进行对照培养，(2)将转化成功的大肠杆菌，挑取单菌落于液体培养基，进行纯化扩增培养，37"C剧烈振摇过夜。吸取过夜摇床培养的培养物500ul加入1.5ml的离心管中，再加40%的甘油500ul混合均匀后于-20或-7(TC保藏，定期进行活化重保藏，以防菌种退化或质粒丢失。10]、重组质粒的提取方法同前，11]、重组质粒的PCR检测所用程序和反应体系与3.2中所用一致，然后进行琼脂糖凝胶电泳的检测观察。全文摘要本发明涉及一种血管生长抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鉴定和表达方法。包括以下步骤1.ThioA/L15/7和E.coliPET32(载体)质粒DNA的制备；2.目的基因Kringle5的PCR；3.PCR产物的抽提纯化；4.双酶切PCR产物以及载体质粒DNA；5.DNA凝胶回收；6.制备重组载体pET32/kringle5；7.感受态细胞的制备；8.感受态细胞的转化；9.小型发酵及重组蛋白的诱导表达；10.培养并提取质粒，双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。成功构建pET28a(+)-K5基因的非融合表达载体。为K5基因在大肠杆菌中的非融合表达的研究奠定了基础。文档编号C07K14/47GK101671675SQ20081015087公开日2010年3月17日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者萱冯,杨晓燕,边六交,超陈申请人:陕西北美基因股份有限公司