专利名称：小鼠抗人cd20单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及以原核表达的⑶20蛋白免疫小鼠获得的分泌⑶20单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F4，属于生物工程技术领域。
背景技术：
⑶20是一种分子量为33_37kD的非糖基化的跨膜磷酸蛋白，位于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的B细胞)外的发育分化各阶段的B细胞的表面，是B淋巴细胞表面分化抗原。它主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，与B淋巴细胞Ca2+的跨膜传导密切相关，在免疫系统中起重要作用。人⑶20基因定位于第11号染色体，⑶20分子由297个氨基酸组成，有4个跨膜区，氨基端和羧基端都位于细胞质膜内侧；在第三跨膜区和第四跨膜区之间，有一个由43个氨基酸残基组成的环区，构成其主要的抗原表位。⑶20抗原分子比较暴露，易于接近。⑶20与抗CD20抗体结合后内化现象不明显，因此细胞表面CD20分子数量并不因为与抗体结合而大量减少并且CD20也不会发生明显细胞表面脱落的现象。CD20起始表达于前B细胞阶段，到B细胞终端分化成浆细胞时结束，一直被认为是B细胞表面特有的标识。CD20主要分布于B细胞、前B细胞后期和浆细胞前的B细胞等细胞表面，大于95%的B细胞淋巴瘤⑶20阳性，B细胞型慢性淋巴细胞性白血病弱阳性，B淋巴母细胞淋巴瘤阴性，少数外周T细胞淋巴瘤可能⑶20+ ;而造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他正常组织都不表达⑶20分子，在人体血清中亦无游离⑶20的存在。⑶20在B淋巴细胞中的表达特点为靶向治疗B淋巴细胞瘤提供了一个理想的靶点。抗CD20治疗可清除恶性B细胞和部分正常B细胞，但由于干细胞和B细胞前体不表达⑶20，因而不会造成长期B细胞损耗。将CD20作为治疗B细胞淋巴瘤的靶点，特别是对治疗惰性、复发难治性B细胞淋巴瘤有较肯定的疗效。由于⑶20为B淋巴细胞表面特有的标志物，现常用⑶20单克隆抗体标记B淋巴细胞及B细胞淋巴瘤。生产抗CD20的单克隆抗体对于淋巴瘤的诊断与治疗方面具有重要意义。目前，国内外已经获得了多种⑶20的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的CD20的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测CD20表达的小鼠抗人CD20单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本发明的上述目 的，本发明提供了如下的技术方案:(I)根据⑶20的基因序列(ΝΜ_021950.3)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增⑶20基因，构建重组表达载体PET28a-⑶20，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备⑶20单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)通过免疫组织化学分析⑶20单克隆抗体染色人慢性扁桃体炎石蜡切片。(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CD20重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体CD20的重链和轻链可变区序列。本发明提供的以原核表达的⑶20蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌⑶20单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为2F4，该细胞株2F4已于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.6856。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株2F4，CGMCC N0.6856产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10o本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本发明的优点和有益效果:
本发明应用重组人的⑶20蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗⑶20的杂交瘤细胞株，命名为2F4，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对CD20单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上。人慢性扁桃体炎石蜡切片经抗⑶20抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到可于光镜下观察到胞膜出现明显黄色至棕黄色细小颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的CD20单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的CD20蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测⑶20表达。
图1 SDS-PAGE分析纯化后的⑶20单克隆抗体。图2 ELISA法测定⑶20单克隆抗体滴度。图3是免疫组织化学检测分析CD20单克隆抗体染色人慢性扁桃体炎石蜡切片。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1:杂交瘤细胞株2F4及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备
(I)获得目的基因在该实施例中，根据⑶20的基因序列(NM_021950.3)的编码框，设计I对特异引物:引物1:5' -GGATCCATGACAACACCCAGAAA TTCAG-3' (SEQIDN0:1)引物2:5' -CTCGAGTTAAGGA GAGCTGTCAT-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增⑶20基·因。(2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-CD20。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(4)诱导表达和蛋白纯化将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，370C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化⑶20蛋白。2、单抗的制备和纯化(I)、免疫动物—般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白⑶20 (用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100 μ g/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白⑶20 (用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白⑶20 (用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。(2)、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的⑶20蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100μ 1，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200 μ I 5%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100 μ I (阴性对照为PBS100 μ I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50 μ 1，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗⑶20杂交瘤细胞株，命名为2F4，亚型鉴定为IgGl。将选出的阳性杂交瘤细胞株2F4克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人CD20杂交瘤细胞系2F4，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6856。(3)单克隆抗 体的大量制备与纯化将步骤⑵获得的细胞株2F4接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体⑶20的纯化:采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗⑶20的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度以纯化的⑶20蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100 μ 1，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200μ1 5%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 进行稀释，以每孔 100 μ I 加入酶标板中(阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μ 1，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上(参见图2)。实施例2:单克隆抗体免疫组化应用用CD20单抗，按常规法作病理切片，对人慢性扁桃体炎石蜡切片进行免疫组化染色。具体方法为:(I)脱蜡切片依次置于二甲苯1、I1、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇1、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。(2)抗原修复将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)，高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。
(3)阻断3 % H2O2中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。(4)滴加一抗甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的CD20单克隆抗体，稀释度为1: 600。放置在孵育盒内4°C冰箱中过夜孵育约12小时。(5)滴加二抗将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37°C恒温箱中孵育30分钟。(6)显色 、衬染、封片取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3_5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5-10分钟，苏木素染液复染I分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5-10分钟，脱水、透明、封片、镜检。结果判定:按照国外学者对组织中CD20的判定标准，CD20蛋白阳性反应为黄到棕黄色细小颗粒，定位于细胞膜。人慢性扁桃体炎组织(参见图3)经抗CD20抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞膜出现明显黄色至棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此⑶20小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。实施例3:单克隆抗体可变区测序根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:zh09 5' -GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3' (SEQ IDNO:3)zhrll 5' -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQIDNO:4)zl05 5' -GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ IDNO:5)zlr05 5' -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQIDNO:6)Trizol Reagent试剂分别提取5 X IO6杂交瘤细胞2F4的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhrll为引物进行PCR扩增单克隆抗体CD20重链可变区，用zlOl和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体CD20轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94°C 5分钟；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30个循环；72°C 7分钟。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp，重链长度420bp)。克隆到PGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体CD20的重链和轻链可变区序列。单克隆抗体⑶20可变区的DNA序列和氨基酸序列:单克隆抗体CD20 重链可变区 DNA 序列(5' —3'，420bp)(SEQ ID NO:7)；单克隆抗体CD20的轻链可变区DNA序列(5' —3'，395bp) (SEQ ID NO:8)；单克隆抗体CD20重链可变区的推断氨基酸序列(140氨基酸)(SEQ ID NO:9)；
单克隆抗体CD20轻链可变区的推断氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ 10 ID NO:10)。·
权利要求
1.一种以原核表达的CD20蛋白免疫小鼠获得的分泌CD20单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F4，保藏编号为 CGMCC N0.6856。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株2F4产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10o
4.一种DNA分子SEQ ID NO:7，它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一种DNA分子SEQ ID NO:8，它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO:10o
全文摘要
一种小鼠抗人CD20单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌CD20单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为2F4，保藏编号为CGMCC No.6856。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株2F4产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO9；一种DNA分子SEQ ID NO8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测CD20表达。
文档编号C12N5/20GK103173412SQ20121052818
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者张林刚, 郗日沫, 尹芝南 申请人:天津三箭生物技术有限公司