专利名称：小鼠抗人egfr单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及以原核表达的EGFR蛋白免疫小鼠获得的分泌EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞株11B2，属于生物工程技术领域。
背景技术：
EGFR(表皮生长因子受体)也称作erbBl/HERl是由1186个氨基酸残基构成，分子量约为170kDa的一种跨膜糖蛋白。EGFR是原癌基因c_erbBl的表达产物，该基因定位于人7pl2.1 13.2。EGFR属于表皮生长因子受体(HER)家族成员，目前已知该家族包括四个相关的蛋白酪氨酸激酶受体:HER1 (erbBl/EGFR)、HER2 (erbB2/NEU)、HER3 (erbB3)及HER4(erbB4)，这些蛋白酪氨酸激酶受体在细胞表面与特异的天然受体或生长因子相互作用。EGFR广泛分布于哺乳动物的上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞中。在包括非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、结肠癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌等多种上皮来源的肿瘤中，EGFR存在高表达或变异。EGFR高表达水平与肿瘤的恶化、易侵袭性、对放化疗的抵抗程度密切相关，在很多恶性肿瘤中也与不良预后相关。EGFR在调节肿瘤细胞的增殖、存活、损伤修复、粘附、转移及新血管生成中具有重要的作用，其致瘤效应包括DNA合成启动和促进细胞生长、侵袭及转移等。EGFR由胞外配体结合区、疏水性跨膜区和胞内酪氨酸激酶区三部分组成，以无活性的单体形式存在，其特异性配体有EGF、转化生长因子α (TGF-α)、双向调节因子以及肝素结合EGF样生长因子。当EGFR胞外区与配 体结合后，其胞内区发生自身磷酸化，导致EGFR 二聚化，激活胞内酪氨酸酶活性，使下游一系列胞内信号分子发生磷酸化，从而启动Shc，Ras/MARK，PI3K及JAKs/STATs等多条通路。EGFR信号通路的活化可以增加肿瘤细胞的侵袭力、使肿瘤细胞增值、促进血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡。EGFR在肿瘤细胞中的高度表达以及在肿瘤细胞生长、分化等生理过程中发挥的重要作用使EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断及治疗的靶点。目前，国内外已经获得了多种EGFR的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的EGFR的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测EGFR表达的小鼠抗人EGFR单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:(I)根据EGFR的基因序列(ΝΜ_005228.3)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增EGFR基因，构建重组表达载体PET28a-EGFR，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备EGFR单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)采用免疫印迹法(Western blot)检测EGFR单抗的效价及特异性，通过免疫组织化学分析EGFR单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体EGFR重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体EGFR的重链和轻链可变区序列。本发明提供的以原核表达的EGFR蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为11B2，分类命名为小鼠抗人EGFR杂交瘤细胞系，该细胞株11B2已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCN0.6912。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株11B2，CGMCC N0.6912产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO =IO0本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本发明的优点和有益效果:本发明应用重组人的EGFR蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗EGFR的杂交瘤细胞株，命名为11B2，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对EGFR单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上。免疫印迹法(Western blot)检测EGFR单抗的效价及特异性，结果显示在分子量170kDa处有一条明显的区带，证明是抗EGFR小鼠单克隆抗体，梯度稀释显示抗体1: 2000稀释后条带依然清晰，证明本单抗效价稳定；人乳腺癌石蜡切片经抗EGFR抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞膜或胞浆中有明显黄色到棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的EGFR单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的EGFR蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测EGFR表达。
图1SDS-PAGE分析纯化后的EGFR单克隆抗体。图2ELISA法测定EGFR单克隆抗体滴度。图3是免疫印迹法(Western blot)检测EGFR单抗的纯度及特异性。Lanel =EGFR单抗工作浓度1: 1000。Lane2:EGFR单抗工作浓度1: 2000。
图4是免疫组织化学检测分析EGFR单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1:杂交瘤细胞株11B2及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备(I)获得目的基因在该实施例中，根据EGFR的基因序列(NM_005228.3)的编码框，设计I对特异引物:引物1:5' -ATTGGATCCATGCGACCCTCCGGGACG-3' (SEQIDN0:1)引物2:5' -CCCTCGAGTCATGCTCCAATAAAT-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增EGFR基因。(2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-EGFR。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进`入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(4)诱导表达和蛋白纯化将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，370C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化EGFR蛋白。2、单抗的制备和纯化(I)、免疫动物—般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白EGFR (用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100 μ g/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白EGFR(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白EGFR(用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融
口 ο(2)、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的EGFR蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100 μ 1,4°C包板过夜。甩掉包被液,加入200 μ 15%的脱脂奶粉,37°C封闭Ih后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清IOOy I (阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50 μ I，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗EGFR杂交瘤细胞株，命名为11B2，亚型鉴定为IgGl。将选出的阳性杂交瘤细胞株11B2克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人EGFR杂交瘤细胞系11B2，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6912。(3)单克隆抗体的大量制备与纯化将步骤(2)获得的细胞株11B2接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体EGFR的纯化:采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗EGFR的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl 溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度以纯化的EGFR蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100 μ 1，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200 μ 15%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 进行稀释，以每孔 100 μ I 加入酶标板中(阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μ 1，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上(参见图2)。实施例2:单克隆抗体鉴定及应用免疫组化应用检测用EGFR单抗，按常规法作病理切片，对人乳腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。具体方法为:(I)脱蜡切片依次置于二甲苯1、I1、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇1、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。(2)抗原修复
将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)，高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。(3)阻断 3 % H2O2中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。(4)滴加一抗
甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的EGFR单克隆抗体，稀释度为1: 1000。放置在孵育盒内4°C冰箱中过夜孵育约12小时。(5)滴加二抗将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37°C恒温箱中孵育30分钟。(6)显色、衬染、封片取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3 5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5 10分钟，苏木素染液复染I分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5 10分钟，脱水、透明、封片、镜检。结果判定:按照国外学者对组织中EGFR的判定标准，EGFR蛋白阳性反应为出现明显棕黄色颗粒，定位于胞浆或胞膜。人乳腺癌组织(参见图4)经抗EGFR抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆或胞膜中称明显黄色到棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此EGFR小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。实施例3:单克隆抗体可变区测序根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:zh085/ -GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (SEQID NO:3)zhrl15' -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQID NO:4)zl015/ -GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3(SEQ IDNO:5)zlr055/ -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQIDNO:6)Trizol Reagent试剂分别提取5X IO6杂交瘤细胞11B2的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhrll为引物进行PCR扩增单克隆抗体EGFR重链可变区，用zlOl和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体EGFR轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94°C 5分钟；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30个循环；72°C 7分钟。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp，重链长度420bp)。克隆到PGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体EGFR的重链和轻链可变区序列。
单克隆抗体EGFR可变区的DNA序列和氨基酸序列:单克隆抗体EGFR 重链可变区 DNA 序列(5' —3'，399bp) (SEQ ID NO:7)；单克隆抗体EGFR的轻链可变区DNA序列(5' —3'，391bp)(SEQ ID NO:8)；单克隆抗体EGFR重链可变区的推断氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ ID NO:9)；单克隆抗体EGFR轻链可变区的推断氨基酸序列(130氨基酸)(SEQ 10 ID NO:1 0)。
权利要求
1.一种以原核表达的EGFR蛋白免疫小鼠获得的分泌EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞株11B2，保藏编号为 CGMCC N0.6912。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株11B2产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10o
4.一种DNA分子SEQ ID NO:7，它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一种DNA分子SEQ ID NO:8，它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQID NO:10o
全文摘要
一种小鼠抗人EGFR单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为11B2，保藏编号为CGMCC No.6912。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株11B2产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ IDNO9；一种DNA分子SEQ ID NO8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测EGFR表达。
文档编号C12N15/13GK103173415SQ20131004130
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者张林刚, 郗日沫, 尹芝南 申请人:天津三箭生物技术有限公司