微粒及内皮细胞和脱细胞化的器官和组织的用图
【专利说明】微粒及内皮细胞和脱细胞化的器官和组织的用途
[0001] 巧关申请的香叉引用
[0002] 本申请要求于2013年3月15日提交的美国申请序列号61/790, 118的权益，将其 公开内容W引用的方式并入本文。
[0003] 发巧背景
[0004] 组织工程是通过植入细胞、支架W及可溶性介质的组合来寻求修复或再生损伤或 病变的组织和器官的快速发展的领域。通常在2维（2D)培养条件下实现当前干细胞分化 和原代细胞培养。该系统允许特定细胞群的扩增，但是其维持功能性细胞表型W维持高密 度的细胞培养W及长期原代或分化的细胞功能的能力有限制。例如，相比某些细胞疗法所 需的大量原代细胞的有限可获得性，在保留分化为特定谱系的能力的同时，干细胞的数量 可W大量扩增。对于干细胞命运的控制（例如分化），不管是在体内还是在体外，主要都归 因于基因和分子介质（例如生长因子和转录因子）。尽管干细胞和祖细胞的分化可导致细 胞具有合适的谱系特异的基因表达或组织特异的基因表达，但是分化的细胞可能缺乏体外 或体内应用所需的功能特性。
[000引发巧概沐
[0006]本发明提供在具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的再内皮化和/或 再细胞化（用除内皮细胞外的细胞）的细胞外基质中，维持毛细血管腔直径、降低毛细血 管腔直径的减小或增大毛细血管腔直径的方法，例如确保移植后合适的毛细血管直径W维 持连续的血液流动。该方法包括提供或制备具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部 分的脱细胞化的细胞外基质，W及提供或制备内皮细胞群体或能够分化成内皮细胞的干细 胞群体或祖细胞群体。向脱细胞化的细胞外基质中同时引入或顺序引入一定量的细胞和一 定量的含有生物相容性纳米颗粒或微粒的第一水性溶液。细胞的量能有效地将脱细胞化的 细胞外基质的脉管系统的再内皮化，并且在再内皮化期间或在其之后，相对于相应的缺少 纳米颗粒或微粒的再内皮化脱细胞化的细胞外基质，当通过脉管系统循环时，，纳米颗粒或 微粒的量维持脉管系统的毛细血管腔直径，或降低脉管系统的毛细血管腔直径减少，例如 降低至约4微米，或增加脉管系统的毛细血管腔直径，例如高达约15至约20微米。在一个 实施方案中，纳米颗粒或微粒是生物可降解的。在一个实施方案中，在加入添加剂（added agent)或能量源之后，纳米颗粒或微粒是可快速生物降解的。在一个实施方案中，纳米颗 粒或微粒不是生物可降解的。纳米颗粒可由任何生物相容性材料形成，并且可W是允许其 通过脉管系统的任何形状。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒的形状是球形的或楠圆形 的。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒的平均直径是约0. 5ym至约30ym或约5ym至 约20ym。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒是可变形的。在一个实施方案中，纳米颗粒 或微粒由聚合物形成，所述聚合物包括天然存在的和合成的（非天然存在的）聚合物。在 一个实施方案中，纳米颗粒或微粒由蛋白和非蛋白聚合物形成。在一个实施方案中，对纳米 颗粒或微粒进行修饰，W使其包含簇化物、醋、胺、醒、醇或面化物W及功能分子，如磁性分 子的配体。在一个实施方案中，添加外部能量源，例如，但不限于：降解颗粒的光、磁、机械力 或超声。在一个实施方案中，在再内皮化之后添加水性溶液。在一个实施方案中，通过用另 一溶液洗涂再内皮化的脉管系统来移除纳米颗粒或微粒，所述溶液不含所述颗粒，并且可 含有降解颗粒的物质。在一个实施方案中，所述方法包括引入含有生物相容性纳米颗粒或 微粒的第二水性溶液，所述纳米颗粒或微粒的平均直径比第一溶液中的纳米颗粒或微粒的 平均直径大至少10%。颗粒的浓度可W发生变化，并且可W是实现目的的任何量。例如，每 yL的第一溶液可包含约300至约50, 000, 000个颗粒。
[0007] 脱细胞化的细胞外基质可来自任何器官或组织，只要所述器官和组织具有允许溶 液循环进入其血管导管并循环流出其血管导管的完整的血管（毛细血管）床（"完整的" 脉管系统）。在一个实施方案中，脱细胞化的器官为脱细胞化的屯、脏、膜腺、肝脏、肾脏、骨或 肺。可使用能够将具有完整脉管系统的脱细胞化的器官、组织或其部分的细胞外基质脉管 系统再内皮化的任何细胞类型。例如，所述细胞可W是从iPS细胞获得的。在一个实施方 案中，通过注射或灌注或它们的组合将细胞引入基质。在一个实施方案中，通过注射或灌注 或它们的组合将细胞引入脉管系统。在一个实施方案中，向脱细胞化的细胞外基质中引入 的细胞是原代细胞。在一个实施方案中，向脱细胞化的细胞外基质中引入的细胞是意图将 器官、组织或其部分完全或部分再细胞化的多种不同的细胞类型。在一个实施方案中，向脱 细胞化的细胞外基质中引入的细胞是人胚胎干细胞。在一个实施方案中，细胞与灌注的脱 细胞化的器官、组织或其部分是同种异体的。在一个实施方案中，细胞与灌注的脱细胞化的 器官、组织或其部分是异种的。
[0008] 附图简要说巧
[0009] 图IA显示了灌注脱细胞化的猪肝脏的照片。
[0010] 图IB-C分别显示了灌注脱细胞化的猪肝脏的血管和实质基质的扫描电子显微镜 (SEM)照片。
[0011] 图2提供了浸入脱细胞化的大鼠肝脏的总视图，其中在低放大倍数（左）和高放 大倍数（右）下均可观测到基质磨损。
[001引图3显示了浸入脱细胞化的大鼠肝脏的沈M照片（A和B)W及灌注脱细胞化的大 鼠肝脏的沈M照片（C和D)。
[0013] 图4提供了浸入脱细胞化的肝脏的组织结构（A，H&E染色；B，=色染色）和灌注脱 细胞化的肝脏的组织结构（C，H&E染色；D，=色染色）。
[0014] 图5显示了大鼠屯、脏的浸入脱细胞化（顶行）与灌注脱细胞化（底行）的比较。
[0015] 图6显示了利用大鼠肾脏的浸入脱细胞化（顶行）与灌注脱细胞化（底行）的比 较。
[001引图7显示了脱细胞化的肾脏的沈M照片。
[0017] 图8A显示了灌注脱细胞化的屯、脏的沈M照化同时图8B显示了浸入脱细胞化的 屯、脏的沈M照片。
[001引发巧详沐
[0019] 本发明提供工程化的细胞和ECM，其通过物理W及分子相互作用，经由控制那些细 胞的环境而直接控制细胞行为。特别地，本发明提供工程化的具有灌注脱细胞化的ECM的 器官、组织或生物反应器，所述灌注脱细胞化的ECM移植有包含细胞组合的细胞群体，并经 历了例如包括灌注可溶性介质的培养条件，该ECM结构和培养条件产生与相应的原始器官 基本相同的功能细胞和毛细血管腔直径，例如约5ym至约10ym或约3ym至约20ym。特 别地，由于维持了毛细血管腔直径，本发明可W为成人细胞和胚细胞W及部分分化的祖细 胞的细胞分化、生长和表型表达提供改善的调节，W及为分化的细胞类型提供改善的维持。 还包括原代细胞的生长和功能维持，所述原代细胞包括胎儿来源的细胞，例如从胎儿细胞 或新生儿细胞中获得的器官特异的细胞（例如定型至特定谱系但未终末分化的细胞）。
[0020] 本发明提供灌注脱细胞化的器官或组织来源的细胞外基质巧CM)的用途W及在 运些基质的细胞外基质脉管系统中可用于支持W下的系统：具有血管（例如内皮的）细胞 的运些基质再细胞化，或干细胞或祖细胞分化和/或成熟为内皮细胞，或原代细胞的维持 或分化，或它们的任何组合。原代细胞是从生物体中获得的细胞，然后，通常将其进行体外 培养，但是那些细胞不能无限增殖。分化的细胞包括原代细胞和已经体外分化的细胞，例如 本发明的灌注脱细胞化的基质中的干细胞或祖细胞。在一个实施方案中，至少5%、10%或 20%或更多的分化细胞具有功能上成熟的表型。组织是具有共同结构和功能的细胞群体， 例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织（骨骼肌、屯、肌或平滑肌）W及神经组织，并且包括覆 盖或内衬或连结器官的柔软的层。器官是W结构单元连接在一起的行使共同功能的一些组 织（两种或更多种）。器官包括但不限于：脑、肝脏、膜腺、骨、屯、脏、胃、肾脏、肺、全身肌肉、 胸腺、肛口和肠。如本文使用的，器官包括可灌注的全部器官或器官的部分或其血管化的结 构，组织包括含有血管化的组织的任何结构，例如气管。
[0021] 在一个实施方案中，本发明提供器官或组织特异的细胞外基质巧CM)支架在再内 皮化中的用途，该用途利用可需要分化或成熟的细胞，如干细胞或祖细胞。分化是一个过 程，细胞通过该过程获得不同于原始细胞群体的新表型，例如不同的细胞基因和/或蛋白 表达和/或功能。成熟进一步将细胞群体的表型阐明为具有体内细胞群体中的细胞的正常 成熟功能能力。在一个实施方案中，支架是器官的灌注脱细胞化的ECM部分。在另一实施 方案中，支架是灌注脱细胞化的ECM器官。
[0022] 与其它脱细胞化技术（如基于浸入的脱细胞化）相比，来自器官或组织的灌注脱 细胞化的ECM保留了更多的天然微结构，包括完整的血管和/或微血管系统。例如，来自器 官或组织的灌注脱细胞化的ECM保留了胶原含量W及其它结合和信号因子W及脉管系统 结构，因而为引入的细胞的功能分化或细胞功能维持提供了具有天然诱因的生态位环境。 在一个实施方案中，在合适的条件（包括合适的压力和流量）下，利用灌注脱细胞化的ECM 的脉管系统，用细胞和/或介质灌注来自器官或组织的灌注脱细胞化的ECM，W模拟通常存 在于生物体中的条件。人体尺寸的器官的正常压力为约40至约200mmHg,其中产生的流 动速率取决于进入的灌注血管直径。对于正常的人体屯、脏，产生的灌注速率为约20至约 200mL/min/100g。利用此系统，接种的细胞可达到的接种浓度比在2D细胞培养条件下达到 的接种浓度大约5x至高达约1000 x并且不像2D培养系统，ECM环境允许细胞进行进一步 的功能分化，例如祖细胞分化成显示具有持续功能的器官或组织特异表型的细胞。在一个 实施方案中，培养条件与ECM来源的组合允许引入至ECM的细胞进行功能分化。
[0023] 在一个实施方案中，方法包括选择器官或组织的灌注脱细胞化的基质W及包含内 皮细胞的细胞群体或能够分化成内皮细胞的祖细胞的细胞群体。在一定条件下，将选择的 灌注脱细胞化的基质与细胞群体接触一段时间，来为灌注脱细胞化的基质提供再细胞化， 并且使细胞群体中的祖细胞分化成功能细胞。在一个实施方案中，引入纳米颗粒和微粒，并 使其与细胞一起通过脉管系统进行循环。在一个实施方案中，在再内皮化之后，引入纳米颗 粒和微粒，并使其通过脉管系统进行循环。在一个实施方案中，所述器官为屯、脏。在另一实 施方案中，所述器官为肝脏。在另一实施方案中，所述器官为膜腺。在另一实施方案中，所 述器官为肺。
[0024] 在一个实施方案中，本发明提供在再内皮化的灌注脱细胞化的基质中维持毛细血 管腔直径的方法。所述方法包括选择器官或组织的灌注脱细胞化的基质W及能够分化成内 皮细胞或内皮细胞的干细胞群体。在一定条件下，将选择的灌注脱细胞化的基质与细胞接 触一段时间来为灌注脱细胞化的基质提供再内皮化，并且提供内皮细胞或者使群体中的干 细胞分化成功能性内皮细胞。在一个实施方案中，干细胞为诱导的多能干（iP巧细胞。在 一个实施方案中，干细胞为胚胎干巧巧细胞，例如，人ES细胞。在一个实施方案中，干细胞 为成体干细胞。
[00巧]在一个实施方案中，本发明的方法使用器官或组织ECM的一部分，例如屯、脏的屯、 房或屯、室，或者膜腺的内部结构，包括膜岛。在一个实施方案中，所述部分的厚度为约5至 约10mm。在一个实施方案中，所述部分的厚度为约70至约100mm。
[0026] 可从任何来源获得ECM器官或组织基质，所述来源包括但不限于屯、脏、肝脏、肺、 骨骼肌、脑、膜腺、脾脏、肾脏、子宫、眼睛、脊髓、全身肌肉或膀脫，或其任何部分（例如主动 脉瓣、二尖瓣、肺动脉瓣、=尖瓣、肺静脉、肺动脉、冠状脉管系统、隔膜、右屯、房、左屯、房、右 屯、室或左屯、室）。实体器官是指具有"基本闭合的"脉管系统的器官。关于器官的"基本闭 合的"脉管系统意为，假设主要的血管被插管、被结扎或者W其它方式受限制，在用液体灌 注后，大部分液体包含于实体器官中或从天然血管结构中流出，并且不从实体器官中漏出。 尽管具有"基本闭合的"脉管系统，上文列出的许多器官具有确定的"入口 "或"出口 "血管， 在灌注期间，可将其用于引入液体W