专利名称：血管内皮生长因子b(vegf－b)缺陷动物的心脏异常及与这些心脏异常相关的方法
技术领域：
本发明涉及VEGF-B缺陷动物及其心脏异常。本发明提供了用VEGF-B缺陷动物筛选减轻心脏异常，及诊断心脏疾病，尤其特征在于VEGF-B表达丧失的疾病的方法。
哺乳动物脉管系统的两种主要组成成分是内皮细胞和平滑肌细胞。内皮细胞形成哺乳动物所有血管和淋巴管的内表面。新血管的形成可通过两种不同过程发生，血管发生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)(参见Risau，W.，自然386671-674(1997))。血管发生特征在于内皮细胞前体原位分化为成熟内皮细胞及这些细胞的相结合形成血管，如发生在早期胚胎初级血管丛的形成中。相反，血管生成，通过预先存在的脉管的生长及分支形成血管，在胚胎生长后期是重要的，且负责成体中发生的血管生长。血管生成是一种复杂生理过程，包括内皮细胞增殖，胞外基质降解，血管分支，及随后的细胞粘附。在成体中，在正常环境下血管生成被紧密控制并限制在雌性生殖系统中。然而血管生成可在组织损伤的情况下激活。重要的是实体肿瘤能诱导周围组织中血管生成，因此维持肿瘤生长及促进肿瘤转移的形成(Folkman，J.，自然医学127-31，(1995))。复杂的血管生成的分子机制还远未了解。
血管生成还参与许多病理情况，其在疾病的不同后遗症中起作用或直接参与其中。一些血管生成例如包括与各种肝脏疾病相关的新血管生成，糖尿病的新血管生成后遗症，高血压的新血管生成后遗症，外伤后的新血管生成，由于头部外伤所致新血管生成，慢性肝脏感染(如慢性肝炎)中的新血管生成，由于烫伤或冻伤所致的新血管生成，与激素过量相关的功能异常，血管瘤的产生及血管成形术后的再狭窄。
由于血管生成在如此多的生理和病理过程中的重要作用，参与控制血管生成的因子已经深入研究。许多生长因子已示出可调节血管生成；这些因子包括成纤维细胞生长因子(FGFs)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，转化生长因子α(TGFα)，和肝细胞生长因子(HGF)。见例如Folkman等，生物化学杂志26710931-10934(1992)所述。
已提示内皮细胞特异性生长因子的特殊家族—血管内皮生长因子(VEGFs)，及其相应的受体，主要负责内皮细胞生长和分化的刺激，以及分化的细胞的一些功能。这些因子是PDGF/VEGF家族的成员，并呈现通过内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)起作用。生长因子的PDGF/VEGF家族属于生长因子胱氨酸-结超家族，该超家族还包括神经营养因子和转化生长因子β。
在PDGF/VEGF家族中已鉴别8种不同的蛋白质，有2种PDGF(A和B)，VEGF和5种与VEGF密切相关的成员。这5种与VEGF密切相关的成员是VEGF-B，见于Ludwig癌症研究所和Helsinki大学的国际专利申请PCT/US96/02957(WO96/26736)和美国专利5840693及5607918所述；VEGF-C或VEGF2，见于Joukov等，EMBO杂志15290-298(1996)，Lee等，美国科学院院报931988-1992，和人体基因组科学有限公司的美国专利5932540和5935540所述；VEGF-D，见于国际专利申请No.PCT/US97/14696(WO98/07832)，和Achen等，美国科学院院报95548-553(1998)所述；胎盘生长因子(PlGF)，见于Maglione等，美国科学院院报889267-9271(1991)；和VEGF3，见于人体基因组科学有限公司的国际专利申请No.PCT/US95/07283(WO96/39421)所述。每个VEGF家族成员与VEGF有30％-45％的氨基酸序列相同性。VEGF家族成员共同具有一个VEGF同源结构域，该结构域含有形成胱氨酸—结基序的6个半胱氨酸残基。VEGF家族的功能特点包括改变内皮细胞促分裂原性，诱导血管通透性及血管生成和淋巴管生成性。
血管内皮生长因子(VEGF)，如同其名称，是内皮细胞特异性促分裂原。其具有强有力的血管生成活性，即其促进新血管生长。血管生成是一个维持生命所必需的生理过程，牵连许多血液中的蛋白质和血管中的细胞。在血管生成期间，促分裂原性因子如VEGF起重要作用。然而，这些因子所起的详尽生物化学作用还不清楚。
由于对VEGF的鉴别和定性，关于血管生成因子的活性和新因子的阐明有许多重要发现。早期发现显示血管生成是正常发育和生理所需的。如胚胎生成，伤口愈合，及黄体形成，均涉及血管生成和血管生成因子。例如在伤口愈合期间，VEGF水平提高提示VEGF表达与伤口愈合之间的直接相关性。同样，VEGF调节缺陷可与伤口愈合失调有关(Frank，S.，等，生物化学杂志270512607-12613(1995))。
其它关于血管生成因子的重要发现表明持久和未调节的血管生成加重和/或导致疾病。例如，关节炎涉及新毛细管侵入关节并破坏关节软骨。在糖尿病中，视网膜中的新毛细管侵入玻璃体，导致出血和失明。(Folkman，J.和Shing，Y.，生物化学杂志26710931-10934(1992))。血管生成因子在这些及其它疾病中的作用还不十分清楚。
另一种重要发现包括血管生成与肿瘤发育之间的关系。肿瘤生长与转移均依赖于血管生成过程(Folkman，J.和Shing，Y.，生物化学杂志26710931-10934(1992))。例如，当肿瘤细胞导入动物时，VEGFmRNA的表达模式揭示在坏死的肿瘤生长区域周围的细胞中有最高的表达水平。在这些区域内鉴别了许多血管。VEGF在这些区域中的表达提示血氧不足，一种缺氧状态，引发VEGF在坏死的肿瘤中表达和释放。另一种血管内皮细胞促分裂原，VEGF-B，如下更充分的阐述，也与肿瘤生长尤其恶性肿瘤生长直接相关(见美国专利No.5840693所述)。
VEGF是结构上与血小板衍生生长因子(PDGF)相关的蛋白质家族的成员。PDGF是平滑肌细胞，神经胶质细胞，和一些其它类型细胞的强促分裂原。一方面，PDGF家族的成员特征在于有8个保守的半胱氨酸残基。在它们的活性生理状态，蛋白质是在8个半胱氨酸残基的分子间和分子内通过二硫键形成的二聚体。另一方面，此家族成员在其促分裂原作用，尤其对内皮细胞和相关类型细胞的促分裂原作用中是相关的。
血管内皮生长因子B(VEGF-B)，一种非糖基化的高度碱性的生长因子，是另一种PDGF家族成员。由于与VEGF，PDGF-A，PDGF-B，和PlGF(血小板生长因子)在结构上密切相关，VEGF-B在成体和胚胎组织，尤其在肌组织中的血管生成中起作用。VEGF-B还具有血管生成促分裂原作用。Northern印迹分析显示VEGF-B mRNA在许多小鼠和人的组织中存在，包括心脏，脑，和骨骼肌中。RT-PCR分析已证实VEGF-B mRNA存在于黑素瘤，正常皮肤，和肌肉中。
因此，VEGF-B在哺乳动物的许多组织中表达，但大多数集中在心脏，骨骼肌，和胰腺。VEGF-B的表达模式不同于VEGF，尽管它们都在许多组织中表达(Olofsson，B.等美国科学院院报932576-2581(1996))。
小鼠和人的VEGF-B基因几乎是相同的，且均跨越大约4kb的DNA。此基因由7个外显子组成，且它们的外显子—内含子组构类似于VEGF和PlGF基因(Grimmond等，基因组研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996)；Townson等，生物化学生物生理学研究综述220922-928(1996))。目前已识别通过mRNA的可变剪接产生的VEGF-B的两种同种型(Grimmond等，基因组研究6124-131(1996)；Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996)；Townson等，生物化学生物生理学研究综述220922-928(1996))。这两种分泌形式的VEGF-B分别有167个(VEGF-B167)和186个(VEGF-B167)氨基酸残基。该同种型具有相同的115个氨基酸残基的N末端结构域，不包括信号序列，而C末端结构域不同。通常N末端结构域由外显子1-5编码。剩余的3个外显子的不同用途是产生两种剪接同种型。通过使用外显子6中的可变剪接受体位点，导入一个101bp的插入引起读框移位，和VEGF-B167cDNA编码区终止。因此，这两种VEGF-B同种型具有不同的C末端结构域。
VEGF-B的两种剪接同种型的不同C末端结构域影响它们的生物化学和细胞生物学性质。VEGF-B167的C末端结构域与VEGF中相应区域在结构上相关，具有一些保守的半胱氨酸残基和一段碱性氨基酸残基序列。因此，此结构域是高度亲水的和碱性的，且因此VEGF-B167在分泌时将保持细胞结合形式，除非生产细胞是用肝素随后高盐浓度处理的。结合VEGF-B167的细胞结合形式的分子似乎是细胞表面或细胞外周硫酸肝素蛋白聚糖。此同种型的细胞结合形式通过其独特的碱性C末端区发生。
VEGF-B186的C末端结构域与数据库中已知氨基酸序列无明显相似性。VEGF-B186的C末端结构域的疏水性与VEGF-B167的亲水性和碱性的C末端的性质相反。这可通过观测到VEGF-B186在分泌时不保持细胞结合形式而证实。近来的研究结果表明此同种型是经蛋白酶解加工的，其调节蛋白质的生物学性质(Olofsson等，美国科学院院报9511709-11714(1998))。
关于人和小鼠VEGF-B及各自的同种型的分离和定性包括核苷酸和氨基酸序列详见于路德维格癌症研究所和赫尔辛基大学的PCT/US96/02957，美国专利5840693和5607918及Olofsson等，美国科学院院报932576-2581(1996)所述。国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)，美国专利5840693和5607918在此并入参考。
与其相关的促分裂原蛋白一样，VEGF-B在体内呈现为二硫键连接的同源二聚体。VEGF-B的两种同种型也与VEGF形成异源二聚体，与参与类PDGF蛋白的分子间和分子内二硫键内的8个半胱氨酸残基的保守形式一致。另外，VEGF-B和VEGF在许多组织中的共同表达提示，VEGF-B167-VEGF异源二聚体是天然发生的。VEGF-B167-VEGF异源二聚体保持细胞结合形式。相反，VEGF-B186和VEGF异源二聚体在培养基中自由地从细胞中分泌。VEGF还与PlGF形成异源二聚体(DiSalvo等，生物化学杂志2707717-7723(1995))。生长因子此家族的成员之间异源二聚体复合物的生成可提供血管生成或调节分子的多样性阵列的基础。
如上所述，PDGF/VEGF家族成员通过与受体酪氨酸激酶结合而起作用。通常地，受体酪氨酸激酶是糖蛋白，其由能结合特异性生长因子的胞外结构域，通常是蛋白质α螺旋部分的跨膜域，在其处受体可例如通过蛋白质磷酸化调节的膜并列(juxtamembrane)结构域，作为受体酶组分的酪氨酸激酶结构域，及在许多受体中参与识别和结合酪氨酸激酶的底物的羧基端末尾组成。
已经鉴别了5个内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶，称为VEGFR-1(Flt-1)，VEGFR-2(KDR/Flk-1)，VEGFR-3(Flt4)，Tie和Tek/Tie-2。这些受体的特异性和亲和性不同。所有这些受体都有为信号转导所必需的固有的酪氨酸激酶活性。
已知与VEGFs结合的受体酪氨酸激酶是VEGFR-1，VEGFR-2，和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2与VEGF高亲和性结合，VEGFR-1还结合PlGF。VEGF-B与VEGFR-1高亲和性结合，但不与VEGFR-2或VEGFR-3结合(Olofsson等，美国科学院院报9511709-11714(1998))。VEGF-C已示出是VEGFR-3的配体，且还激活VEGFR-2(Joukov等，EMBO杂志15290-298(1996))。VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3均结合(Achen等，美国科学院院报95548-553(1998))。Tek/Tie-2的配体已由Regeneron制药公司的国际专利申请No.PCT/US95/12935(WO96/11269)阐述。Tie的配体还未鉴别。
近来，已纯化和克隆了一种新的130-135kDa的VEGF同种型特异性受体(Soker等，细胞92735-745(1998))。发现VEGF受体通过外显子7编码的序列特异地结合VEGF165，其示出与肝素的微弱亲和性(Soker等，细胞92735-745(1998))。令人惊奇地，此受体示出与人neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是一种参与早期神经形态发生中的一种受体。PlGF-2也呈现与NP-1相互作用(Migdal等，生物化学杂志27322272-22278(1998))。
VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3是通过内皮细胞不同表达的。通常地，VEGFR-1和VEGFR-2均在血管内皮中表达(Oelrichs等，癌基因811-18(1992)；Kaipainen等，实验方法杂志1782077-2088(1993)；Dumont等，Dev.Dyn.20380-92(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))，VEGFR-3主要在成体组织的淋巴内皮中表达(Kaipainen等，美国科学院院报93566-3570(1995))。VEGFR-3还在肿瘤周围的血管中表达。
尽管VEGFR-1在发育期间主要在内皮细胞中表达，但在胚胎发生的早期阶段也发现其在造血前体细胞中(Fong等，自然37666-70(1995))。在成体中，单核细胞和巨噬细胞也表达此受体(Barleon等，血液873365-3343(1995))。在胚胎中，VEGFR-1由大多数血管表达(Breier等，Dev.Dyn.204228-239(1995)；Fong等，Dev.Dyn.2071-10(1996))。
转基因动物是研究蛋白质功能和生理活性的有效工具，且已为此产生了许多这种动物。一种产生转基因动物的特殊方法包括同源重组法。在同源重组中，所有或部分基因组序列用另一种含有同源序列的DNA置换。通过转基因操作和同源重组，动物细胞中的基因或部分基因可被改变。改变基因以编码不再有天然蛋白质的功能的蛋白质，产生无效突变体或无效等位基因。(见例如，美国专利No.5557032)。
为研究VEGF功能和生理学，已报道了含有VEGF基因无效突变体的转基因胚胎(Carmetliet，P.，等，自然380435-439(1996))，从中得到一些重要发现。在VEGF无效突变体的胚胎杂合子中，血管形成是异常的，但未废除。VEGF无效突变体的胚胎纯合子在血管生成中表现更明显的削弱。此纯合子胚胎死于中期妊娠。在由生殖细胞系传递产生的杂合子子代胚胎中观测到相似表型。然而，Carmetliet的关于胚胎的研究，未报道动物的表型和用途。另外，VEGF转基因胚胎的产生，未有关于所有类VEGF蛋白质的血管生成或肿瘤生长调节性质的发现。
因此，尽管本领域阐述了血管生成因子的功能和生理，这些因子仍未完全清楚，仍需要可用于评价血管生成因子如VEGF-B的活性，以及它们在上述各种疾病中作用，和/或用于开发和/或评价其它血管生成肽的方法。
发明概述本发明一方面包括含有突变的VEGF-B基因的转基因动物的应用。VEGF-B基因是通过同源重组方法突变的。这些转基因动物有许多用途。例如，所述动物的研究可提供关于VEGF-B多肽，其片段或类似物如小分子的治疗和施用的重要信息。尤其本发明的转基因动物可用于阐明VEGF-B和/或其它细胞因子对生理现象如通透性，炎症和/或组织修复的作用。此动物或衍生自此动物的细胞用于筛选分析，以鉴别调节血管生成和/或肿瘤生长的化合物。此动物也可用于测试VEGF-B激动剂在体内的分布和功能和非毒性，及含有VEGF-B的分子。
本发明另一方面提供了一种含有至少一种无功能突变的VEGF-B等位基因的转基因非人动物的应用方法。此转基因动物是通过将转基因DNA导入非人动物优选小鼠的胚胎干细胞中而产生的。此转基因DNA有一个同源于VEGF-B的序列的区域。然后，选择这样的细胞，其中转基因DNA已整合入干细胞基因组DNA的至少一个拷贝的内源基因组VEGF-B序列位点。将此细胞导入发育动物的胚泡中，并使其发育成转基因动物。
用于产生本发明方法所使用的转基因动物的转基因DNA，包含来自VEGF-B基因的核苷酸序列，该序列已通过本领域许多已知方法改变，突变或修改。因此，用于产生转基因动物的DNA可含有许多不同的DNA序列。根据所需效应选择适当的序列。例如，半胱氨酸的至少一个密码子可改变或缺失。所得动物可产生一种VEGF-B，其具有与天然VEGF-B或另一种类PDGF蛋白质形成二聚体的改变的能力。在一优选的实施方案中，VEGF-B的8个半胱氨酸有7个已缺失，产生VEGF-B的无效突变体。
另一方面，本发明提供了一种筛选化合物的方法，该化合物在转基因动物中具有实现血管生成，或调节肿瘤生长或进展，或增加心肌组织的能力。此方法包括将化合物导入转基因动物中，并检测动物体内血管发育。或者，此方法包括将肿瘤细胞导入转基因动物中，并将化合物导入相同动物中，检测动物体内肿瘤发育。
上述方法的各种实施方案包括在本发明范围内。例如，可以衍生一种筛选具有恢复或可检测地实现VEGF-B基因产物的活性的能力的化合物的方法，包括将化合物加入到合适的细胞系中。根据本发明产生的转基因动物和细胞系可用于这些方法中。这种动物或细胞系系统也可用于选择化合物，其能恢复或调节VEGF-B基因的活性和/或血管生成。此化合物可以是蛋白质形式(例如在体外重组或合成的)，或者是编码VEGF-B或其类似物的DNA形式。可以是可操纵地与启动子连接的裸基因组DNA或cDNA，其可进一步与病毒或细菌载体连接。DNA可掺入脂质体结构中，如Lui等，自然生物技术，15167-172(1997)。此DNA或蛋白质也可由VEGF-B剔除小鼠胚胎在8-16个细胞的胚胎阶段提供。
具有突变体VEGF-B基因序列(其野生型或突变的片段)的所得转基因动物可用于产生双转基因动物。为此，突变体VEGF-B转基因动物可与其它相同物种的转基因动物或与相同物种的天然发生的突变体动物交配。所得双转基因动物或衍生自其中的细胞，可作为突变体亲代转基因动物用于相同的应用中。
已知突变或修改核酸序列的方法，可用于产生本发明所用的VEGF-B突变体动物，细胞系或序列。这种方法包括但非限于点突变，定点诱变，缺失突变，插入突变，得自同源重组的突变，和得自化学或放射性处理的DNA或携带DNA的细胞的突变体。如果需要或必需，PCR分析或DNA测序可用于确定产生的突变。然后，突变体动物，细胞系或序列可用于所述DNA序列，系统，分析，方法中。定义上突变的或修饰的DNA与基因组DNA是不同的或不相同的。突变体动物也可通过将含有本文所述的或通过本发明产生的序列的第一个转基因动物与第二个动物交配而产生。第二个动物可含有不同于第一个动物中所含有的DNA。以这种方式可产生各种突变体动物系。
另外，重组DNA方法适于突变本文所述DNA序列，将这些DNA序列连接于表达载体，并表达VEGF-B蛋白质或突变体。由此可分析VEGF-B突变体的生物化学或行为活性。以此方式可产生阻止有效的VEGF-B表达的突变的DNA序列。
本发明中“修饰的VEGF-B DNA”指来自已经通过体外或重组DNA方法修饰的VEGF-B基因的核苷酸序列。修饰的VEGF-B DNA不含有如来自一种胚胎干细胞的基因一样的核苷酸序列，该胚胎干细胞已导入转基因DNA。特别包括的是在VEGF-B DNA序列中由于核苷酸的缺失，取代和插入所作的修饰。例如，一个特殊修饰的VEGF-B DNA含有小鼠VEGF-B DNA序列的3个或所有4个外显子的缺失。VEGF-B基因座的限制图谱(
图1和3)通过缺失至少一个限制性片段，可用于设计各种修饰的VEGF-B DNAs。
本发明的方法提供了解释各种物质包括血管生成生长因子的血管生成和肿瘤生长调节活性的有效模型。VEGF-B的治疗，诊断和调节用途可利用具有改变的VEGF-B基因的转基因动物，从模型系统中确定。尤其地，转基因动物根据本发明可用于基于VEGF-B影响生理现象如通透性，炎症和/或组织修复的治疗方案中。另外，本发明的方法可用于评价其它多肽或小分子的类VEGF-B活性，如血管生成活性，或VEGF-B对内皮细胞基因表达具有的一种活性，如影响其基本性质例如从血流中摄取营养至特殊组织中。
转基因动物根据本发明可用于阐明VEGF-B的发育和体内平衡功能，通过监测和对比用于野生型(+/+)，杂合子(+/-)，和无效等位基因(-/-)动物的不同生理应激结果而进行。例如，VEGF-B对血液凝血时间的作用可通过在创伤分析中使用而监测；VEGF-B对肿瘤生长的作用可通过监测植入的肿瘤细胞的增殖而确定；VEGF-B对物理活性的作用可通过对比性物理活性研究而揭示；和/或VEGF-B对应激反应的作用可通过应用一些应激如暴露于压缩空气中而确定。另外，VEGF-B对心率，心输出量(如血压)和/或血动力(heamodynamic)性的作用，可用本发明的转基因动物如Zhou等，自然医学4201-07(1998)所述方法进行分析。
VEGF-B在正常心脏功能中作用可通过对比VEGF-B缺陷鼠(-/-)和正常鼠(+/+)的同窝仔而研究。VEGF-B表达丧失揭示一些明显的不同。这些不同表明缺陷的动物有房室(AV)传导缺陷和可表明心肌局部缺血的迹象。
本发明的另一方面提供了一种筛选化合物的方法，该化合物具有调节房室传导或局部缺血的活性。此方法包括将要筛选的化合物导入VEGF-B缺陷的非人动物中，并分析对该动物的房室传导和局部缺血的作用。此方法还可用于筛选多于一种的具有调节房室传导或局部缺血活性的化合物，例如当筛选噬菌体，肽或组合文库时。可溶性肽文库及其应用的代表见于R.A.Houghten，基因1377-11(1993)所述。随机呈递肽的噬菌体文库例如Barry等，自然医学2299-305(1996)。一般的组合文库及其应用见于K.S.Lam，抗癌药物研究12145-167(1997)；Nefzi等，生物有机化学和药物化学通信82273-2278(1998)；Coffen等，药物化学研究8206-218(1998)；和Li等，现代药物开发3105-112(1998)。
本发明另一个相关方面涉及一种治疗或减轻房室传导缺陷或局部缺血的方法，包括施用有效减轻房室传导缺陷或局部缺血量的VEGF-B，或其具有VEGF-B生物活性的片段或类似物。
术语“类似物”或“功能类似物”指修饰形式的全长VEGF-B或其片段，其中已进行至少一个氨基酸取代，这样所述类似物在体内和/或体外基本保持与未修饰的全长VEGF-B或其片段一样的生物活性。
表达“VEGF-B的生物活性”是指刺激一或多种内皮细胞增殖，分化，迁移，存活或血管生成或血管通透性的能力。
用于治疗或减轻房室传导缺陷或局部缺血的VEGF-B多肽及其类似物也可与其药物学适合的非毒性盐，和药物学合适的固体或液体载体或佐剂组合应用。
这种载体或佐剂例如包括但非限于盐水，缓冲盐水，林格式液，矿物油，滑石，玉米淀粉，明胶，乳糖，蔗糖，微晶纤维素，高岭土，甘露糖醇，磷酸钙，氯化钠，藻酸，葡萄糖，水，甘油，乙醇，增稠剂，稳定剂，悬浮剂，及其组合。这种组合物可以是溶液，悬浮液，片剂，胶囊，乳状液，药膏，酏剂，糖浆，糊纸包药，油膏，或其它常用形式。配方应适于施用方式。含有本发明肽的组合物含有大约0.1％-90％(重)的活性化合物，大多数为10％-30％(重)。
就肌内应用而言，无菌配方优选VEGF-B的适当的可溶的盐形式，如盐酸盐，可以是溶于药物稀释剂中施用，所述稀释剂如是无热原水(蒸馏水)，生理盐水，或5％葡萄糖液。可以制备适当的不溶形式的化合物，并在水基或药物学合适的油基中形成悬浮液而施用，所述油基例如是长链脂肪酸酯如油酸乙酯。
施用剂量和途径将依赖于病人的自然条件和治疗的疾病，且要根据医生或兽医的意见而定。适当的施用途径包括口服，舌下，肌内，腹膜内，或静脉内注射，非肠道应用，局部应用，植入等。例如，将有效量的本发明的肽或抗体施用于需要其的机体，剂量为大约0.1-100mg/kg体重之间，优选1-10mg/kg体重。对治疗进展，病人的副作用和循环多肽水平进行监测，将提供制定最佳剂量的另外的指导。局部施用VEGF-B或其片段或类似物的方式与施用VEGF相同。
另一种治疗或减轻房室传导缺陷或局部缺血的方法，包括施用有效量的编码VEGF-B或其有VEGF-B生物活性的片段或类似物的核酸序列，其中所述核酸能编码有效量的所述VEGF-B或其片段，以治疗或减轻房室传导缺陷或局部缺血。此核酸序列优选可操纵地与启动子序列连接。
核酸可以是裸露的和/或在载体或脂质体中。本发明优选的载体是表达载体，其中本发明的核酸可操纵地结合一或多个适当的启动子和/或其它控制序列，这样用克隆入载体的核酸转化或转染适当的细胞时，细胞能表达本发明的多肽。大多数优选的载体是适于转染进行基因治疗的载体，如腺病毒载体，痘苗载体，或逆转录病毒载体或脂质体。本领域已知各种这种载体。
本发明另一方面提供了一种诊断测试个体中心脏疾病的方法，包括为病人做心电图并查看PQ间期是否延长和/或ST段是否下移(或U波)。
本发明另一方面提供了一种诊断测试个体心脏疾病的方法，所述心脏疾病特征是丧失VEGF-B表达。这些方法可包括通过用聚合酶链反应寻找VEGF-B DNA扩增缺失或检测特异性结合剂与VEGF-B结合缺失而寻找VEGF-B表达丧失。特异性结合剂优选是VEGF-B的抗体。最优选的抗体是VEGF-B的单克隆抗体。
本发明的抗体可用可检测的标记进行标记。抗体可偶联于适当的超磁性，顺磁性，电子致密的，生态的(ecogenic)或放射性或非放射性制剂以显影。放射性制剂/标记例如包括放射性原子或基团，如125I或32P。非放射性标记包括酶标记如辣根过氧化物酶，或荧光标记如异硫氰酸荧光素(FITC)。可直接或间接，共价或非共价进行标记。
附图简述本发明参考以下附图将得以更进一步阐述。
图1是产生小鼠VEGF-B基因的无效突变体的方案示意图；图2示出尾DNA的PCR扩增物的琼脂糖凝胶电泳，所述尾DNA来自同窝纯合子VEGF-B(+/+)，杂合子(+/-)和VEGF-B基因座的纯合剔除鼠(-/-)的F2子代；图3示出小鼠VEGF-B基因座的详细限制性图谱。限制酶及相应符号见以下所列；图4示出用于产生定向于小鼠VEGF-B基因座的转基因载体的方法图示。以下所述的每个构建体A-E示于产生定向于小鼠VEGF-B基因座的转基因载体的例证方法中；图5a和5b是RNA的Northern印迹图，RNA来自野生型(+/+)，杂合(+/-)，和剔除(-/-)小鼠的心脏和骨骼肌组织；图6是在同窝的纯合VEGF-B(+/+)和VEGF-B缺陷(-/-)小鼠中，对比移植的肿瘤的图示；图7A和7B是同窝的纯合VEGF-B(+/+)和VEGF-B缺陷(-/-)小鼠的典型心电图。
举例性实施方案的详述以下阐述和实施例是本发明实施方案和范围的例证。本发明非限于此阐述范围。本领域技术人员将意识到以下实施例和实施方案可用本领域已知的方法修改。例如，所述的或权利要求的核酸序列可通过已知方法改变，而不改变本发明人已示出的作用和优势。这种变化因此包括在本发明范围内。本领域已知的许多方法的详细方案见于Ausubel，F.M.等编辑，分子生物学通用方法，Greene出版社和Wiley-Interscience，John Wiley&Sons，Boston，MA(1989)，及Jan于1997年的增补，后文称为“Ausubel(1989)”，以及Sambrook，J等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，后文称为“Sambrook(1989)”，以及由B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy所著的《操作小鼠胚胎实验手册》，冷泉港实验室出版社，(1994)，后文称为“Hogan(1994)”。这些文献特别地并入参考。这些文献利于本领域技术人员进行本发明的实施方案。
本文所用的“无效等位基因”，“无效突变”，和“无效突变体”指编码与野生型蛋白质相比发生变化的蛋白质的基因序列。通常地，“无效突变体”是以基本不能发挥其原来功能的方式而改变。例如，VEGF-B突变体是编码一种蛋白质的DNA序列，该蛋白质不能刺激血管内皮细胞生长，或不呈现任何上述VEGF-B的其它作用。然而，与VEGF-B的其它生物化学功能相关的结构，如肝素结合和二聚体化，可呈现于由无效等位基因编码的蛋白质中。另外，术语“无效突变体”可以指携带如上述改变的蛋白质的基因序列的动物或细胞。
转基因DNA指能导入细胞中的DNA，此DNA掺入到细胞的基因组中。此细胞能产生含有转基因DNA的转基因动物。通常地，转基因DNA作为载体，转基因载体而构建，以施用于特定的细胞中。这种载体不需要呈特殊的结构形式，如环状形式。
重组基因或序列指已用本领域已知的许多重组DNA方法之一操作的基因或序列。
本文所用术语“修饰的VEGF-B DNA”指来自动物的一种VEGF-B核苷酸序列，所述动物已通过一或多种以下方法而修饰，如点突变，定点诱变，缺失诱变，插入诱变，得自同源重组诱变，和/或得自化学或放射性处理DNA或携带DNA的细胞，或其与另一种与野生型VEGF-B DNA性质不相关的DNA序列如标记序列连接的突变。修饰的VEGF-B DNA可保持一些或全部野生型VEGF-B DNA的活性，如Flt-1受体结合机制。
本文的VEGF-B基因和DNA序列非限于小鼠或人的基因或序列。任何物种的动物均可用作VEGF-B基因的来源。在掺入转基因DNA的重组序列中，与特定胚胎细胞中的VEGF-B基因同源的序列不需是来自与胚胎细胞相同的物种。
产生转基因动物的方法不管是何物种基本是相同的。简而言之，转染的细胞在胚胎能整合转染的细胞的阶段注射入胚胎中，例如在胚泡阶段。接着，将胚胎再植入代理母亲中，产生具有转基因DNA的嵌合子代。因此，所需要的只是来自动物的适当的胚胎干细胞。
本领域已知各种动物的胚胎干(ES)细胞的产生方法。胚胎干细胞有许多来源，包括小鼠，大鼠，母牛，猪，羊和其它动物。例如，Joyner A.L，(1993)，基因定向实用方法，Wood，R.编辑，及Hames，B.D.，实用方法丛书，第126卷，牛津IRL出版社(特别并入参考)，阐述了产生ES细胞的方法。同样，由B.Hogan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy所著《操作小鼠胚胎实验手册》，冷泉港实验室出版社(1994)，阐述了操作小鼠胚胎的方法。另外，Couly和LeDouarin，发育108543-555(1990)，阐述了分离和操作鸡和鹌鹑胚胎的方法。Kimmel和Warga，自然327234-237(1987)，阐述了分离和操作zebrafish胚胎的方法。及Ware等“饲养动物胚胎干细胞系的发育”，再生研究协会，38241(1988)揭示了适于许多物种如小鼠，牛，猪和羊的胚胎干细胞培养条件。因此，本发明可应用于其它动物如用于所特别例证的小鼠一样。
本领域已知各种将DNA插入动物细胞的方法。例如，转基因DNA可微注射入适当的细胞中。病毒载体可用于将DNA导入适当的细胞和这些细胞的基因组中(见例如，Tsukui等，自然生物技术14982-985(1996))。细胞也可通过转染和电穿孔方法在体外操作(见Ausubel(1989)和Hogan(1994))。
通常地，转基因DNA掺入细胞基因组是通过随机整合或同源重组进行的。本领域技术人员熟知在ES细胞或其它细胞中，提高同源重组与随机整合的相对频率的策略，以鉴别和分离已发生同源重组的细胞(见例如Ausubel(1989)，美国专利No.5557032，和Hogan(1994))。设计转基因DNA载体可包括将细胞序列的一些部分或同源于此细胞序列的序列掺入转基因DNA中。该部分必须充分同源于细胞序列以使得转基因DNA和细胞DNA体内杂交，以发生同源重组。
待插入到胚胎干细胞的转基因DNA优选地包含5′和3′同源区。这些同源区能促进在胚胎干细胞中的同源重组。本领域技术人员已知的许多出版物讨论了如何构建用于同源重组的同源区。例如，Thomas&Capechhi，细胞51503-512(1987)，Mansour等，自然317348-352(1988)，和Capecchi，美国专利5,487,992均讨论了在同源重组技术中设计同源区的策略。因此，设计用于同源重组的序列的方法是本领域已知的。
但是，同源重组不是在已引入转基因DNA的每一细胞中发生。另外，经常的情况是在细胞中存在超过一个拷贝的希望经同源重组改变或替换的细胞DNA序列，如在具有一个以上等位基因的基因的情况下。因此，通过同源重组，一些细胞可仅在一个细胞内序列中掺入转基因DNA，而其它细胞将使转基因DNA掺入一个以上细胞内序列，或者甚至掺入每个细胞内序列中。因此，纯合子和杂合子动物均可产自用转基因DNA进行同源重组的ES细胞。纯合子动物可与野生型动物交配以产生与所述转基因杂合的进一步的转基因动物。实施例为分析VEGF-B在正常和疾病状态下，在体内血管发育和维持中的作用，产生携带突变VEGF-B等位基因的小鼠。小鼠中的一个VEGF-B等位基因通过同源重组方法功能性地失活。产生自这些细胞的小鼠因此携带一个突变的和一个野生型的VEGF-B等位基因。
图1由四部分组成，1A-1D，是代表以下产生小鼠VEGF-B基因的无效突变的方法的图示。图1A是小鼠VEGF-B基因的外显子-内含子组构的示意图。图1B是VEGF-B基因座的限制图谱，其中表明了许多限制酶的切割位点。在图中，限制酶如下表示N＝NotI；S＝SpeI；K＝KpnI；H＝HindIII；和E＝EcoRI。在后文所述的转基因DNA构建体中除去的SpeI-KpnI片段，以实心框表示。图1C的转基因DNA构建体用于产生突变VEGF-B等位基因。此构建体含有VEGF-B基因的5’同源片段(NotI/平端的SpeI)，和3’同源片段(平端的KpnI/HindIII)，它们位于pPGK-新霉素盒(neo)的两侧。图1D示出在Southern印迹分析中，用于鉴别VEGF-B的野生型和突变等位基因的DNA探针的位置。
在图2中，来自新霉素盒(neo)的扩增的野生型条带(wt)和扩增的条带的迁移示于右侧。
在下述段落中，描述了产生携带突变的VEGF-B等位基因的动物的详细过程，以及得到的小鼠表型的初步分析。实施例1可用作转基因的VEGF-B序列的选择用于产生转基因动物的DNA可以含有多个不同的DNA序列。合适的序列的选择取决于是希望的效果。例如，如果希望获得携带VEGF-B的无效突变体的动物，转基因DNA含有编码不具有VEGF-B的主要功能即血管内皮细胞促分裂原的蛋白质的序列。尽管可使用确定突变的代表的促分裂原活性的分析，但是也可使用VEGF-B基因的结构信息以精确推导特定突变方案的效果。
在本实施例中，缺失了VEGF-B小鼠基因的一部分。缺失的部分含有对于二硫键结合重要的8个半胱氨酸残基中的7个。如上所述，VEGF-B是生长因子PDGF家族的成员。由于这一家族的成员是结构上相关的，其它PDGF家族成员的突变的效果可外推指示对VEGF-B的效果。因此，产生特定效果的VEGF中的突变可类似地在VEGF-B中产生相同或相似的效果。类似地，PDGF家族中其它成员的突变可用于产生VEGF-B基因中的突变。当所有家族成员或甚至家族的一个其它成员的结构信息指示出与比活效果的保守结构时尤其如此。考虑到这些，产生一无效突变体，其中8个半胱氨酸残基中的7个残基缺失。由于从关于PDGF家族的数据中已知半胱氨酸残基参与二硫键结合和二聚体化，缺失7个半胱氨酸残基可推定产生无功能的突变体VEGF-B蛋白。在下文进一步阐述了关于本发明所用转基因DNA中的序列的选择。
为选择在本发明中修饰的DNA序列，小鼠VEGF-B的基因首先用pcif-2作探针，克隆自小鼠λFIXII文库(Stratagene La Jolla，CA)。此方法的详细阐述见于Olofsson等，生物化学杂志27119310-19317(1996)所述(特别并入参考)。分离并定性3个均携带大约20kb小鼠基因组DNA的λ克隆10，11，和12。此基因组DNA的详细限制图谱是通过用不同的限制酶消化λDNA，接着通过Southern印迹鉴别限制的片段而产生的。得自小鼠cDNA克隆的序列的各种32P标记的寡核苷酸探针用于Southern印迹分析中。
得自含有VEGF-B基因的λDNA的限制图谱的信息用于选择进行转基因的DNA。根据转基因动物的性质，特征，基因型或表型选择DNA。可需要各种性质，特征，基因型或表型。例如，一种动物，其中VEGF-B DNA已与标记序列连接，如与本领域已知的β-半乳糖苷酶，绿荧光蛋白或荧光素酶或其它标记连接，可以是确定表达的VEGF-B蛋白的位置的分析所需的。其中VEGF-B DNA可操纵地与高度可诱导的启动子或在哺乳动物组织中驱动表达的启动子连接这样的动物可以是从动物中获得VEGF-B蛋白的目的所需的。所用的启动子或表达系统是本领域已知的。另外，突变VEGF-B序列可操纵地插入转基因动物后，可提供用于确定血管生成或肿瘤发育的分子基础的研究动物。
在一个转基因方案中，希望VEGF-B基因的无效等位基因。无效等位基因的基因产物在VEGF-B的血管生成性质方面是无功能的。具有VEGF-B无效等位基因的动物可用于各种分析中以鉴别例如在动物中实现血管生成的化合物。
产生无效等位基因的一种方法包括缺失或修饰DNA序列以防止分子内或分子间二硫键的形成，或分子内和分子间二硫键的形成。具体地，编码已知或据信参与二硫键的半胱氨酸残基的区域被缺失。或者，通过本领域已知的点突变或定点诱变程序突变各个半胱氨酸残基。但是，无效等位基因也可通过许多其它方式产生。从VEGF-B的限制图谱，例如，可选择方便的限制位点以产生缺失突变体。
原则上，有许多产生无效突变的方式，包括但不限于(i)缺失完整基因；(ii)缺失关键的蛋白编码序列；和(iii)缺失转录调控序列。如果突变影响剪接、mRNA稳定性等，无效突变也可发生。另外，改变读框或引入提前终止密码子的插入或取代也可导致无效突变。
从图1所示限制图谱可看出，一种产生定向的转基因构建体的方式是通过缺失限制片段而进行的，其将在VEGF-B基因中产生无效突变。将PTKneo插入外显子1的“B”位点中也可产生无效突变。从图3所示更详细的限制图谱中，可设计其它策略。例如，也可设计缺失外显子1，2，3，4或5任一个，及缺失一个以上外显子组合。
另一种产生无效突变体的方法包括缺失参与受体结合的那些区域。就PDGF和VEGF而言，存在关于受体结合的结构信息并为本领域所知。可利用此信息缺失VEGF-B的相关部分，以产生无效等位基因。同样，与受体Flt-1结合的VEGF-B及鉴别与受体Flt-1结合的VEGF-B类似物的方法，见于同时在审的美国专利申请系列号08/994540所揭示，这些文献特别地并入参考。此信息也可用于产生VEGF-B的无效等位基因。
如上所述，本领域技术人员将意识到本领域已知的许多方法可用于设计VEGF-B的无效等位基因。因此，本发明非限于所例证的产生携带VEGF-B无效等位基因的转基因动物所进行的缺失。实施例2产生携带VEGF-B缺失突变体的转基因载体在本发明的一个实施方案中，VEGF-B的氨基端结构域中的8个半胱氨酸残基缺失7个。这种缺失破坏了用于成熟VEGF-B分子共价二聚体化的三个分子内二硫键以及两个分子间二硫键。为此，缺失330bp SpeI-KpnI片段，这一片段含有VEGF-B基因的外显子3的一部分以及外显子4的全部。具体地，由外显子3的3′部分编码的33个氨基酸和由外显子4编码的所有24个氨基酸缺失。从这一定向等位基因产生的VEGF-B蛋白无功能，因为其缺少这些关键氨基酸，该等位基因是无效等位基因。
用于产生缺少VEGF-B的SpeI/KpnI片段的重组转基因载体的起始材料是亚克隆进质粒pBluescriptTM(Stratagene)的来自λ-克隆10的10kb NotI/HindIII片段(构建体A)，和克隆进pBluescript的1.7kbpPGK-neo盒(Sibilia，M.，科学269234-238(1995))(构建体B)。
用KpnI消化来自构建体A的10kb VEGF-B片段，用T4聚合酶从KpnI粘末端产生平末端，最后用HindIII酶切，而分离用于产生转基因载体的3′区的1.2kb KpnI/HindIII片段。这一片段和所有后续的片段均是在制备于1×TBE(Tris硼酸盐EDTA)缓冲液中的低熔点(LGT)琼脂糖凝胶上分离。分离的1.2kb片段随后连接进EcoRV和HindIII消化的pBluescript载体，产生构建体C。
转基因载体的5′片段通过用NotI/SpeI酶切从构建体A分离。分离的片段然后连接进NotI/SpeI酶切的构建体C，产生构建体D。
pPGK-neo盒是通过用NotI/HindIII消化构建体B，并用Klenow片段产生平端而分离的。所得片段凝胶纯化，接着连接于用EcoRV消化并用Klenow片段产生平端的构建体D中，产生构建体E。选择具有正向插入的pPGK-neo盒的11.2kb的载体，作为转基因的定向载体。构建体A-E的图示见于图4。
Southern印迹分析用于确定野生型和突变等位基因之间的相同性。基因组DNA用EcoRI消化并制备以进行印迹。在上述筛选步骤中用作探针的450bp放射标记的片段，主要涵盖了VEGF-B cDNA的外显子7编码序列和3’未翻译区的序列。此探针是用克隆10的DNA作模板，通过PCR产生的。PCR中使用的引物是5’-GTGAAGCTCCAGCCGAGCA(有义链)(SEQ ID NO1)，和5’TAGTGTCTTCCATCTCTTT(反义链)(SEQ ID NO2)。在这些条件下，突变等位基因产生6.5kb的基因组EcoRI限制片段，而野生型等位基因产生大于20kb的片段。实施例3将转基因载体插入动物细胞中含有突变VEGF-B的载体(构建体E)，通过电穿孔转染入衍生自129/SW小鼠的E14.1细胞(Kuhn，R.等，科学254707-710(1991))中。通过标准方法分离新霉素抗性克隆并定性。由B.Hougan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy编辑的《操作小鼠胚胎实验手册》，冷泉港实验室出版社(1994)，描述了用于分离和操作胚胎的程序(特别引入本文作参考)。分离来自几百个克隆的基因组DNA，EcoRI消化，并用Southern印迹分析。用这些程序通过检测6.5kb条带和野生型20kb条带鉴别了3个阳性克隆1a，8f和9h。对于克隆1a和9h用放射标记的PKG-neo盒探查Southern印迹也给出预期的6.5kb条带。这些数据显示在ES细胞中的两个VEGF-B等位基因中的一个等位基因已由所述构建体正确定向，且含有VEGF-B无效等位基因的ES细胞已产生。实施例4产生转基因动物将来自细胞系9h的细胞用标准程序注射进小鼠胚泡中。由B.Hougan，R.Beddington，F.Constantini和E.Lacy编辑的《操作小鼠胚胎实验手册》，冷泉港实验室出版社(1994)，描述了注射细胞的程序(特别引入本文作参考)。将胚泡植入假孕代理母亲中。所产生的嵌合小鼠即具有转基因DNA的小鼠通过子代皮毛颜色鉴别。
例如，由于ES细胞衍生自具有chincilla(黄白色)皮毛和携带Agouti基因座的129/SW小鼠，而宿主胚泡衍生自具有黑色皮毛和缺少Agouti基因座的C57B1/6小鼠，所以嵌合小鼠将是Chincilla(仅由ES细胞导致的皮肤块)，黑色(仅由宿主细胞导致的皮肤块)和褐色或Agouti(有129/SW和C57B1/6细胞混合物存在的皮肤块)。由于从129/SW细胞分泌的Agouti蛋白将刺激C57B1/6毛囊细胞加工黑色素(黑色色素)，由此毛发变为褐色，因此嵌合动物是褐色的。
将雄性嵌合小鼠与C57B1/6野生型雌鼠交配。这些雌鼠的子代中存在褐色鼠，表明转基因DNA的种系传递。
对制备自这些F1鼠尾的DNA进行如上述Southern印迹分析。通常地，通过外科手术取0.5cm的尾部组织，并用于制备DNA样品。在50％的褐色鼠中存在6.5kb的EcoRI片段，表明无针对VEGF-B的定向无效等位基因的选择。携带定向的VEGF-B基因座的F1小鼠是杂合子，因为它们也携带VEGF-B的野生型等位基因。携带一个失活的VEGF-B等位基因的F1小鼠正常发育，示出VEGF-B的基因剂量对存活不是关键的。
杂交杂合子F1小鼠，并通过Southern印迹和PCR分析子代的尾部DNA。用两种方法获得的结果是相同的，现提供PCR基因分型方法的详细情况。用F2子代的尾DNA作模板，在标准条件下进行PCR扩增。用位于外显子3和外显子4的两个引物，鉴别野生型等位基因存在316bp的扩增条带。这些引物分别是5’-GCCCAGCTGTGTGACTGT(正向)(SEQ ID NO3)，和5’-CCCACCCCATGCTACACT(反向)(SEQ ID NO4)。用位于新霉素抗性基因中的两个引物，鉴别定向等位基因具有140bp的条带。这些引物分别是5’-TGTTCTCCTCTTCCTCATCTCC(正向)(SEQID NO5)，和5’-ATTGTCTGTTGTGCCCAGTC(反向)(SEQ IDNO6)。图2中总结了来自PCR扩增的结果。分析显示VEGF-B的定向等位基因纯合的小鼠是存活的，且分析大量的F2代动物得出野生型、杂合子和携带无效等位基因的纯合动物的比率为1∶2∶1。因此，无效等位基因以经典孟德尔方式遗传。
对成年VEGF-B剔除小鼠的首次外部观察未揭示与野生型小鼠相比有任何大的形态学改变。但是，观察到某些转基因VEGF-B突变小鼠的心脏似乎畸形(malform)。这些心脏的大小通常比野生型小，且较大的血管似乎更粗。这些表型表明VEGF-B剔除小鼠可用作模型筛选化合物对心脏组织生长或发育的效果。实施例5在细胞或组织样品中检测VEGF-B核酸细胞或组织样品可通过本领域已知的许多常规方法获得。通常，离心的细胞沉淀或组织样品应立即冷冻。用异硫氰酸胍方法(Chomczynski等，分析生物化学，162156-159(1987))分离总RNA。用0.2μg随机六脱氧核苷酸引物、5单位小鼠反转录酶、作为模板的5μg总RNA和第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。在37℃保温1小时后，反应混合物贮存于-70℃。PCR扩增的阴性对照样品类似地制备，只是不加反转录酶。作为内标也测试β-肌动蛋白，因为其以组成性高水平表达，且其表达在不同细胞中不显示太大的差异。
就PCR扩增而言，引物序列选自VEGF-B和β-肌动蛋白基因，序列如下VEGF-B有义5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(SEQID NO7)VEGF-B反义5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC-3’(SEQ ID NO8)β-肌动蛋白有义5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO9)β-肌动蛋白反义5’-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3’(SEQ ID NO10)(β-肌动蛋白序列包含来自Ng等，分子细胞生物学52720-732(1985)所述的2105-2125位和2411-2432位核苷酸)。将取自cDNA反应产物的4μl等份加热至94℃5分钟，并用作模板，用20pmole引物，10×PCR缓冲液，1μl的20mM dNTP和2.5U的Taq聚合酶进行PCR。终体积用DEPC处理的水调整为100μl。在95℃变性1分钟，在62℃退火45秒，在72℃聚合50秒，VEGF-B进行35次循环，β-肌动蛋白进行25次循环。在每5次循环之后，取15μl等分进行分析。
5μl的PCR反应混合物电泳是在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中进行的。大小标记DNA片段的范围在24-726个碱基对之间(Promega，Madison，WI，USA的ΦX174DNA/HinfI标记)。实施例6来自转基因动物的细胞和组织的应用如上所述，VEGF-B剔除小鼠的心脏比野生型的小，提示该动物在心脏细胞生长分析、心率分析、心输出量分析或其它血液动力学性质分析中实用性。在筛选分析中的其它应用是本领域技术人员能意识到的。
为了在这些筛选方法中应用转基因动物的细胞和组织，可利用含有至少一个衍生自转基因动物的细胞的转基因动物细胞或组织培养物。将细胞作为外植体培养，或通过机械分散而分离并作为原代培养物培养。或者，通过本领域已知的转化方法或通过首先将转基因小鼠与例如Jat等，PNAS USA 885096-5100(1991)描述的H-2KtsA58小鼠杂交或本领域已知的其它相关方法(例如见McClean，J.S.，Tibtech 11232(1993))将细胞转化为细胞系。以此方式，剔除突变体与H-2KbtsA58转基因小鼠杂交将产生各种细胞的条件永生细胞系。具体地，细胞首先在ts(温度敏感)A58 T-抗原允许的温度下生长，从而细胞可培养许多代。T-抗原永生化细胞。当细胞转至失活T-抗原活性的不允许温度时，细胞分化，由此可产生来自不同组织的许多不同的细胞系。实施例7血管生成性和/或肿瘤生长调节活性分析可使用也含有应答细胞的组织样品，如来自VEGF-B剔除小鼠的心脏外植体测试VEGF-B类似物。组织样品或外植体保持在本领域已知的溶液中。向组织样品或外植体中加入化合物如VEGF-B类似物或小分子，并分析对组织样品或外植体的作用。以此方式，生理作用如血管生成性，抑制或促进肿瘤生长，增加肌结构，或与VEGF-B相关的其它作用可被分析。本领域技术人员可根据已知方法例如Ausubel(1989)和Hogan(1994)所述方法，设计特殊的实施方案。实施例8评价VEGF-B转录物的表达心脏和骨骼肌中VEGF-B转录物的表达，在野生型小鼠(+/+)，杂合小鼠(+/-)，和纯合剔除小鼠(-/-)中通过Northern印迹而评价。处死VEGF-B缺陷的小鼠和野生型C57B1/6小鼠，将不同的组织立即冷冻并贮存在-80℃直至使用。用硫氰酸胍/酸性苯酚方法制备总细胞RNA(见Chomczynski等，分析生物化学162156-159(1987))。1％琼脂糖凝胶中的每条泳道使用每个样品的20μgRNA，在80V电泳大约3小时。接着将凝胶移至尼龙膜(HybondTM-N+，Amersham)上，随后通过UV交联。在5×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％SDS，和100μg/ml单链DNA中进行预杂交2小时，接着用特异的探针根据厂商指导(Amersham)在65℃杂交过夜。
使用的两个探针是(a)全长小鼠VEGF-B cDNA，和(b)覆盖无效等位基因中VEGF-B基因缺失部分的探针。一个1.8kb的VEGF-B167cDNA片段用于产生第一个探针，使用随机标记试剂盒(Amersham)根据推荐方案进行。Northern分析中使用的第二个探针用在VEGF-B外显子3和4内的148bp片段产生，该片段用无效等位基因/定向载体最高的Neo基因置换并经PCR方法标记(见Konat等，PCR技术，pp37-42，Griffin编辑，CRC出版社，Boca Raton(1994))。在标记PCR中使用Taq聚合酶和32P-dCTP，循环条件为94℃1分钟，58℃2分钟，72℃3分钟，共30个循环。
洗涤后，膜用X-光胶片曝光2-6天。膜在煮沸的0.5％SDS中洗涤，并在磷成象器曝光过夜以保证完整的洗涤。图5a示出用全长小鼠VEGF-B cDNA探针的Northern印迹结果。图5b示出来自覆盖无效等位基因中缺失的VEGF-B部分的探针的结果。
结果示出，两个探针均与得自+/+小鼠的高丰度1.4kb VEGF-BmRNA杂交，且也检测到2个另外的丰度较低的转录物。这两个次要转录物分别为3.0kb和6kb长。在+/-小鼠中获得明显降低的杂交信号，而在得自-/-小鼠的RNA样品中两个探针均未检测到任何VEGF-B转录物。这表明定向的VEGF-B等位基因已被剔除且产生无效等位基因，-/-小鼠不合成VEGF-B蛋白。在杂合子中VEGF-B转录物的水平降低还表明保留的完整VEGF-B等位基因的转录不是补偿性上调的。实施例9肿瘤移植及测量因为已知肿瘤生长和转移依赖于肿瘤组织的新血管化，在同窝的野生型(+/+)和VEGF-B缺陷(-/-)小鼠中研究移植肿瘤的生长。雄性VEGF-B缺陷(-/-)小鼠和同窝纯合C57B1/6小鼠(+/+)用于测试。真皮内注射小鼠T241纤维肉瘤细胞。在植入肿瘤细胞前用甲氧基氟烷麻醉6-8周龄小鼠，随后将1×106个生长至对数期的T241小鼠纤维肉瘤细胞悬浮于100微升PBS中，并皮下植入每个小鼠的背部中线。测量每只动物中的肿瘤生长。用测径器每隔一天观测肿瘤大小。肿瘤体积用以下公式计算宽度2×长度×0.52(见Boehm等，自然390404-407(1997))。
结果示于图6。从图中可以看出在-/-动物中肿瘤的生长明显低于+/+动物。示出在指数生长阶段之前的初始阶段，在突变体动物中较长(+/+动物18-20天，-/-动物30-32天)。此结果表明VEGF-B也许通过影响肿瘤基质从而影响肿瘤血管生成。此论断可根据肿瘤细胞也许表达内源VEGF-B，同时在突变体动物中观测到此作用而得出。
此结果可归因于对内皮细胞生长的直接作用，或非直接作用如迁移，胞外基质的降解等。在每种情况下，结果示出VEGF-B具有促进肿瘤生长作用并表明抗肿瘤方案可在例如通过用与VEGFR-1结合的抗VEGF-B的单克隆抗体或通过与VEGFR-1结合的小分子，或通过抗VEGF-B疗法，或通过上述两种或多种方法的组合抑制VEGF-B作用的基础上设计。实施例10来自正常和VEGF-B缺陷小鼠的心脏组织的组织学检查来自正常和VEGF-B缺陷小鼠的心脏组织切片的组织学检查未揭示有大的差异。另外突变动物的心肌横断面的毛细血管密度也正常。这提示VEGF-B在控制心肌血管化的血管生成过程中可能不起关键作用。实施例11在VEGF-B缺陷动物中分析血管生成因子的表达用放射标记的cRNA探针经RNAse保护分析对来自正常和VEGF-B缺陷小鼠的心脏中基因表达的分析揭示，所研究的大多数基因在突变动物中正常表达。正常表达的基因包括VEGF、PIGF、PDGF A、PDGF受体a和b、VEGF受体1和2、neuropilin 1、Tie 1受体、尿激酶纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂1和血小板内皮细胞粘附分子的基因。在突变动物中的表达被改变的唯一基因是PDGF B(下降约30％，p＞0.05)。目前尚不清楚PDGF B的表达改变的意义。实施例12VEGF-B缺陷小鼠中的心脏异常为研究VEGF-B在正常心脏功能中的作用，用遥测系统(DATA Science，St.Paul，MN，USA)比较VEGF-B缺陷小鼠和正常同窝仔以寻找心脏异常。遥测系统由植入式发射器(TA10ETA-F20)，遥感接收器(RA1010)，和转播来自遥感接收器的信息的巩固基质(BCM100)组成。为记录心电图(ECGs)和其它参数，将发生器植入动物的腹部。将两个电极分别置于接近心尖，和右肩皮下。数据获得系统由数据翻译(DT2801)AD转换器和计算机程序PC-LAB v.5.0(Axenborg和Hirsch，Comp，Meth.Progr.Biomed.4155-67(1993))组成。获得的数据用Excel宏程序进一步分析，数据表示为每分钟自发活动计数，体温和每分钟的心率。心电图用于研究心脏节律。用计算机程序PC-LAB v.5.0，从平均心电图中以毫秒计算PQ，QRS和QT间期。使用的是Johansson和Thoren，Acta Physiol.Scand.160133-138(1997)所述的方法，在此特别并入参考。
对正常小鼠(+/+)和VEGF-B缺陷小鼠的平均心电图进行分析显示出一些明显不同。结果示于图7。
-/-动物的PQ间期与+/+动物相比延长(见表139.7ms对35.7ms，p＞0.05)。这表明缺陷的动物具有房室(AV)传导缺陷。此原因还未清楚，但人体内AV传导降低可以是由AV束状纤维局部缺血，由于疤痕组织压迫AV束，或心脏钙化，AV束或AV结合纤维炎症，或由于迷走神经极端刺激心脏所致。
尽管QRS复波显示是正常的，但小鼠中的U波显示有轻度下移的异常。U波轻度下移可能是局部缺血的指示，因为在人中观察到的相应ST复波的类似下移可表示心肌缺血。U波的面积和振幅如表1所示并在图7A和7B中示出。在-/-小鼠中U波下移由图7B的阴影区表示，这表明-/-动物中的另一异常。在人中，ST复波的下移是心肌局部缺血的指示。在大多数情况下，局部缺血有冠状循环不足导致。-/-动物的心率和体温均正常。表1 来自正常(+/+，n＝4)和VEGF-B缺陷(-/-，n＝4)动物的ECG测量的一些数据基因型+/+ -/-p值PQ间隔 35.7ms 39.7ms 0.014U面积(a.u.1) 4.31 9.62 -U振幅(a.u.1) -0.013 -0.034 -1a.u.任意单位；ms毫秒；对于U面积和振幅，示出的是不同组的平均值上述描述和实施例仅为了举例示出而非限制本发明。因为本领域技术人员理解在本发明精神和实质内可对所公开的实施方案进行修改，因此本发明应被理解为包括在所附权利要求书及其等价物范围内的任何事情。
权利要求
1.一种筛选具有调节心房与心室传导活性的化合物的方法，所述方法包括将所述化合物导入VEGF-B缺陷的非人动物中，并分析在所述动物体内对房室传导的作用。
2.一种筛选具有调节局部缺血活性的化合物的方法，所述方法包括将所述化合物导入VEGF-B缺陷的非人动物中，并分析在所述动物体内对局部缺血的作用。
3.一种治疗或减轻哺乳动物房室传导缺陷的方法，包括给予减轻房室传导缺陷有效量的VEGF-B，或其具有VEGF-B生物活性的片段或类似物。
4.一种治疗或减轻哺乳动物局部缺血的方法，包括给予减轻局部缺血有效量的VEGF-B，或其具有VEGF-B生物活性的片段或类似物。
5.一种治疗或减轻哺乳动物房室传导缺陷或局部缺血的方法，包括给予有效量的编码VEGF-B或其有VEGF-B生物活性的片段或类似物的核酸序列，其中所述核酸能编码有效量的所述VEGF-B，或其片段或类似物，以治疗或减轻房室传导缺陷或局部缺血。
6.权利要求5的方法，其中所述核酸序列可操纵地与一启动子序列连接。
7.权利要求5的方法，其中所述核酸序列克隆入载体中并可操纵地与一启动子序列连接。
8.权利要求7的方法，其中载体是表达载体。
9.权利要求8的方法，其中表达载体选自基于腺病毒，痘苗病毒或逆转录病毒的载体。
10.一种在测试个体中诊断特征在于丧失VEGF-B表达的心脏疾病的方法，包括以下步骤提供来自所述测试个体的第一个DNA样品；提供含有VEGF-B DNA的第二个DNA样品；将第一个DNA样品与一系列特异于VEGF-B DNA的引物接触，所述引物可操作地偶联于聚合酶；将第二个DNA样品与一系列特异于VEGF-B DNA的引物接触，所述引物可操作地偶联于聚合酶；用第一个和第二个DNA样品进行聚合酶链反应；及对比第一个和第二个DNA样品的聚合酶链反应，以确定在所述第一个DNA样品中VEGF-B DNA扩增的缺失。
11.一种在测试个体中诊断特征在于丧失VEGF-B表达的心脏疾病的方法，包括以下步骤提供来自所述测试个体的生物样品；将所述样品与VEGF-B的特异结合试剂接触；及检测所述特异结合试剂结合的丧失。
12.权利要求11的方法，其中特异结合试剂包括VEGF-B的抗体。
13.一种诊断测试个体心脏中VEGF-B缺陷的方法，所述方法包括为所述测试个体作心电图；并与正常心电图相比较，评测所作心电图的PQ间期延长，或ST复波下移。
14.一种检测测试个体心脏中VEGF-B缺陷的方法，所述方法包括为所述测试个体作心电图；并与正常心电图相比较，评测所作心电图的PQ间期延长，或ST复波下移。
全文摘要
VEGF－B缺陷动物显示出似乎由房室(AV)传导缺陷以及心肌局部缺血导致的心脏异常。本发明提供了用VEGF－B缺陷的非人类动物筛选具有调节房室传导或局部缺血活性的化合物,用于治疗或减轻房室传导缺陷或局部缺血,以及用于诊断心脏病。
文档编号G01N33/566GK1342264SQ00804556
公开日2002年3月27日 申请日期2000年3月3日 优先权日1999年3月3日
发明者卡琳·奥瑟, 彼得·托伦, 乌尔夫·埃里克松 申请人:路德维格癌症研究所