专利名称：抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体制备及其应用。
背景技术：
近年发现，ATP合成酶不仅存在于线粒体内膜，在内皮细胞和肿瘤细胞质膜表面也有表达。1995年，Mozer和Pizzo对血管抑素(环饼域1- 在内皮细胞表面的结合位点进行了鉴定。通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)膜组分进行配体杂交，成功分离了与血管抑素结合的，大小约^kD的蛋白。通过对蛋白进行氨基末端测序、肽指纹图谱及免疫学分析表明，抗肿瘤血管新生药血管抑素在该细胞表面的受体为人FlFO-ATP合成酶的α/β亚基 (基因名分别为ΑΤΡ5Α1和ΑΤΡ5Β)。这一受体在细胞表面的存在通过流式细胞术和免疫荧光分析得到了证实。另外，血管抑素能与重组ΑΤΡ5Α1结合，抗ΑΤΡ5Α1的抗体能将血管抑素的抗细胞增殖效果抑制掉90 %。综上所述，细胞表面的ΑΤΡ5Α1/ΑΤΡ5Β是血管抑素在内皮细胞表面的受体，血管抑素可能通过与ΑΤΡ5Α1/ΑΤΡ5Β亚基的结合，抑制内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制血管新生。传统认为，人FlFO-ATP合成酶仅存在于细胞线粒体内膜，但Mozer的发现表明其在内皮细胞表面也有定位。在Mozer的研究公开前，关于FlFO-ATP合成酶在细胞膜表面定位的报道仅有一例，是定位于肿瘤细胞系Α549的表面。在Mozer的研究公开后，血管抑素与细胞表面ATP合成酶的结合，又被其它的研究团体在不同的肿瘤细胞类型证实。在除内皮细胞外的许多其它类型细胞，包括肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞都发现了定位于细胞膜表面的FlFO-ATP合成酶，这些类型的细胞都具有较强的增殖力，而在红细胞中未发现。这提示FlFO-ATP合成酶也许能作为肿瘤标志物来检测，对肿瘤的早期诊断和预后具有重大的意义。在Das和Mozer提出哺乳动物细胞存在将某些线粒体蛋白定位于胞膜表面的现象后，涌现出大量有关线粒体基质蛋白定位于胞膜的报道，而这些蛋白在其异常定位上往往也是有某种功能的，如蛋白Ρ32，又名gClq，是补体蛋白Clq的受体，提示定位于胞膜表面的 FlFO-ATP合成酶也在行使某种特殊的功能。在Mozer的研究中，膜表面的FlFO-ATP合成酶作为血管抑素抑制增殖的靶点而被发现，随后发现的具有膜表达人FlFO-ATP合成酶的细胞都属于增殖力较强的类型，提示膜表达的人FlFO-ATP合成酶可能具有促增殖作用，不仅是肿瘤的标志，还可能是癌变的促因。如果能成功验证膜表达的人FlFO-ATP合成酶对肿瘤的促进作用，将使其肿瘤靶标的地位进一步巩固，并可针对其促增殖功能设计相应的药物进行抑制，以期特异高效地治疗肿瘤。Chi等用纯化的E. coli Fl-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株单克隆抗体(mAb)，其中只有一株mAb是针对催化亚基ATP5B的，其余20株均是针对非催化亚基ATP5A1的，而只有针对β亚基的那株mAb具有抑制Fl-ATP合成酶活性的作用。而Mozer之前的研究报道， 血管抑素在HUVEC表面的受体由ATP5A1和ATP5B共同构成，故本研究着重对ATP5A1亚基的肿瘤相关性进行，并针对ATP5B亚基制备mAb并进行人源化，以期开发相应的抗体药物。19世纪末，人们用癌细胞免疫动物产生抗血清来治疗癌症。然而，由于抗血清是多克隆抗体，其中含有众多分别针对不同抗原的抗体，缺乏特异性，故用其治疗癌症不可能取得确切的疗效。20世纪后期，Georges Kohler和Cesar Milstein用细胞杂交技术使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合(图1-1)，建立了世界上首株B细胞杂交瘤细胞株，该细胞株能长期、稳定地分泌特异、均质的抗SRBC的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)0这一技术获得1984年的诺贝尔生理医学奖。mAb对抗原的高特异性使定向攻击肿瘤细胞成为可能。之后的数十年里，mAb在疾病诊断领域成为常规试剂，而在治疗领域对其的研究也迅速升温。在20世纪末期，由于目前技术的局限，制备的多为鼠杂交瘤，产生的mAb就多为鼠源性，在人体中极易产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，使mAb用于治疗的研究受到限制，进入了低谷阶段。于是，研究者把基因工程技术引入单抗研究，探索通过基因操作的手段将鼠源mAb 嵌合或人源化。最早报道的基因工程抗体是莫里森(Morrison)等研制的人-鼠嵌合抗体， 该技术对抗体的临床应用影响深刻。嵌合抗体是通过基因工程将鼠源单抗可变区和人抗体恒定区拼接的抗体，相对于其它人源化抗体的优点在于其技术路线简单；抗体完整性好，体内潴留期长。利妥昔单抗(rituximab)于1997年获得FDA批准，是全球第一个上市的抗肿瘤mAb药物，用于治疗CD20阳性的B淋巴细胞性非霍奇金淋巴瘤，该抗体就是一个嵌合抗体。第一个用于临床的嵌合抗体是阿来组单抗(alemtuzumab)，用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和类风湿性关节炎。曲妥珠单抗(trastuzumab)于1998年获批，是一种可以抑制HER-2/neu 阳性乳腺癌的mAb药物，该抗体是一个人源化抗体。吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin) 于2000年获批，用于治疗CD33阳性的急性复发性髓性白血病，该抗体也是一个人源化抗体。近年来，先后获批用于治疗肿瘤的抗体药物还有90Y-ibritumomab、131I-tositumomab、 cetuximab和bevacizumab等，其中嵌合或人源化的抗体所占的比例逐年提升，全人抗体已成为治疗类抗体在抗体类型上必然趋势。目前已有超过20种嵌合抗体已进入临床试验阶段，还有为数众多的嵌合或人源化抗体处于临床前研究中。嵌合抗体可变区基因的克隆，通常是参考Kabat数据库中的抗体序列，针对抗体可变区的保守区域设计若干套通用引物，采用RT-PCR法从杂交瘤细胞株的mRNA扩增可变区基因，该方法简单实用。通常5’端通用弓I物设计在第一骨架区或前导肽区；3，端通用弓丨物设计在恒定区或J链区。嵌合抗体恒定区由抗体亚型决定，不同的亚型具有不同的免疫效应，故可根据需要的免疫效应选择不同的亚型恒定区进行扩增。IgGl适于介导抗体依赖的细胞毒作用 (ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)，而IgG2和IgG4则适于激活或阻断某一受体。抗体的恒定区不仅能提供效应功能，还能通过于组织细胞表面的IgGFc受体Fc y Rn结合，免受蛋白酶类降解，在体内保持较长半衰期(20多天)。嵌合抗体的重轻链表达单位可串联于一个表达载体上，也可分别构建于两个载体上共转染，有文献报道，串联表达载体的转化子中产生抗体的克隆的比例，显著高于共转染表达载体。目前用于增加目的基因扩增的筛选标志主要有二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)两种。而用于临床治疗用抗体表达的系统主要是CHO细胞系统，该系统能为嵌合抗体的恒定区提供有效的糖基化。文献报道，通过选择有效的表达载体和筛选系统， 抗体表达量可提高到300-900mg/L。嵌合抗体技术与其它人源化技术比，具有构建周期短，不易引起亲和力降低等优势，因而本研究在进行人源化改造时优先考虑嵌合抗体的技术路线。
发明内容
本发明的目的是公开一种抗血管抑素受体人源化嵌合抗体，以及编码该抗体的 DNA序列，构建了含该DNA序列的真核细胞表达载体，筛选并保存了稳定高表达该抗体的宿主细胞株，建立纯化该抗体的工艺方法。并公开了上述抗体与同类产品的比较的检测结果。本发明第一方面公开了一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体，包括抗体轻链元件和抗体重链元件，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO :1或其保守型变异序列，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO :2或其保守型变异序列，重链和轻链通过二硫键连接。本发明第二方面公开了一种分离的DNA分子，编码前述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。本发明第三方面公开了一种载体，含有前述分离的DNA分子。本发明中的表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。具体的，所述载体可为pCI-neo寸。本发明第四方面公开了一种宿主细胞，它含有前述载体。本发明中的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0，或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。较佳的，该宿主细胞是CHO细胞，保存号为20089278。本发明第五方面，公开了前述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法， 为在表达所述抗体的条件下，培养前述宿主细胞，从而表达出所述的抗体，和纯化分离所述的抗体。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法〔如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理〔盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC〕和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明从单克隆培养的细胞株中筛选获取目的抗体的基因序列，用以构建真核表达载体，表达后即可重建抗体的活性，获得抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体。本发明第六方面，公开了上述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体在制备抗肿瘤类药物上的用途。
本发明第七方面，公开了一种药物组合物，包括治疗有效量的前述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味齐 。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用抑制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的单克隆抗体可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。本发明还进一步对抗血管抑素受体单克隆抗体通过体外活性测定和动物实验研究了该抗体在动物体内的治疗有效性。本发明提供的抗血管抑素受体的单克隆抗体为嵌合抗体，在保持其抗血管抑素受体活性的同时，使之更适合体内应用。该单抗具有与肿瘤细胞膜表面天然抗原结合活性，并可明显抑制肿瘤细胞膜表面ATP合成，对抗肿瘤治疗有重要的意义。
图1 实施例3对Α549细胞M小时抑制增殖作用试验结果图2 实施例3对Α549细胞48小时抑制增殖作用试验结果图3 实施例3对Α549细胞48小时抑制增殖作用试验结果图4 实施例3对Α549细胞72小时抑制增殖作用试验结果图5 实施例3对95-D细胞48小时抑制作用试验结果图6 实施例3本发明抗体对Α549细胞抑制ATP酶合成活性试验结果图7 实施例3本发明抗体对95-D细胞抑制ATP酶合成活性试验结果
具体实施例方式下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆试验手册中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。实施例1嵌合抗体的制备以经人ATP合成酶抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞常规融合获得杂交瘤细胞株，从中筛选出一株阳性克隆杂交瘤细胞株7Ε10。取阳性克隆杂交瘤7Ε10细胞株5000-10000个细胞，用Trizol (Invitrogen公司产品)分离总RNA，使用反转录酶(Invitrogen公司产品)以获取cDNA。上述操在均按照厂家说明书进行。用下述引物和条件进行PCR，所用扩增酶为KOD plus (Τ0Υ0Β0)确保扩增过程中减少可能的突变。
6
抗体Fab区的扩增引物为4组，分别为mouse IgG_5，/mouse IgG1-3‘, mouseIgG-5‘ /mouse IgG2a-3‘, mouse IgG-5' /mouse IgG3-3', (LCi+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mouse kappa-3，，延伸时间 lmin。PCR 产物电泳回收， 并克隆至载体PMD19-T测序。根据Fab区测序结果设计引物，扩增可变区，并克隆至载体 PMD19-T 测序。PCR 条件a)反应体系的组成cDNAIuldNTP0. 5ulMgcl222ulBuffer2ulPrimer F0. 5ulPrimer R0. 5ulKODpIus0. 5ulH2O13ul20ul上机反应
94 °C 5min
94 °C 15sec-
50 °C 30sec40 cycle
72 °C lmin 72 °C IOmin--
4 °C...表1嵌合抗体相关引物设计扩增鼠重 mouse IgG-5，AGGTCCARCTKCTCGAGTCWGG(RA/G, KG/'T, WA/T) (SEQ ID N0:6)
链 Fab 区 mouse IgGl-3'AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT (SEQ ID NO:7)
mouse IgG2a-3''GTTCTGACTAGTGGGCACTCTGGGCTC (SEQ ID NO:8)
mouse IgG3-3'GGGGGTACTAGTCTTGGGTATTCTAGGCTC (SEQ ID NO:9)
扩增鼠轻 LClCCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT (SEQ ID NO: 10)
链 Fab 区 LC2CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC (SEQ ID NO:11)
LC3CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA (SEQ ID NO:12)
LC4CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA (SEQ ID NO:13)
LC5CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA (SEQ ID NO:14)
l,C6CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA (SEQ TD NO: IS)
LC7CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA (SEQ ID NO:16)
mouse kappa-3，GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA (SEQ ID NO:17)
轻链鼠信 7F10LP1a.t|GCTAGC|GCCGCCACCATGGACATGCGGGTT (SF.Q TD NO: 18)
号肽、可变 7E10L P2:AGCTCGCACCGTGCTCCGCGCAGCCA (SEQ ID NO: 19)
区与人恒 7E10L P3:TGCGCGGAGCACGGTGCGAGCTCGTGAT (SEQ ID KO:20)
定区拼接 7E10L P4:GCCACCGTACGGGTGCAGAAATAAATTCCCAGAT (SEQ ID NO:21)
7E10L P5ATCTGGGAATTTATTTCTGCACCCGTACGGTGGC (SEQ ID N0:22)
7E10L P6:tc|AAGCTTACGCGT|cTAACACTCTCCC (SEQ ID N0:23)
重链鼠信 71ilOLHI)l:at|GAATTC|GCCGCCACCATGGAGTTCGGAC:r (SEQ ID NO: 24)
号肽、可变 7E10LH P2:TGACTCGAGCAGCTGGACCTCACACTGCACACCCTTCAGGAT (SEQ ID NO:25)
R 与人恒 7E10LII P3:ATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCA (SEQ ID N0:26)
定区拼接 7E10LH P4:CCTTGGTGGAGGCACTTGCACAGTAATAGACTGCA (SEQ ID NO:27)
7E10LII P5:TGCAGTCTATTACTGTGCAAGTGCCTCCACCAAGG (SEQ ID NO:28)
7E10LH P6:at|GCGGCCGC[rCATTTACCCGGAGACA (SEQ ID N0:29)杂交瘤细胞信号肽区扩增根据对重、轻链Fab区序列分析结果设计引物，应用cRACE法扩增杂交瘤细胞的信
号肽区。PCR产物电泳回收，并克隆至载体PMD19-T获得pMD19-7E10L及pMD19_7E10H，测
序。人IgGl重、轻链恒定区扩增人IgGl重、轻链恒定区基因进行PCR扩增，并克隆至载体PMD19-T测序。拼接构建嵌合重链和嵌合轻链基因分别利用7E10LP1-P6的这组引物及7E10LHP1-P6这组引物，以7E10反转录所获
得的cDNA为模板，使用拼接PCR(S0E-PCI )将7E10的信号肽区、可变区、人IgGl的重、轻链
恒定区进行拼接获得嵌合重链和嵌合轻链基因。将两者的PCR产物电泳回收，并克隆至载
SEQ ID NO 1嵌合轻链序列NheI 位点 +Kozak 序歹 1丨 + 信号肽 +FRl+ |CDRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CL+MluI核苷酸序歹Ij(SEQ ID NO 3)GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGC GGAGCACGGTGCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCT TGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCT CCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACA GATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCACCCGTACGGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGACGCGT AAGCTT氨基酸序列(SEQID NO 1)MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCELVMTQTPLSLPVSL⑶QASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGIYFCTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. 2 24aaSEQ ID NO 2 嵌合重链重链EcoRI—NotIEcoRI 位点 +Kozak 序列 + 信号肽 +FRl+ |CDRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CH+NotI核苷酸序列(SEQID NO :4)GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAG TGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCT GGATTCACATTCACTGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATT
9TATCCTTACAATGGTGCTACTGGCTACAACCAGAACTTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAGTTCCTCCAGT ACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGC氨基酸序列(SEQID NO 2)EFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGPELVKPGASVKISCKTSGFTFTDY匪HWVKQSHGKSLEWIGYI YPYNGATGYNQNFKNKATLTVDSSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDff
LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.448aa在测序获得重、轻链可变区序列后，可以通过全合成或者拼接PCR的方法来获得含有重、轻链可变区的序列的嵌合重链和嵌合轻链基因，此技术为本技术领域的技术人员所熟知。嵌合抗体的真核表达载体pCI-7E10H、pCI_7E10L、pCI_7E10LH的构建用NheI和MluI分别酶切嵌合轻链克隆载体pMD_7E10L及表达载体pCI-neo，电泳回收后，T4连接酶16°C连接池。连接产物转化T0P10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆PCI-7E10L。用EcoRI和NotI分别酶切嵌合重链克隆载体pMD_7E10H及表达载体pCI-neo，电泳回收后，T4连接酶16°C连接池。连接产物转化TOPlO感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆PCI-7E10H。同时构建嵌合表达载体，将polyA和CMV克隆至pMD_19T载体，两端分别添加 MluI和NotI酶切位点，在CMV序列之后、NotI酶切位点之前添加EcoRI位点，用EcoRI 和NotI酶切嵌合重链克隆载体pMD-7E10H，将重链片段切下，电泳回收目的片段。同时， EcoRI和NotI酶切pMD-polyA-CMV，T4连接酶16°C连接2h。连接产物转化TOPlO感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pMD-polyA-CMV-7E10H。pCI-neo、 pMD-polyA-CMV-7E10H 用 MluI 和 NotI 双酶切，电泳回收 pCI-neo 和 polyA-CMV-7E10H 片段，T4连接酶16°C连接池。连接产物转化T0P10感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pCI-polyA-CMV-7E10H。用NheI和MluI双酶切pMD_7E10L、 pCI-polyA-CMV-7E10H,电泳回收酶切产物，T4连接酶16°C连接2h。连接产物转化T0P10 感受态细菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后，筛选出阳性克隆pCI-7E10LH。表达载体 PCI-7E10LH中NheI位点与NotI位点之间的全长序列如下全长序列SEQ ID NO 5NheI 位点 +Kozak 序歹丨J + 信号肽 +FRl+ ^DRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CL+MluI +Po 1 γΑ+Pcmv+ EcoRI 位点 +Kozak 序列 + 信号肽 +FRl+ |CDRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CH+NotIGCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGC GGAGCACGGTGCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCT TGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCT CCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACA GATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCACCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (轻链全长)ACGCGT (MluI 位点)ttccctttagtgagggttaatgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccac aactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctg
C 3.3. 3.3.3. C 3.agttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaag caagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatccgataagg(PolyA)tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccatt gcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgatt attgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataact tacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagt aacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagt gtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgac cttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagta caccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgtt ttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgccccgttgacgcaaatgggcggt aggcgtgtaCRRtRRRaRRtctatataaRcaRaRctCRtttaRtRaaccRtcaRatcactaRaaRctttattRCRRta gtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagtgactctctt aaggtagcc
ttgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacca atagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactt tgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactata RRCtaRCCtCRa (Pcmv)GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAG TGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCT GGATTCACATTCACTGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATT TATCCTTACAATGGTGCTACTGGCTACAACCAGAACTTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAGTTCCTCCAGT ACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGC (重链全长)CH0-DG44细胞培养、转染与加压筛选CH0-DG44 细胞采用含 10% FBS,0. 03mmol/L 次黄嘌呤(H)、0. 003mmol/L 胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0. lmmol/L 脯氨酸(Pro)、0. lmmol/L 甘氨酸(Gly)、2mmol/L 谷氨酰胺、100U/ ml青链霉素的F12完全培养基在37°C、5%C02培养，常规按1 4传代。7E10嵌合表达质粒(pCI-7E10LH)的转染1)质粒抽提。2)细胞瞬时转染细胞转染按LipOfeCtamineTM2000操作说明书进行，以6孔板中的1孔为例，简要步骤如下向该孔接种4X105细胞，37°C、5% CO2培养1 后换液 1次，12h后开始转染，贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95%。将4μ g质粒DNA和 10 μ lLipofectamine 2000分别用无抗生物、无血清的培养基稀释至250 μ 1，温和混勻，室温静置15min形成脂质体复合物。用PBS洗涤细胞一次，并加入aiilF12作培养基，再滴入脂质体复合物，将板前后振荡，温和混勻。37°C、5% CO2培养Mi后更换5ml含10% FBS的 F12完全培养基培养48-7池，之后用不含H、T、Gly的无血清培养基EX-CELL 302培养以筛选dhfr+表型的细胞克隆。将在EX-CELL 302中培养的细胞消化，计数，按1. 5个细胞/孔接种于96孔培养板中进行亚克隆，采用羊抗人IgG(H+L)多抗包被的夹心ELISA筛选嵌合抗体高表达的克隆。挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆，按1 5传代后换含30nmol/L氨甲喋呤(MTX)的 EX-CELL302选择培养基进行培养。待细胞适应了 30nmol/L MTX后，如前所述继续进行亚克隆，筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆，按同样方法相继换含lOOnmol/L MTXU μ mol/L MTX的EX-CELL 302选择培养基进行培养，进行亚克隆，待96孔板细胞基本长满后，换液继续培养2d，取上清测定其嵌合抗体含量，以此法筛选嵌合抗体表达最高的细胞克隆。将细胞克隆移至25cm2培养瓶中扩大培养，待细胞长满后，换液继续培养4天，取上清测定其嵌合抗体含量，并以此次测得的抗体含量值为准，挑选嵌合抗体表达最高的细胞克隆E1，经测序鉴定表达嵌合抗体的氨基酸序列符合预期。本发明构建了抗血管抑素的人鼠嵌合抗体基因，并在CH0-DG44细胞成功表达，表达产物之后简称7E10。表达产物保持了亲本鼠抗的抗原结合性，同时在恒定区以人源代替了鼠源，在分泌克隆上清中表达量为40ng/ml。ELISA检测7E10的表达1)间接ELISA检测7E10的抗原结合性和人源性，每个样品都用羊抗人 IgG (H+L) -HRP酶标二抗和羊抗鼠IgG (H+L) -HRP分别进行检测。2)双抗体夹心ELISAdSW 10 μ g/ml的羊抗人IgG (H+L)多抗包被酶标板过夜，以羊抗人IgG(H+L)-HRP酶标二抗。以rhATP5B包被酶标板进行间接ELISA实验，用羊抗人IgG(H+L)-HRP为二抗时， 转染细胞克隆El培养上清中的7E10既可结合包被的rhATP5B，也可被羊抗人IgG (H+L)识另IJ，呈现阳性反应。用羊抗鼠IgG(H+L)-HRP为二抗时，亲本m7E10呈阳性反应，而嵌合抗体 7E10呈阴性反应(结果见表2。这证明7E10含有人抗体的恒定区片段，并与m7E10 —样可以结合rhATP5B。表2间接ELISA检测转染细胞株嵌合抗体7E10的抗原结合性和人源性A 羊抗人 IgG(H+L) -HRP 为二抗，B 羊抗鼠 IgG(H+L)_HRP 为二抗
权利要求
1.一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体，包括抗体轻链和抗体重链，其抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO :1或其保守型变异序列，其抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO 2或其保守型变异序列，重链和轻链通过二硫键连接。
2.一种分离的DNA分子，编码权利要求1所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。
3.一种载体，含有权利要求2所述分离的DNA分子。
4.一种宿主细胞，它含有权利要求3所述载体。
5.如权利要求1所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法，为在适合表达所述抗体的条件下，培养权利要求4所述宿主细胞，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。
6.如权利要求1所述抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体在制备抗肿瘤类药物上的用途。
全文摘要
本发明公开了一种抗血管抑素受体人鼠嵌合单克隆抗体，包括抗体轻链元件和重链元件，重链和轻链通过二硫键连接。本发明提供的单克隆抗体为嵌合抗体，在保持其抗人ATP合成酶活性的同时，更适合体内应用。该抗体对乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用比较明显，对肺癌A549细胞，肝癌HepG2细胞，前列腺PC-3,HUVEC细胞的增殖均有不同程度的抑制效果，能引起相关细胞的凋亡，并特异结合于肿瘤组织，特异性识别肿瘤细胞和内皮细胞膜。此外，该抗体能抑制肿瘤和内皮细胞膜表面ATP合成酶活性，抑制细胞体外血管枝形成，抑制HUVEC细胞和乳腺癌细胞株MDA-MB-231的体外移行，对抗肿瘤治疗有重要的意义。
文档编号C07K16/28GK102464720SQ201010541538
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者倪健, 朱向玲 申请人:苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司