专利名称：一种动物磁性铁蛋白材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及磁性纳米材料的仿生合成技术领域。特别是涉及一种生物蛋白矿化模板合成直径小于IOnm的动物磁性铁蛋白材料。本发明还涉及制备上述材料的方法。
背景技术：
超顺磁磁铁矿(狗304)或者磁赤铁矿(Y -Fe2O3)颗粒具有高的饱和磁化强度，纳米尺寸效应，并有良好的机械性能和化学稳定性。因此被广泛地应用于磁记录存储、磁流体、 催化和生物医学，例如磁靶向药物、磁共振造影增强剂、细胞标记分离、DNA分离、疾病诊断，等技术领域。然而粒径分布、矿物相和颗粒间有无相互作用是决定纳米磁性颗粒特性和功能的重要因素，因此，如何合成粒径均一、矿物相单一和单分散性的磁性纳米颗粒一直是制备工艺技术领域的研究热点。铁蛋白是一种重要的铁矿化蛋白，广泛分布于微生物、植物和动物体内。在生物体内的铁代谢过程中起着贮存和解除二价铁离子毒性的双重作用。因此铁蛋白在铁的生物矿化过程中发挥着至关重要的作用。天然铁蛋白是聚合体。它由12-M个蛋白亚基高度自组装形成笼状的蛋白壳，每个蛋白壳内含有一个天然的水合氧化铁内核。其外直径约为12nm， 内直径约为8nm。相比人工合成的磁性材料来说，天然铁蛋白的内核磁性弱，在材料学和医学上没有很强的应用优势。然而利用铁蛋白本身的矿化能力，通过从廉价的肉食动物下水废料中提纯大量的天然铁蛋白作为原材料，再经还原去核后重构新核，可以仿生合成一种具有磁铁矿或者磁赤铁矿内核的磁性铁蛋白。该磁性铁蛋白具有粒度均一、形状一致、矿物相单一和分散性好等很多优点，是一种具有广泛应用前景的理想磁性纳米材料。由于中国人的饮食传统，猪、牛、羊和家禽等肉类是传统的肉食品。然而这些动物经屠宰后剩余大量的下水器官，例如脾脏、肝脏等，常被作为废料处理。其实这些动物的脾脏等器官含有丰富的铁蛋白，是提纯铁蛋白的很好原料。相比目前购买商品化的天然铁蛋白来说，自行纯化动物铁蛋白是很经济环保的方法，且获得产量高。目前提纯单体铁蛋白的方法已经有报道(申请号201010034208. 7)。纯化好的天然铁蛋白首先要在酸性条件和还原剂存在的条件下，经过还原去核形成空壳铁蛋白作为仿生合成磁性铁蛋白的模板。然后再通过控制体外合成的条件在蛋白壳内部形成磁铁矿或者磁赤铁矿颗粒。再经后期离心和分子筛层析处理可以获得无任何相互作用的单体磁性铁蛋白。相比原有的磁性铁蛋白合成方法(U. S. patent 5491219和Moskowitz et al.，1997)，普遍使用商品化的马脾铁蛋白，原材料价格昂贵且种类单一。而且前人实验中使用空气作为氧化剂，难以控制实际溶液中的溶解氧和亚铁离子的比例，因此很难保持产物成分单一，并且无后期分离步骤，无法去除少量的体外矿化副产物和铁蛋白聚集体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物磁性铁蛋白材料。
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本发明的又一目的在于提供一种制备上述材料的方法。为实现上述目的，本发明提供的动物磁性铁蛋白材料，具有完整的动物铁蛋白壳和磁性纳米颗粒核，核的直径在1纳米到8纳米之间，在水以及极性溶剂中具有可分散性和溶解性；核的成分为磁铁矿或者磁赤铁矿；通过下述方法得到1)将动物下水磨浆后过滤离心去除杂蛋白，再经过镍柱和分子筛层析分离出单体天然铁蛋白；幻酸性条件下将天然铁蛋白还原去核为空壳铁蛋白；3)以双氧水为氧化剂加入空壳铁蛋白的溶液中反应，反应条件Fe (II)/H2O2的摩尔比例为彡2 1，pH = 7. 1-11，温度为25_70°C合成动物磁性铁蛋白；4)将合成的动物磁性动物铁蛋白进行分离后得到单分散的和无磁相互作用的动物磁性铁蛋白颗粒。所述的动物磁性铁蛋白材料，其中每个动物铁蛋白壳内的磁性纳米颗粒数在 100-5000。本发明提供的制备上述动物磁性铁蛋白材料的方法，主要步骤为1)将动物下水搅拌磨浆后超声破碎组织细胞，热变性过滤离心去除杂蛋白，再经过镍柱和分子筛层析分离出单体天然铁蛋白；2)酸性和无氧条件下将天然铁蛋白还原去核为空壳铁蛋白，透析后层析分离获得单体天然空壳铁蛋白；3)以双氧水为氧化剂加入空壳铁蛋白的溶液中反应合成动物磁性铁蛋白，控制亚铁原子数与蛋白分子数比为10-200，Fe (II)/H2O2的摩尔比例为彡2 1，pH = 7. 1_11，温度为 25-700C ；4)将合成后的动物磁性铁蛋白通过排阻层析进行分离后得到单分散的和无磁相互作用的磁性铁蛋白颗粒。所述的方法，其中步骤1中的动物下水为家畜或家禽的脾脏和肝脏。所述的方法，其中步骤2中的还原去核采用巯基乙酸为还原剂的乙酸钠缓冲液。所述的方法，其中步骤3中的pH = 8-8. 5。所述的方法，其中步骤3中的温度为37_65°C。所述的方法，其中步骤3中的亚铁是来自硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁中的一种或几种的水溶性亚铁盐。所述的方法，其中排阻层析所用的介质是kpharose 4B或者是superose 6，使用的缓冲溶液是 0. 025-0. 045M Tris-HCl,pH = 7. 25 的缓冲溶液，流速为 0. 25-0. 45ml/min。与公知的磁性铁蛋白及其制备方法相比，本发明具有以下优点1)利用肉食动物的下水获得大量的天然铁蛋白原料，经济环保。提纯方法简单可行，收率高，适合大规模工业提纯加工。2)改用双氧水作为氧化剂，排除了传统使用空气的难以真正计量的缺点，实现了可控比例的合成矿物相单一的亚铁磁性内核。3)动物来源的磁性铁蛋白具有完整的铁蛋白壳，来源于动物用于相应的动物体内，很大程度上可以避免由于物种差异所对动物体造成的免疫原性，因而在动物的磁靶标药物、细胞标记等动物医学中可能有更广泛的用途。4)制备的磁性铁蛋白是单分散的和无磁相互作用的，是研究超顺磁性的难得宝贵材料。并且由于磁性颗粒外面有蛋白壳包裹，能够长期地稳定存在。
5)制备的动物磁性铁蛋白能够保存在pH = 4-11中保持蛋白结构的完整性，而且可耐高达70°C的高温，扩大了将来应用的范围。
图1是提纯分离的单分散性的天然猪脾铁蛋白的透射电镜(TEM)负染照片。图2是本发明实施例1-4所制备的单分散性的空壳猪脾铁蛋白的透射电镜(TEM) 负染照片。图3是本发明实施例1-4所制备的单分散性的磁性猪脾铁蛋白的透射电镜(TEM) 负染照片。图4是本发明实施例1-4所制备的分子筛分离前的磁性猪脾铁蛋白的透射电镜 (TEM)负染照片。图5是本发明制备的单分散性的磁性猪脾铁蛋白的选区电子衍射(SAED)图。图6是本发明制备的单分散性的磁性猪脾铁蛋白在涨时的的饱和等温剩磁获得曲线和退磁曲线图以及Wohlfarth-Cisowski检测和Henkel图。
具体实施例方式本方法在原材料的获得和仿生矿化的条件方面大大地改善和提高，而且发明了非常有效的后期分离技术可以获得无磁相互作用的单体磁性铁蛋白。本发明使用肉食动物的下水废料提纯大量的天然铁蛋白作为原料，经过还原去核获得空壳铁蛋白再作为仿生合成磁性铁蛋白的模板。然后通过控制体外合成的条件在蛋白壳内部形成磁铁矿或者磁赤铁矿颗粒。最后经过合成后的纯化工艺，使得制备的磁性动物铁蛋白具有粒径均一、单分散性和无磁相互作用的特点。此外，本发明的优点还在于天然铁蛋白来源廉价，可以大量提取自肉食动物体内，因此具有很好的生物相容性好，且无免疫原性，将来在动物医学中有更重要的用途。本发明制备的磁性铁蛋白具有完整的动物铁蛋白壳和磁性纳米颗粒核，核的直径可在1纳米到8纳米之间，取决于在合成过程中所加的铁原子数，在水以及极性溶剂中具有可分散性和溶解性。核的成分为磁铁矿(Fe53O4)或者磁赤铁矿(Y-Fe2O3)。本发明制备动物磁性铁蛋白材料的方法，包括纯化天然铁蛋白、还原去核制备空壳铁蛋白、以空壳铁蛋白为模板、通过仿生合成的方法，在其内部形成磁性纳米颗粒，然后经过分离纯化所得到的单分散和无磁相互作用的磁性动物铁蛋白。本发明的技术方案主要有以下三点1)以提纯动物铁蛋白。其中动物来源为猪、牛、羊和家禽等传统肉食动物屠宰后剩余的大量下水，例如脾脏、肝脏等。经搅拌磨浆后，超声破碎组织细胞，在70-75°C热变性 10-15分钟，过滤离心去除杂蛋白，再经过镍柱和分子筛层析分离出单体天然铁蛋白。2)天然铁蛋白还原去核为空壳铁蛋白。这一过程需要在酸性条件下，巯基乙酸作为还原剂。缓冲液要事先充分除氧。为避免蛋白聚合体降解，逐步加入还原剂，且以铁蛋白溶液由黄色全部变为白色反应终止。将还原后的铁蛋白经分子筛分离获得单体铁蛋白作为合成磁性铁蛋白的模板。透射电镜结果显示这还原后的铁蛋白仍保持完整的笼型结构，没有明显的铁核。
3)以亚铁盐和合适比例的氧化剂(双氧水)加入空壳铁蛋白的溶液中反应，通过控制!^e (II)/H2O2的摩尔比例在彡2 1条件下来保证合成矿物相单一(磁铁矿)，同时控制PH值、温度、铁蛋白浓度等反应条件，不破坏蛋白壳的笼型结构，在空壳动物铁蛋白内部形成强磁性的纳米颗粒。本发明所采用的亚铁盐主要包括硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁等水溶性亚铁盐，所采用的氧化剂为双氧水(H2O2)。控制PH值可在7. 1-11之间选择，优选pH = 8-8. 5。 其中控制温度可在25-70°C之间选择，其中优选37°C-65°C之间温度。其中反应的蛋白浓度可在lmg/ml > P > 0. 25mg/ml之间选择。依据反应产物铁含量的要求来设置每次加入反应溶液后的亚铁原子数与蛋白分子数之比，每个蛋白分子最多可容纳5000多个铁原子。在上述合适的反应条件下，空壳铁蛋白内部能形成粒度均一的!^e3O4或者Y -Fe2O3纳米颗粒。4)将合成后的磁性动物铁蛋白通过进一步的排阻层析进行分离后可以得到单分散的和无磁相互作用的磁性铁蛋白颗粒。其中的排阻层析所用的介质可以是^^11虹0^ 4B 或者是superose 6，使用的缓冲溶液是0. 025MTris-HCl (pH = 7. 25)缓冲溶液，流速设为 0. 25ml/min。通过透射电镜观测和能谱分析分离得到的产物为分散性好，无聚集的磁铁矿颗粒。通过低温磁学的剩磁曲线的Wohlfarth-Cisowski检测颗粒间无磁相互作用。以下结合附图和实施例对本发明作详细描述。实施例1在厌氧手套箱中用除去氧气的水分别配置25mM的硫酸亚铁铵50ml，8. 34mM的 H2O2 50ml, IOOmM NaCl溶液和50mM的NaOH 100ml，将纯化后的空壳猪脾铁蛋白溶液(图 2)用IOOmM NaCl溶液稀释为50ml体积，蛋白终浓度为0. 25mg/ml，放入到反应杯中。首先用电热套将反应杯中的蛋白溶液加热到65°C，加热时加入搅拌子用磁力快速搅拌保证溶液温度均勻，温度恒定15min后用50mM的NaOH通过恒定pH滴定仪将蛋白溶液的pH值调节到8. 5，然后通过自动加液器按照97. 6μ Ι/min的速度向蛋白溶液中加入硫酸亚铁铵和 H2O2各2. M5ml，最终铁蛋白的含铁量为2300个铁原子。然后将合成后的磁性猪脾铁蛋白通过分子筛层析，电泳检查各个蛋白峰对应的蛋白质种类，收集单体铁蛋白峰，浓缩得到单分散性的磁性猪脾铁蛋白。图1为提纯获得的天然猪脾铁蛋白的透射电镜(TEM)的负染照片，由图1可知天然铁蛋白由完整的蛋白壳和内部铁核两部分组成，也存在少量的空壳铁蛋白。图3是所得磁性猪脾铁蛋白核的透射电镜照片，由图可知核的平均粒径为4. Onm。图 5是磁性猪脾铁蛋白的选区电子衍射图，由图可知磁性猪脾铁蛋白核的成分为磁铁矿。图6 是该磁性猪脾铁蛋白在涨时的饱和等温剩磁获得曲线和饱和等温剩磁退磁曲线所建立的 Wohlfarth-Cisowski检测和Henkel图，由图可知通过分离得到的磁性猪脾铁蛋白不存在磁相互作用，在200mT就能达到饱和表明磁性猪脾铁蛋白核的成分为磁铁矿。实施例2将纯化后的空壳猪脾铁蛋白溶液用除氧后的IOOmM NaCl溶液稀释到50ml，放入到反应杯中。最终蛋白浓度在lmg/ml，首先用电热套将反应杯中的蛋白溶液加热到37°C， 加热时加入搅拌子用磁力快速搅拌保证溶液温度均勻，温度恒定15min后用50mM的NaOH 通过恒定PH滴定仪将蛋白溶液的pH值调节到8. 5，然后通过自动加液器按照97. 6 μ 1/min 的速度向蛋白溶液中加入硫酸亚铁铵和H2A各2. M5ml，最终铁蛋白的含铁量为2300个铁原子。其余操作均同实施例1。图4为分子筛分离前的呈聚集状态的磁性猪脾铁蛋白的透射电镜(TEM)负染照片。
权利要求
1.一种动物磁性铁蛋白材料，具有完整的动物铁蛋白壳和磁性纳米颗粒核，核的直径在1纳米到8纳米之间，在水以及极性溶剂中具有可分散性和溶解性；核的成分为磁铁矿或者磁赤铁矿；通过下述方法得到1)将动物下水磨浆后过滤离心去除杂蛋白，再经过镍柱和分子筛层析分离出单体天然铁蛋白；2)酸性条件下将天然铁蛋白还原去核为空壳铁蛋白；3)以双氧水为氧化剂加入空壳铁蛋白的溶液中反应，反应条件!^(11)/ 的摩尔比例为彡2 LpH= 7. 1-11，温度为25-70°C合成动物磁性铁蛋白；4)将合成的动物磁性动物铁蛋白进行分离后得到单分散的和无磁相互作用的动物磁性铁蛋白颗粒。
2.根据权利要求1所述的动物磁性铁蛋白材料，其中，每个动物铁蛋白壳内的磁性纳米颗粒数在100-5000。
3.一种制备权利要求1所述动物磁性铁蛋白材料的方法，主要步骤为1)将动物下水搅拌磨浆后超声破碎组织细胞，热变性过滤离心去除杂蛋白，再经过镍柱和分子筛层析分离出单体天然铁蛋白；2)酸性和无氧条件下将天然铁蛋白还原去核为空壳铁蛋白，透析后层析分离获得单体天然空壳铁蛋白；3)以双氧水为氧化剂加入空壳铁蛋白的溶液中反应合成动物磁性铁蛋白，控制亚铁原子数与蛋白分子数比为10-200，i^e(II)/H202的摩尔比例为彡2 1，pH = 7. 1-11，温度为 25-70 0C ；4)将合成后的动物磁性铁蛋白通过排阻层析进行分离后得到单分散的和无磁相互作用的磁性铁蛋白颗粒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤1中的动物下水为家畜和家禽的脾脏和肝脏。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤2中的还原去核采用巯基乙酸为还原剂的乙酸钠缓冲液。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤3中的pH= 8-8. 5。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤3中的温度为37-65°C。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤3中的亚铁是来自硫酸亚铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁中的一种或几种的水溶性亚铁盐。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，排阻层析所用的介质是^^1!虹0^4B或者是 superose 6，使用的缓冲溶液是0. 025-0· 045M Tris-HCl，pH = 7. 25的缓冲溶液，流速为 0.25-0. 45ml/min。
全文摘要
一种动物磁性铁蛋白材料，具有完整的动物铁蛋白壳和磁性纳米颗粒核，核的直径在1纳米到8纳米之间，在水以及极性溶剂中具有可分散性和溶解性；核的成分为磁铁矿或者磁赤铁矿；通过下述方法得到1)将动物下水磨浆后过滤离心去除杂蛋白，再经过镍柱和分子筛层析分离出单体天然铁蛋白；2)酸性条件下将天然铁蛋白还原去核为空壳铁蛋白；3)以双氧水为氧化剂加入空壳铁蛋白的溶液中反应，反应条件Fe(II)/H2O2的摩尔比例为≥2∶1，pH＝7.1-11，温度为25-70℃合成动物磁性铁蛋白；4)将合成的动物磁性动物铁蛋白进行分离后得到单分散的和无磁相互作用的动物磁性铁蛋白颗粒。本发明还提供了制备方法。
文档编号C07K14/79GK102464715SQ201010541069
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者曹长乾, 潘永信, 田兰香 申请人:中国科学院地质与地球物理研究所