检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA 的方法、试剂盒及其应用
【专利摘要】本申请公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，提取pgRNA后，使用RNase?free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，采用qRT?PCR的方法达到对pgRNA的定量检测，本申请还提供了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒。本申请，达到了如下效果：1)采用血液检测，无创，常规且可大规模应用；2)可检测血液中超低载量的PgRNA；4)该试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了方案。
【专利说明】
检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 乙肝病毒颗粒在人体内的生命过程已经研究得很透彻:HBV的复制过程中存在逆 转录的步骤，因此其生活周期不同于其它DNA病毒，由于逆转录酶的特性，HBV的突变率要高 很多。
[0003] HBV DNA在完整病毒中以松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的形式存 在，HBV病毒颗粒进入肝细胞后，脱去外面的衣壳，其rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状 DNA(covalentlt closed circular DNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA (PgRNA)和其它mRNA，PgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA，rcDNA与相关蛋白组装形成HBV 病毒颗粒。一些临床试验的研究结果表明，之所以部分HBV DNA已经检测不到，结果呈现阴 性的乙肝患者的病情仍在继续，其根本原因在于患者体内病毒颗粒的核心部件没有清除干 净，也没有停止工作。其中，HBV cccDNA就是目前临床上较为公认的"核心部件"之一。但是， 现有的拉米夫定(LAM)等NA抗病毒药物并不能完全清除HBV cccDNA，经过较长一段时间抗 病毒治疗后的乙肝患者稳定感染的细胞中，细胞核内cccDNA仍旧维持在一定的水平，每个 肝细胞内约有5-50个拷贝。但是，HBV cccDNA主要存在于肝脏细胞中，取材及检测都非常困 难。
[0004]
[0005] 嗜肝DNA病毒科中的乙型肝炎病毒(HBV)是经典的DNA逆转录病毒，其进入细胞后 以DNA作为模板转录出四种转录体(RNA)，转录体中有一种称为前基因组RNA，也即是PgRNA。 这种RNA上带有包装信号，能够被包装入核心颗粒。研究表明，仅有PgRNA能够被包装入核心 颗粒，其它类型的转录体都不能被包装进入核心颗粒，这也就意味着HBV的DNA基因组仅能 由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到，即DNA-RNA-DNA。鉴于PgRNA的在乙肝病毒颗粒复制 过程中的重要性，它很可能成为新的NA停药指标。
[0006] 国内外，现在都没有获批的或科研型的成品商业化试剂盒，故，开发HBV PgRNA成 品试剂盒具有一定的市场独家性和应用创新性。另外，在科学研究领域，国内对PgRNA的研 究寥寥无几，国外对PgRNA的研究也多集中在与HBV DNA、HBsAg等直接相关性上，没有 "PgRNA与抗病毒治疗停药后复发"的关系研究。
[0007] 现阶段，乙肝治疗的目标是最大限度的长期抑制HBV病毒颗粒的复制，减轻肝细胞 炎性坏死及肝纤维化，达到延缓和减少肝功能衰竭、肝硬化失代偿、肝癌及其他并发症的发 生，从而改善生活质量和延长生存时间。
[0008] 在乙肝治疗用药时，现在评估"何时停药"，也即是评估"治疗终点"的指标，除了常 规生化指标HBeAg、HBsAg和ALT之外，写入临床指南的分子生物学指标就是HBV DNA，大致情 况如下：
[0009] 1)HBV DNA:依据此指标判断"何时停药"，存在延长治疗的"过度治疗"和停药后复 发反弹的"再治疗"问题。另外，临床指南也明确指出此停药指标存在的问题，并提出十大待 解决问题之一:寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志。
[0010] 2)HBV cccDNA:检测HBV cccDNA的技术已不是问题，常见的有RT-PCR(实时聚合酶 链式反应技术)和FISH(荧光原位杂交技术）。但是，国内外还没有CFDA/FDA批准的试剂盒应 用，国内只存在少数科研型商品化试剂盒。HBV cccDNA检测应用为何步履维艰、难以推广 呢？主要原因有:① cccDNA主要存在于肝细胞中，在血液、组织液中HBV基因组以rcDNA形式 存在。若要检测cccDNA，就必须以肝组织为标本。有创活检在绝大多数医院不是常规项目， 而且肝组织标本检测cccDNA难度很大;②大量的实验结果表明都没能在外周血单个核细胞 中检出cccDNA;③重症肝炎前期及重症期间的患者血清中都未能检出cccDNA;④总之， cccDNA在肝组织中存在的特殊性，导致cccDNA检测技术和应用难度都很大。
[0011] 3)尽管HBV PgRNA也主要存在于肝细胞中，但是，类似于临床ALT(丙谷转氨酶）、 AST (谷草转氨酶)在肝细胞遭到破坏后会释放入血液一样，预测HBV PgRNA也会存在于血液 中，并与疾病的严重程度相关。专利预实验结果也已充分证实了乙肝患者血液中存在HBV PgRNA的结论，只是血液中HBV PgRNA含量较低，其本身也较容易被RNase降解。所以，开发稳 定、可靠、灵敏的HBV PgRNA定量检测方法是解决问题的技术关键所在，专利已完成相关技 术难点的攻关。
[0012] 4)临床上常用的拉米夫定(LAM)等抗病毒药物抑制的是PgRNA逆转录，而cccDNA的 含量又相对稳定，再加上"乙肝病毒DNA基因组仅能由包装入核心颗粒的PgRNA逆转录得到" 的特殊地位，血液中的HBV PgRNA含量可能是一个更好的评价患者病情的指标。
[0013] 5)临床上服用抗病毒药物的患者停药后1年内，约一半的患者表现出持续的病毒 学应答，但是还有约50%的患者停药后很快就会复发反弹，专利预测这与患者体内"尽管 HBV DNA低载量，但是HBV PgRNA高载量"的原因有关，HBV PgRNA可能成为预测NA停药的新 指标。
[0014] 因此，采用高灵敏度、操作简单、检测时间短的RT-qPCR技术对抗病毒治疗的乙肝 患者血液样本实施HBV PgRNA含量的定量测定，给"乙肝临床指南十大待解决问题之一"的 "寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志"的问题解决提供了新的思路与可能。
[0015] HBV PgRNA:国内外，既没有获批的、科研型的HBV PgRNA成品商业化试剂盒，也没 有PgRNA与"NA停药后复发"相关性上的研究。核苷(酸)类似物(NA)抗病毒治疗是抑制PgRNA 的逆转录，最终结果是逐渐耗竭肝细胞内的cccDNA，而肝内cccDNA的含量又相对稳定(5-50 个拷贝），再加上近年来的实验研究和专利预实验已证实乙肝患者血液中PgRNA的存在性并 可以检测到。故此"血HBV PgRNA定量检测试剂盒"具有市场独家性和应用创新性，有良好的 经济前景和应用前景。
【发明内容】
[0016] 本申请解决的主要问题是提供检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法、试剂 盒，以解决无法实现的技术问题。
[0017] 为了解决上述技术问题，本发明公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方 法，，其特征在于，其包括如下实现步骤：
[0018]样本处理:取外周血3-5ml注入无菌收集管，室温放置；
[0019] HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的 HBV RNA，获得HBV RNA粗品；
[0020] HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如 下步骤：
[0021] 1)建立如下反应体系：
[0022] RNase-Free DNase 10X反应缓冲液lul;
[0023] RNase-Free DNaselul/ug；
[0024] RNA无核酸酶的水补足至10ul;
[0025] 将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取l-8ul加入如下反应体系中；
[0026] 2) 37 Γ孵育半小时；
[0027] 3)加入lul终止液终止反应；
[0028] 4)65°C孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；
[0029] pgRNA的定量检测:使用qRT-PCR定量检测pgRNA，包括:如下步骤：
[0030] 1)配制qRT-PCR反应体系，
[0031] qRT-PCR 反应体系：
[0032] PCR 反应液 12.5yL;
[0033] 引物探针混合液1.5ul;
[0034] 灭菌蒸馏水6yL;
[0035] 所述引物的上游引物包含如SEQ ID N0:3所示的碱基序列；
[0036] 下游引物包含如SEQ ID N0:6所示的碱基序列；
[0037] 所述探针，包含如SEQ ID NO:7所示的碱基序列；
[0038] 2)各反应管在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μ!7管分装至PCR仪样 品反应管中待用；
[0039] 3)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5yL加入 相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液 体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽；
[0040] 4)将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热 循环条件，完成qRT-PCR反应；
[0041] 结果分析及判定:采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。
[0042]优选地，所述PCR的反应条件：（1)预变性的条件，95°C3min; (2)变性的条件，94°C 15secX40个循环；（3)退火，延伸，荧光采集，60°C35secX40个循环；（4)仪器冷却，25°C lmin〇
[0043]优选地，所述HBV pgRNA的提取的步骤，包括：
[0044] 1)在样品反应管中加入1 OyL蛋白酶K、4yL助沉剂、300yL病毒裂解液，20yL磁珠，充 分振荡混匀；
[0045] 2)加入200yL待处理样本，振荡混匀各离心管，室温颠倒混匀10分钟，使磁珠和核 酸充分结合；
[0046] 3)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液，吸 附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来；
[0047] 4)加入500yL洗液A，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离 后去上清；
[0048] 5)加入500yL洗液B，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离 后去上清；
[0049] 6)将离心管放置在磁力架上，缓慢加入550yL洗液C，静置1分钟磁分离后弃去上清 液，取下离心管；
[0050] 7)加入50yL洗脱液，用移液器缓慢吹打混匀，55 °C温育5分钟，期间轻轻晃动溶液 两次；
[0051] 8)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离心管 中，获得HBV pgRNA粗品。
[0052] 应用上述方法获得的PCR扩增产物序列如SEQ ID N0:8所示。
[0053]优选地，所述样本处理的步骤，包括：
[0054]血清样本采集:抽取静脉血3_5mL，注入无菌收集管，待样本自行析出血清或直接 室温1600rpm离心5分钟分离出血清；
[0055]血浆样本采集:抽取静脉血3-5mL，注入含有EDTA的无菌收集管，立即轻轻颠倒混 勾，待样本自行析出血衆或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血衆。
[0056]本发明还提供了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒，其特征在于，该试 剂盒包括有权利要求1所述的引物和探针。
[0057] 优选地，该试剂盒，还包括：阴性质控品、定量标准品I、定量标准品II、定量标准品 III、定量标准品IV。
[0058] 优选地，所述试剂盒包括:蛋白酶K、助沉剂、病毒裂解液、磁珠、洗液A、洗液B、洗液 C、洗脱液、引物探针混合液、反应液、样本稀释液、阴性质控品、定量标准品I、定量标准品 11、定量标准品III、定量标准品IV、内标模板，各组份含量为： 蛋白酶 Κ： 240μΙχ1; 助沉剂 96 μLχ? ; 病毒裂解液 7.2mlxl ; 磁珠 480 μΙχ1 洗液 A 12ηι|χ1 * 洗液 Β 12._mlxl :; 洗液 C 13,2 mix 1: 洗脱液 1200 μLχ?
[0059] 引物探针混合液 126 μLχ? ; 反应液 630 μ1χ 1; 样本稀释液 1 ιη1χ 1 ; 阴性质控品 2.Ι0μΜ ; 定量标准品I 210μΜ ; 定量标准品II 210μ|χ1; 定董标准品III 210 μLχ?; 定量标准品IV 210μ|χ1 * 内标模板 200 μLχ 1 〇
[0060] 本发明提供的检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒应用于乙肝患者血液 中HBV PgRNA的检测。所述检测包括HBV PgRNA定性检测和/或定量检测。该试剂盒使用方 便，检测灵敏度极高，检测结果可靠。
[0061] 与现有技术相比，本发明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂 盒，达到了如下效果：
[0062] 1)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法为血液检测，无创，常规且可大规模 应用，解决HBV cccDNA依赖肝穿的问题。
[0063] 2)本申请提供的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂盒超越常规病 原体RT-PCR技术，可检测血液中超低载量的PgRNA。
[0064] 3)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测的试剂盒解决临床上依赖HBV DNA指标， 判断抗病毒治疗停药后，出现"停药后复发"的问题，给"乙肝临床指南十大待解决问题之 一"的"寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志"的问题解决提供了方案。
[0065] 4)HBV PgRNA试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为 开发PgRNA药物提供基础研究数据。
【附图说明】
[0066] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0067] 图1是本发明实施例1所述的qPCR的结果分析图。
[0068]图2是本发明实施例1所述的qPCR的结果分析图。
[0069] 图3是本发明实施例1所述的qPCR的结果分析图。
[0070] 图4是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0071] 图5是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0072] 图6是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0073] 图7是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0074] 图8是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0075] 图9是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0076] 图10是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0077] 图11是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0078] 图12是本发明实施例2所述的实验结果图。 图13是本发明实施例2所述的实验结果图。 图14是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0079] 图15是本发明实施例2所述的实验结果图。
[0080] 图16是本发明实施例3所述的实验结果图。
[0081]图17是本发明实施例4所述的实验结果图。
[0082] 图18是本发明实施例4所述的实验结果图。
【具体实施方式】
[0083] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应 可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名 称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通 篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为一开放式用语，故应解释成"包含但不限定 于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述 技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述 描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围 当视所附权利要求所界定者为准。
[0084] 以下结合附图对本申请作进一步详细说明，但不作为对本申请的限定。
[0085] 实施例1
[0086] 1.样本采集:采集血清或血浆。
[0087] 1)血清样品采集：用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血3~ 5mL，注入无菌收集管，室温放置不超过4小时，待样本自行析出血清或直接室温1600rpm离 心5分钟分离出血清，转移到1.5mL灭菌离心管中备用。
[0088] 2)血浆样品采集：用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血3~ 5mL，注入含有EDTA的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，室温放置不超过4小时，待样本自行 析出血浆或直接室温1600rpm离心5分钟分离出血浆，转移到1.5mL灭菌离心管中备用。 [0089] 2.HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中 的HBV RNA。
[0090] 实验开始前取出试剂盒所需组分，轻微振荡，使其充分混匀，如试剂中有沉淀，请 溶解后使用，样本如为冷冻冷藏检测前先恢复至室温。操作时，如发现管壁和管盖有液体， 短暂离心使液体甩入管底，再置于磁力架上。
[0091] 1)取N+5个1.5mL灭菌离心管(N为需要提取临床样本的数量，另5个离心管用于试 剂盒定量标准品及阴性质控品的提取），分别加入l〇yL蛋白酶K、4yL助沉剂、300yL病毒裂解 液，20yL磁珠(使用前充分振荡混匀），加入200yL待处理样本，振荡混匀各离心管，室温颠倒 混匀10分钟，使磁珠和核酸充分结合。
[0092] 2)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液，吸 附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来；
[0093] 3)加入500yL洗液A，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离 后去上清；
[0094] 4)加入500yL洗液B，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离 后去上清；
[0095] 5)将离心管放置在磁力架上，缓慢加入550yL洗液C，静置1分钟磁分离后弃去上清 液，取下离心管；
[0096] 6)加入50yL洗脱液，用移液器缓慢吹打混匀，55 °C温育5分钟，期间轻轻晃动溶液 两次；
[0097] 7)将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离心管 中，获得HBV pgRNA粗品。
[0098] 3.HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase-free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA。
[0099] 1)建立如下反应体系：
[0100] RNase-Free DNase 10X反应缓冲液lul;
[0101] RNase-Free DNaselul/ug；
[0102] RNA无核酸酶的水补足至10ul;
[0103] 将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取l-8ul加入如下反应体系中；
[0104] 2) 37 °C孵育半小时；
[0105] 3)加入lul终止液终止反应；
[0106] 4)65°C孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；
[0107] 4 · pgRNA的定量检测:使用qRT-PCR定量检测pgRNA。
[0108] 实验开始前取出试剂盒各组分，充分解冻并持续振荡15秒混匀。准备相应数量的 PCR仪样品反应管，除样本外还应包括1个阴性质控品及4个定量标准品反应管。
[0109] 1)配置反应液
[0110] 确定反应数N，N =待检样本数(η) +质控品数(5)+1。计算加到反应混合物中的各个 试剂的量，计算如下表：
[0111]
[0112]
[0113] 所述引物:上游引物包含如SEQ ID N0:3所示的碱基序列；
[0114] 下游引物包含如SEQ ID N0:6所示的碱基序列；
[0115] 所述探针，包含如SEQ ID N0:7所示的碱基序列。
[0116] 2)在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μ!7管分装至PCR仪样品反应管 中待用。
[0117] 4)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5yL加入 相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液 体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽。
[0118] 5)根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT-PCR反应;具体条 件如下：
[0119]
[0120] 5.结果分析及判定:采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。
[0121]采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，以均数土标准差表示，P<0.05为差异有统 计学意义。
[0122] l)pgRNA的定性分析：
[0123] 检测PCR扩增序列:得到如SEQ ID N0:7所示的碱基序列。
[0124] 通过"标准曲线法"进行：
[0125] 由于本申请中PCR扩增产物为159bp，这一段序列为pgRNA独有的序列，其余RNA不 含有，所以，在排除HBV DNA污染的情况下：
[0126] 如果提取液中含有pgRNA，qPCR扩增将出现扩增曲线；
[0127] 如果提取液中不含有pgRNA，qPCR将没有扩增曲线出现，即为阴性。
[0128] 2)pgRNA的定量分析:通过"标准曲线法"进行（以BIO-RAD CFX96为例）：
[0129] 需要4个梯度浓度的标准品，我们采用的是假病毒(或者质粒），分别为A，B，C，D，其 浓度为A: 1 · 0 X 10~6copies/ml，B: 1 ·0 X 10~5copies/ml，C: 1 ·0 X 10~4copies/ml，D: 1 ·0 X 10~3copies/ml，qPCR结果如图1所示。SPSS21.0统计软件自动绘制标准曲线如图2所示，图 中圆圈处为4个定量标准品，X处为待测样本，根据待测样本的Ct值，从标准曲线中读出待 测样本的量，软件自动给出结果，如图3所示。由图3可得到:待测样本的Ct值为33.69,相应 的 pgRNA 定量为 6 · 732xl0~4copies/ml。
[0130] 实施例2
[0131] 引物、探针的设计：
[0132] 目前，我国HBV基因型以B型和C型为主，还有少量D型，另外还存在少量的上述基因 型的融合型。
[0133] 本发明在设计引物和探针时，同时考虑并兼顾了B型、C型和D型。参照国际公认数 据库NCBI中所有HBV B型、C型和D型的序列，经比对后，选取了PgRNA差异于其它mRNA的序列 部分，即大约1800bp~2800bp之间的部分进行分析。设计的引物和探针均位于HBV各基因型 保守区序列或者相对保守区序列，确保了"专利所用引物和探针"对中国HBV各类常见基因 型的兼容性。设计出如SEQ ID N0:l-N0:6所示的碱基序列的引物，如SEQ ID N0:7所示的碱 基序列的探针。
[0134] 引物、探针的筛选:PgRNA特异性引物，共3条上游引物(FI、F2、F3，对应如SEQ ID N0:l-N0:3所示的碱基序列），3条下游引物(Rl、R2、R3对应如SEQ ID N0:4-N0:6所示的碱 基序列），一条公用探针(FP对应如SEQ ID N0:7所示的碱基序列）：
[0135] 1.3条上游引物与3条下游引物两两组合共9种组合，所用探针均为FP，所以共9种 引物探针组合，具体如下表：
[0136]
[0137] 实验结果:通过数次实验多样本的比较，整体实验效果F3组合〉F2组合〉F1组合，部 分实验结果如下图4-图6所示。下次实验挑选出F3组合和F2组合继续验证。
[0138] 2.挑选出的F3组合和F2组合继续实验，共6种引物探针组合，分别命名为AB⑶EF， 具体如下表：
[0139]
[0140] 实验结果:通过数次实验多样本的比较，C和F(即F2R3组合和F3R3组合)实验效果 要好于其它组合，部分实验结果如下图7-图12所示。下次实验挑选出C和F继续验证。
[0141] 3.继续验证F2R3组合和F3R3组合。
[0142] 实验结果:通过数次实验多样本的比较，F3R3组合整体实验效果要好于F2R3组合， 部分实验结果如下图13-图14所示。所以最后选出的引物探针组合为:F3R3FP。
[0143] HBV DNA病毒载量分别为1.0 X 108IU/ml~1.0 X lOhU/ml，梯度稀释的8个浓度，用 自行设计的PgRNA特异性探针进行扩增。因为HBV DNA和PgRNA扩增的序列相同，因此用此引 物探针组合同样可以扩增HBV DNA。具体实验结果如图15所示，1.0X108IU/ml~1.0X 103IU/ml浓度样本结果均匀分布，1.0 X 102IU/ml~1.0 X lOhU/ml的样本未扩出。
[0144] 实施例3
[0145] HBV pgRNA提取液DNA扩增验证
[0146] 应用实施例2中筛选出的引物、探针PCR扩增HBV pgRNA，应用软件SPSS 21.0统计 软件分析结果，会得到如图16所示的图像。出现HBV DNA扩增曲线。病毒RNA提取液中会出现 残留DNA的现象，残留少量的HBV DNA会对后续的RNA逆转录扩增造成影响，因此必须去除。
[0147] 实施例4
[0148] 使用RNase-free Dnase I消除HBV DNA的验证：
[0149] 应用如实施例1中的使用RNase-free Dnase I对获得的HBV pgRNA处理后，对HBV pgRNA进行PCR扩增，应用软件SPSS 21.0统计软件分析结果，会得到如图17所示的图像，未 出现HBV DNA扩增曲线。因此该方法可以有效地纯化HBV pgRNA，消除残留的HBV DNA会对后 续的RNA逆转录扩增造成影响。
[0150] 对两例纯净pgRNA样本按照实施例1的方法监测分析，其病毒载量分别为1.9 X 105IU/ml和3.8 X 107IU/ml，PCR结果图18所示。靠前的是载量为1.9 X 105IU/ml的样本，靠后 的为3.8X107IU/ml的样本。从图中可以看出，HBV DNA载量较高的样本PgRNA定量反而较 低。
[0151] 实施例5
[0152] PgRNA试剂盒组成如下表所示：
[0153]
[0154] 所述引物包含如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:6所示的碱基序列，；
[0155] 所述探针包含如SEQ ID NO:7所示的碱基序列。
[0156] 上述试剂盒的技术指标：
[0157] 1)最低检出限
[0158] 在 102copies/ml、5X 102copies/ml、l X 103copies/ml、2X 103copies/ml四个滴度 处进行十次重复检测，至少在1 X l〇3copies/ml处阳性率为100%。
[0159] 2)精密度
[0160] 同一批试剂对浓度为lX103copies/ml的样本进行10次重复检测，Ct值的检测结 果CVS 5% 〇
[0161] 3)线性范围
[0162] 对浓度大于1 X 108copies/ml样本进行倍比稀释，分别进行检测，线性范围至少达 至Ijl X 103~1 X 108copies/ml。
[0163] 4)对不同基因型的覆盖
[0164] 对中国常见的乙型肝炎病毒(B、C、D基因型）的pgRNA均能做到有效检测。
[0165] 5)特异性
[0166] a.分别对含有!1(^、!《1^48￥、甲型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒11 型、甲型流感病毒等病原体的样本进行检测，检测结果均为阴性；
[0167] b.干扰物质:样本中常见干扰物质高浓度的胆红素、甘油三酯、血红蛋白、总IgG对 PCR结果无明显干扰；
[0168] c.药物影响：常用抗病毒药物高浓度的干扰素和拉米夫定对PCR检测结果无明显 干扰。
[0169] 6)稳定性
[0170]试剂盒有效期至少达到12个月。
[0171] 实施例6
[0172] 乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒的应用：
[0173] 1.病例的入组：确诊为慢性乙型肝炎病毒感染者，排除合并感染HCV、HIV患者，肝 硬化、肝癌患者，妊娠期妇女及婴幼儿患者。研究对象分组如下：
[0174] (1 )a组:未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者，10例；
[0175] (2) b组:经抗病毒治疗3个月以上的慢性HBV感染者，10例；
[0176] (3)c组:经抗病毒治疗停药3个月内病毒学复发或临床复发的患者，10例；
[0177] (4)d组:经抗病毒治疗停药后1年内未复发的患者，10例。
[0178]记录所有入组病人的临床资料，包括病人的性别、年龄、血常规、乙肝五项、HbsAg 定量、HBV DNA载量、PgRNA定量、肝功能(ALT、AST)、抗病毒治疗方案以及抗病毒治疗持续时 间等，使用实施例5提供的试剂盒按照试剂盒操作标准测定标本中的PgRNA。
[0179] 3.统计数据，分析实验结果，分析各组病例的PgRNA的含量。
[0180] 与现有技术相比，本发明所述的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂 盒，达到了如下效果：
[0181] 1)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法为血液检测，无创，常规且可大规模 应用，解决HBV cccDNA依赖肝穿的问题。
[0182] 2)本申请提供的乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测方法、试剂盒超越常规病 原体RT-PCR技术，可检测血液中超低载量的PgRNA。
[0183] 3)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测的试剂盒解决临床上依赖HBV DNA指标， 判断抗病毒治疗停药后，出现"停药后复发"的问题，给"乙肝临床指南十大待解决问题之 一"的"寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志"的问题解决提供了方案。
[0184] 4)乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的检测的试剂盒及其在预测NA停药的应用可深 入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。
[0185] 由于方法部分已经对本申请实施例进行了详细描述，这里对实施例中涉及的系统 与方法对应部分的展开描述省略，不再赘述。对于系统中具体内容的描述可参考方法实施 例的内容，这里不再具体限定。
[0186] 上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申 请所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在 于，其包括如下实现步骤： 样本处理:取外周血3-5ml注入无菌收集管，室溫放置； 皿V PgRNA的提取：使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的皿V RNA，获得皿V RNA粗品； HBV P排NA的纯化：使用使用脚ase-free Dnase I纯化提取的皿V PgRNA，包括如下步 骤： 1) 建立如下反应体系： RNase-Free 丽ase IOX反应缓冲液Iul; RNase-Free DNaselul/ug； RNA无核酸酶的水补足至IOul; 将获得的HBV PgRNA粗品溶于洗脱液中，取I-Sul加入如下反应体系中； 2) 37 °C解育半小时； 3) 加入Iul终止液终止反应； 4) 65°C解育10分钟，使面ase失活，得到HBV PgRNA的纯品； PgRNA的定量检测:使用qRT-PCR定量检测PgRNA，包括:如下步骤： 1) 配制qRT-PCR反应体系， qRT-PCR反应体系： PCR反应液12.5化； 引物探针混合液1.加1; 灭菌蒸馈水化L 所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列； 下游引物包含如SEQ ID NO:6所示的碱基序列； 所述探针，包含如SEQ ID NO:7所示的碱基序列； 2) 各反应管在縱满振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离屯、后按20化/管分装至PCR仪样品反 应管中待用； 3) 将皿V PgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取化L加入相应 的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离屯、机离屯、10秒，将管壁上的液体全 部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽； 4) 将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环 条件，完成qRT-PCR反应； 结果分析及判定:采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。2. 根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述PCR的反应条件：（1)预变性的条件，95〇C3min; (2)变性的条件，94〇C 15sec X 40个循环； (3)退火，延伸，巧光采集，60°C35secX40个循环；（4)仪器冷却，25°Clmin。3. 根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述皿V PgRNA的提取的步骤，包括： 1)在样品反应管中加入10化蛋白酶K、4化助沉剂、300化病毒裂解液，20化磁珠，充分振 荡混匀； 2) 加入20化L待处理样本，振荡混匀各离屯、管，室溫颠倒混匀10分钟，使磁珠和核酸充 分结合； 3) 将离屯、管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液，吸附在 离屯、管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来； 4) 加入50化L洗液A，縱满振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去 上清； 5) 加入50化L洗液B，縱满振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁分离后去 上清； 6) 将离屯、管放置在磁力架上，缓慢加入55化L洗液C，静置1分钟磁分离后弃去上清液， 取下离屯、管； 7) 加入50化洗脱液，用移液器缓慢吹打混匀，55 °C溫育5分钟，期间轻轻晃动溶液两次； 8) 将离屯、管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离屯、管中，获 得皿V PgRNA粗品。4. 根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述引物的扩增产物序列如SEQ ID NO:8所示。5. 根据权利要求1所述的检测乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的方法，其特征在于，所 述样本处理的步骤，包括： 血清样本采集:抽取静脉血3-5mL，注入无菌收集管，待样本自行析出血清或直接室溫 160化pm离屯、5分钟分离出血清； 血浆样本采集:抽取静脉血3-5mL，注入含有抓TA的无菌收集管，立即轻轻颠倒混匀，待 样本自行析出血浆或直接室溫ieOOrpm离屯、5分钟分离出血浆。6. 检测乙型肝炎患者血液中皿V PgRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要 求1所述的引物和探针。7. 根据权利要求6所述的检测乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的试剂盒，其特征在于， 该试剂盒，还包括：阴性质控品、定量标准品I、定量标准品11、定量标准品111、定量标准品 IV。8. 根据权利要求6或7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:蛋白酶K、助 沉剂、病毒裂解液、磁珠、洗液A、洗液B、洗液C、洗脱液、引物探针混合液、反应液、样本稀释 液、阴性质控品、定量标准品I、定量标准品11、定量标准品111、定量标准品IV、内标模板，各 组份含量为：9. 权利要求6所述检测乙型肝炎患者血液中皿V P排NA的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒应用于乙肝患者血液中皿V PgRNA的检测。10. 根据权利要求9所述的检测乙型肝炎患者血液中皿V PgRNA的试剂盒，其特征在于， 所述检测包括皿V PgRNA定性检测和/或定量检测。
【文档编号】C12Q1/70GK105907891SQ201610364652
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】叶锋, 刘明坤, 余荣
【申请人】北京旌准医疗科技有限公司