人hcrcn81蛋白与鼠抗人的单克隆抗体制备及用途
【专利摘要】一种Balb/c小鼠的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，其特征在于能够产生鼠抗人HCRCN81蛋白质的单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。该单克隆抗体能够识别人结直肠癌细胞内及其它癌症癌细胞内的HCRCN81天然蛋白质。一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：（1）将通过基因工程技术获得的HCRCN81蛋白质免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，制备脾细胞悬液；（2）将同系的P3/X63-Ag8(X63)细胞与小鼠脾细胞融合制备P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞；（3）采用体外培养法培养P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。所述的一种鼠抗人HCRCN81蛋白质的单克隆抗体，其特征在于特异性识别人结直肠癌及其它癌症癌细胞内表达的HCRCN81蛋白，可以应用于癌症早期诊断，并有可能作为结直肠癌和其它癌症早期诊断和治疗的靶点。
【专利说明】人HCRCN81蛋白与鼠抗人的单克隆抗体制备及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及人结直肠癌细胞所表达的一种天然蛋白与鼠抗人单克隆抗体的制备及用途。
【背景技术】
[0002]大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤第三位，在我国居消化道恶性肿瘤的第2位。早期缺乏特异性临床表现，就诊时50%_60%已属晚期，5年生存率低。2006年国家卫生部的统计数据显示，我国大肠癌死亡率已位居恶性肿瘤第五位，其发病率在40岁开始上升，至60-75岁时达到高峰。发病率呈逐年上升趋势。因此，早期诊断已成为大肠癌综合防治的重点。
[0003]开展对无症状人群普查是发现早期大肠癌的有效途径，目前，大肠癌的确诊主要依靠结肠镜和内镜病理细胞学检查。内镜检查不仅能直观地发现大肠粘膜早期病变，并且能借助活检对病变区域进行组织学评价。但是在活检标本中，腺体的不典型增生和腺体癌变不易区分，二者的根本区别是癌细胞的侵袭行为，但内镜活检取材组织小，有时早期癌只能观察到异型性而无癌细胞的侵袭表现。因此，肠镜+活检的诊断方式对于大肠癌的早期确诊还是存在一定的局限性。针对这种情况，科学家们开始寻找肿瘤分子标志物，希望能从分子水平上进行大肠癌的早期诊断.但至今为止，尚未发现特异性识别大肠癌的分子标志物。
[0004]单克隆抗体特异性强，能识别特异性的抗原表位，批次稳定，是临床应用于癌症分子病理诊断的有用的工具。我们制备了鼠抗人HCRCN81蛋白的单克隆抗体，实验表明鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)能够识别人癌细胞和人组织所表达的HCRCN81天然蛋白，可以作为结直肠癌及其它癌症的早期诊断试剂。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种Balb/c小鼠的P3/X63_Ag8 (X63)杂交瘤细胞，该细胞株可以产生鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)，并证明所述鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)可用于检测人癌细胞内和人癌组织中的癌细胞内HCRCN81蛋白质的表达，为癌症的早期分子病理诊断提供有用的工具。
[0006]本发明所述人HCRCN81蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQIDN0.1所述。
[0007]本发明所述鼠抗人单克隆抗体，由上述蛋白质免疫Balb/c小鼠后筛选纯化阳性P3/X63-Ag8 (X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti_HCRCN81)，其制备方法依次包括以下步骤:
[0008](I)通过RT-PCR反应，获得人HCRCN81蛋白质编码基因；
[0009](2)将步骤(1)扩增的人HCRCN81蛋白质编码基因插入到原核载体构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；[0010](3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析所述原核重组质粒，并进行DNA测序及序列分析；
[0011](4)将正确克隆的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组HCRCN81蛋白质；
[0012](5)采用SDS-PAGE电泳、质谱分析鉴定重组HCRCN81蛋白质；
[0013](6)将所述HCRCN81蛋白质免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，制备脾细胞悬液；
[0014](7)将同系的P3/X63-Ag8 (X63)细胞与小鼠脾细胞融合制备P3/X63_Ag8 (X63)杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞；
[0015](8)采用体外培养法培养步骤(7)所述的阳性P3/X63-Ag8 (X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)。
[0016]本发明收集人结直肠癌细胞、人结直肠癌组织和正常结直肠组织，制作冰冻切片与石蜡切片，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)对体外培养的人结直肠癌细胞、人结直肠癌组织癌细胞和正常结直肠组织正常腺细胞中表达的HCRCN81蛋白的检测效果.
[0017]本发明提取人结直肠癌组织和正常结直肠组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Westernblot试验,验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti_HCRCN81)对人结直肠癌组织和正常结直肠组织中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。
[0018]本发明用hcrcn81siRNA片段干扰结肠癌细胞，并提取干扰前后的人结肠癌细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，对hcrcn81基因所表达的mRNA进行荧光定量PCR试验，检测hcrcn81siRNA片段对hcrcn81基因的抑制效率。本发明提取siRNA片段干扰前后的人结肠癌细胞的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Westernblot试验，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)对人结肠癌细胞中表达的HCRCN81蛋白的的检测效果。
[0019]实验结果表明，本发明所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti_HCRCN81)对人癌细胞和人组织中的所表达的HCRCN81天然蛋白均具有检测作用，可作为结直肠癌早期分子病理诊断的靶标。
[0020]本发明具有以下有益效果:
[0021]本发明首次制备了 P3/X63_Ag8(X63)杂交瘤细胞，并提供了一种新型鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)，能够检测人癌细胞中是否有HCRCN81蛋白表达，亦能够检测人癌组织中的癌细胞和正常组织中的正常细胞是否有HCRCN81蛋白表达，可用于结直肠癌早期分子病理诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是原核表达载体pET32a(+)的结构示意图。
[0023]图2是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的结构示意图。
[0024]图3是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的测序图。
[0025]图4是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的PCR电泳图，图中 M:DM2000PlusMarker,从上到下依次为 8000、5000、3000、2000、1000、750、500、250、IOObp0[0026]图5是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a (+) /hcrcn81转化BL21 (DE3)pLysS感受态细菌所表达的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，M:PageRuler?Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ;1，2:BL21(DE3)pLysS(pET32a)分别 0，ImMIPTG 诱导；3-6:BL21 (DE3)pLysS(pET32a::hcrcn81)分别 O, 0.01，0.1, ImMIPTG 诱导。
[0027]图6是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a (+) /hcrcn81转化BL21 (DE3)pLysS感受态细菌超声后上清和沉淀所表达的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，M:PageRuler?Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ；1, 2:0mMIPTG 诱导上清和沉淀；3, 4:0.1mMIPTG 诱导上清和沉淀。
[0028]图7是纯化后的重组人HCRCN81蛋白质的SDS-PAGE电泳图，图中，M:PageRuler?Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、70、50、40、30、20、15、10kD ；1:流穿液;2_7:分别为 10、20、50、100、250、500mM 咪
唑洗脱液。
[0029]图8是重组人HCRCN81蛋白质电洗脱后SDS-PAGE电泳图，图中，M =PageRuIer?Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas),从上到下分别是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD ；1:电洗脱蛋白；2:浓缩滤液；3:lmg/mlBSA标准品。
[0030]图9是荧光定量PCR实验中hcrcn81基因引物的标准曲线图。
[0031]图10是荧光定量PCR实验中gapah基因引物的标准曲线图。
[0032]图11是转染siRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480 (SW480_heMn81)和人结直肠癌细胞株SW620 (SW620?)，阴性对照SW48(TNG和SW62(TNG，未转染siRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480和人结直肠癌细胞株SW620的hcrcn81基因相对表达水平的柱状图，图A为SW480细胞；图B为SW620细胞。
[0033]图12是结直肠癌细胞株SW480和SW620细胞免疫组化实验结果(x400)。
[0034]图13是人结直肠癌组织免疫组化照片，示肿瘤组织表达高于正常组织，且细胞核和细胞质中均有表达，细胞核阳性强于细胞质。
[0035]图14是westernblot方法检测HCRCN81相对表达水平柱状图，图A为SW480细胞；图B为SW620细胞。
[0036]图15A:Westernblot方法检测结直肠癌细胞株SW480中HCRCN81的蛋白SDS-PAGE电泳图，B = Westernblot方法检测结直肠癌细胞株SW620中HCRCN81的蛋白SDS-PAGE电泳图；图中，1:未经处理的结直肠癌细胞株SW480，2:阴性对照siRNA片段干扰的结直肠癌细胞株 SW480 (SW48(Tng)，3:hcrcn81siRNA片段干扰的结直肠癌细胞株 SW480 (SW480_hcrcn81) ;4:未经处理的结直肠癌细胞株SW620，5:阴性对照siRNA片段干扰的结直肠癌细胞株SW620 (SW62(Tng)，6: hcrcn81siRNA 片段干扰的结直肠癌细胞株 SW620 (SW620_hcrcn81)，β -actin为内参照蛋白。
【具体实施方式】
[0037]实施例1:人hcrcn81的原核重组质粒的构建
[0038]根据目的序列(序列表SEQIDN0.1中第73位至第573位的核苷酸序列)，设计全基因合成引物，表 I 中 hcrcn81_lF、hcrcn81_3F、hcrcn81_5F、hcrcn81_7F、hcrcn81_9F、hcrcn81_llF、hcrcn81-13F 为正义链引物，表 I 中 hcrcn81_2R、hcrcn81_4R、hcrcn81_6R、hcrcn81_8R、hcrcn81_10R、hcrcn81_12R、hcrcn81-14R 为反义链引物，上游引物hcrcn81_lF添加EcoRI酶切位点(划线处)，下游引物hcrcn81_14R添加HindIII酶切位点。
[0039]表1:全基因合成引物序列
【权利要求】
1.一种Balb/c小鼠的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，其特征在于能够产生人HCRCN81蛋白质的鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)。
2.权利要求1所述的一种鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)，其特征在于能够识别人癌细胞内和人癌组织中癌细胞内的HCRCN81天然蛋白质。
3.权利要求2所述的一种天然的人HCRCN81蛋白质，其特征在于特异性的在人癌组织中的癌细胞内高表达。
4.权利要求3所述一种天然的人HCRCN81蛋白质，在结直肠癌及其它癌症早期诊断中的应用。
5.权利要求2所述的一种鼠抗人单克隆抗体(mAnt1-HCRCN81)，其特征在于识别人癌细胞和人其它癌症的癌组织中癌细胞内的HCRCN81蛋白，作为检测剂在诊断结直肠癌和其它癌症方面的 应用。
【文档编号】G01N33/577GK103849603SQ201310597924
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年1月23日
【发明者】陈尧, 温晓霞, 王凯程 申请人:四川大学