专利名称：抗乙型肝炎病毒人工miRNA及其组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的人工miRNA(articifical miRNA,amiRNA)表达序列及其组合在治疗HBV感染疾病中的应用。
背景技术：
HBV感染是当前威胁人类健康严重的传染病之一，与HBV感染相关的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌每年约导致100多万人死亡。我国是HBV感染大国属于高流行区，HBV感染不仅危害我国人民的健康，给患者及其家庭造成巨大的经济和精神负担，而且给国家造成了巨大的劳动力和经济损失，乃至导致严重的就业等社会问题。目前临床有效的治疗HBV药物主要包括干扰素和核苷类药物。干扰素治愈率有限，副作用较多，核苷类药物存在容易引起HBV突变耐药和停药后易复发，因此新型抗HBV药物的研发具有重要的社会和经济价值。miRNA是一种大小约22nt的非编码小分子单链RNA，由一段具有发夹环结构的长度约为70-80nt的单链RNA前体剪切后生成。miRNA序列靠近5'端的I 7个核苷酸种子区是靶基因结合的区域，当miRNA与mRNA不完全互补时，miRNA结合到mRNA的3 ^端非翻译区抑制其翻译，当miRNA与mRNA完全互补时，会导致靶mRNA降解。在保持发夹状miRNA茎环前体的结构和能量特征不变的条件下改变碱基，可产生与自然miRNA具有相同长度、但与自然miRNA序列完全无关的小RNA，这种小RNA分子就是amiRMA。amiRNA利用内源miRNA前体人工合成具有靶向任何基因的miRNA并以此下调该特定基因的表达。这种通过amiRNA技术实现的特异基因高效稳定沉默是RNAi发展过程中的又一重大突破，已经成为分子生物学和药物研发的有力工具。
发明内容
本发明的目的在于提供治疗HBV感染的amiRNA表达序列及其组合，其使用方式及携带其的表达载体。具体地说，本发明涉及具有抑制HBV病毒复制能力的amiRNA表达序列及其组合在制备治疗HBV感染引起的相关疾病的药物中的应用。本发明提供的靶向HBV的amiRNA表达序列可抑制HBV的复制和病毒基因的表达。本发明提供的amiRNA表达序列是通过以下方法获得的:选择设计可靶向HBV病毒基因保守区的RNA干扰靶点序列，将该靶点序列及其的反向互补序列替换鼠源pre-miRNA155的miRNA成熟区，并克隆入amiRNA表达载体ρΟΚ-basic (生物技术通讯，2012，23 (6):91-95.)获得相应的amiRNA表达质粒,将该质粒分别与HBV感染性克隆质粒进行共转染实验，通过检测上清中HBsAg和HBeAg的表达水平获得有效的amiRNA表达序列。抑制HBV表达的amiRNA表达序列,该序列选自:(1)SEQ ID NO:1_17中任何一个所示的序列，或者(2)与(1)中序列具有至少70% (优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列，或者(3)上述序列的片段或者互补序列本发明还提供包含抑制HBV表达的amiRNA表达序列的组合，已达到防止病毒变异引起的逃逸并提高病毒抑制效果的目的。本发明还涉及了含有amiRNA表达序列及其组合的重组表达载体或病毒载体。本发明还涉及在基因组中或者基因组外携带本发明涉及的amiRNA表达序列及其组合的细胞，包含原核细胞和真核细胞(如细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞，优选哺乳动物如人的细胞，优选肝细胞和干细胞)。本发明还涉及本发明amiRNA表达序列及其组合、载体和细胞用于治疗HBV感染或者HBV患者的用途。本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
为了更好的理解本发明的实质，下面将结合附图来对本发明进行更详细的说明。图1为pOK-basic载体图谱，用于amiRNA的构建和表达。图2显示了靶向17个amiRNA表达序列质粒在与HBV感染性克隆质粒共转染H印G2细胞后显示出的抑制HBV表达的能力，可抑制H印G2细胞中HBsAg和HBeAg的表达。图3显示了含有串联amiRNA表达序列(组合)的质粒在与HBV感染性克隆质粒共转染HepG2细胞后显示出的抑制HBV表达的能力，可抑制HepG2细胞中HBsAg和HBeAg的表达。图4显示了含有串联amiRNA表达序列(组合)的质粒与HBV感染性克隆质粒水动力注射小鼠尾静脉后，分别在2、5、9和14天尾静脉取血，合适比例稀释后检测的HBsAg含量。串联amiRNA表达序列(组合)在体内显示出较强抑制HBV复制的能力，可抑制HBV感染性克隆质粒的表达，降低血清中HBsAg的水平。图5显示了含有串联amiRNA表达序列(组合)的质粒与HBV感染性克隆质粒水动力注射小鼠尾静脉后，分别在2、5、9和14天尾静脉取血，合适比例稀释后检测的HBeAg含量。串联amiRNA表达序列(组合)在体内显示出较强抑制HBV复制的能力，可抑制HBV感染性克隆质粒的表达，降低血清中HBeAg的水平。
具体实施例方式本发明提供了一种通过amiRNA表达序列及其组合进行抗HBV治疗的新方法，以下通过实例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用于解释本发明，除非特别说明，本发明的术语具有本领域通常使用的含义。本发明提供了可靶向HBV的amiRNA表达序列，包含如下序列或与其至少有70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一个或几个序列:SEQ ID NO:1-17。—致性(identity)可以按照本领域公知的方法计算。适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST2.0算法。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。依据本发明amiRNA表达序列指的是通过设计表达或设计合成等方式得到的靶向HBV的序列。当其通过质粒形式进行表达时使用的启动子可以是任何适于在细胞中表达目的基因的启动子。可以是组成型的，也可以是诱导性的。实施例一靶向HBV的amiRNA表达载体质粒的设计与构建靶向HBV的amiRNA表达序列的设计:以HBV参考序列为靶序列，选择设计可靶向HBV病毒基因保守区的RNA干扰靶点序列，将该靶点序列及其的反向互补序列替换鼠源pre-miRNA155的miRNA成熟区，并克隆入amiRNA表达载体pOK-basic (图例I)获得相应的amiRNA表达质粒。实施例二共转染实验筛选可抑制HBV的amiRNA表达序列材料与方法1.细胞培养所用 细胞为为肝癌细胞H印G2，用含5%胎牛血清(FBS，Hyclone)的DMEM细胞培养液37°C、5% C02条件下培养。2.ρΟΚ-basic-amiRNA质粒由本发明提供；HBV复制型质粒pHBVl.31含1.31拷贝HBV DNA并有完整复制单元，其能在转染H印G2细胞内完成病毒的复制，细胞培养液上清中可检测到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，细胞内及细胞上清可检测到病毒复制中间体。3.细胞转染HepG2细胞在含5% FBS的DMEM培养液中，于37°C、5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将H印G2细胞接种24孔板，8 X IO4细胞/孔，37°C，5% C02孵育24-36小时，待长至70% -90%细胞汇合后，采用GenJet转染试剂并参照说明书操作转染，同时设克隆有不靶向任何人和小鼠的amiRNA随机序列的载体作为对照。4.HBsAg、HBeAg 检测转染后48h收集细胞培养液，将收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAg定量ELISA检测试剂盒(郑州安图绿科生物工程有限公司)说明书操作步骤检测，得到转染有不同amiRNA的上清中含有的HBsAg和HBeAg浓度。结果以共转染了对照amiRNA表达质粒和HBV感染性克隆质粒的H印G2细胞的培养上清中的HBsAg、HBeAg蛋白作为对照，计算各转染amiRNA上清中HBsAg、HBeAg蛋白的相对水平。实施例三靶向HBV的串联amiRNA在小鼠模型体内对HBV的抑制作用。材料与方法1.动物造模SPF级C57小鼠，16±18g，购自军事医学科学院动物实验中心。以小鼠尾静脉快速注射大容量体积质粒的方式造模，分别将6 μ g的amiRNA表达质粒与6 μ gpHBVl.18 (含
1.18拷贝HBV DNA)共溶于小鼠体重1/10体积的PBS中，5_8秒内匀速注射完毕。 2.HBsAg、HBeAg 检测造模后第2、5、9和14天小鼠尾静脉取血，合适比例稀释后HBsAg和HBeAg按照ELISA定量检测试剂盒(郑州安图绿科生物工程有限公司)说明书操作步骤检测。结果结果如图4、图5所示。由图中可见，本发明构建的串联ami RNA表达质粒小鼠体内均可显著抑制HBsAg 和HBeAg的表达水平。
权利要求
1.制HBV的amiRNA表达序列，该序列选自: 1.1SEQ ID NO:1-17中任何一个所示的序列，或者 1.2与1.1中序列具有至少70% (优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列，或者 1.3上述序列的片段或者互补序列。
2.制HBV的amiRNA表达序列组合，其特征在于所述组合含有权利要求1所述的amiRNA表达序列。
3.一种基因治疗载体，该载体可以是质粒载体或病毒载体，其特征在于所述载体含有权利要求1和权利要求2所述的amiRNA表达序列及其组合。
4.一种改造的细 胞，其特征是该细胞可表达或含有权利要求1和权利要求2所述的amiRNA表达序列及其组合或含有权利要求3中所述的基因治疗载体。
5.一种治疗乙肝病毒感染相关疾病的治疗药物及其组合物，其特征在于含有权利要求1和权利要求2所述的amiRNA表达序列及其组合或权利要求3中所述的基因治疗载体或权利要求4中所述的一种改造的细胞。
全文摘要
本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的人工miRNA(articifical miRNA，amiRNA)及其组合在治疗HBV感染疾病中的应用。本发明利用生物信息学和分子生物学的方法针对HBV不同基因型的保守区分别设计和构建了amiRNA及其真核表达载体，通过体内外筛选发现了17条可显著抑制HBV复制的amiRNA及其不同的amiRNA组合。因此，本发明涉及的amiRNA及其组合有望成为治疗乙型肝炎病毒相关疾病的新型治疗药物和手段。
文档编号C12N15/113GK103088026SQ20131003956
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者王升启, 王学军, 李英, 黄海, 张秀娟, 谢佩雯 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所