抗egfr蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗egfr单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗EGFR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产 生的抗EGFR单克隆抗体和应用。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)属于I-型受体 酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase,RTK)家族的成员，主要表达于上皮细胞的细胞质 膜上。当EGFR与其配体结合后，会发生二聚化，从而被激活。激活的EGFR通过细胞信号转 导途径促进细胞生长与迀移。因而EGFR信号通路的过度活化与肿瘤的发生有着密切的关 系。已有研究发现，多种肿瘤的发生与EGFR受体的过量表达相关。
[0003] 目前临床上主要通过免疫组织化学（IHC)病理实验检测肿瘤细胞中EGFR蛋白的 表达状况。IHC实验的核心为特异性结合EGFR蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定 着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对EGFR蛋白的单克 隆抗体具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供抗EGFR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗EGFR单 克隆抗体和应用。本发明所述单克隆抗体可与EGFR蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白 无交叉反应，显著提高了EGFR蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细 胞内EGFR蛋白表达水平，可应用于肺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌中EGFR蛋白表 达水平的检测。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种单克隆抗体，其与表皮生长因子受体（EGFR)蛋白特异性结合。
[0007] 在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNo. 11082 的杂交瘤细胞株产生。
[0008] 本发明还提供了所述单克隆抗体在制备用于检测表皮生长因子受体（EGFR)蛋白 的免疫检测工具中的应用。
[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试 纸。
[0010] 本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括所述单克隆抗体。
[0011] 本发明还提供了所述单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试剂或试剂盒中的 应用。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试 剂或试剂盒中的应用中所述组织细胞选自肺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌或相关 肿瘤。所述相关肿瘤为与上述组织、细胞相同的肿瘤。
[0013] 本发明还提供了一种标记组织细胞的试剂盒，包括所述单克隆抗体。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述标记组织细胞的试剂盒中所述组织细胞选 自肺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌或相关肿瘤。所述相关肿瘤为与上述组织、细胞 相同的肿瘤。
[0015] 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo. 11082。
[0016] 与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株（保藏编号为CGMCC No. 11082)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Umab95。本发明还提供了单克隆抗体 Umab95在制备用于检测EGFR蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体Umab95的免疫 组化试剂盒，以及单克隆抗体Umab95在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述 单克隆抗体可与EGFR蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了EGFR 蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内EGFR蛋白表达水平，可应 用于肺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌组织中EGFR蛋白表达水平的检测。
[0017] 生物保藏说明
[0018] 用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB95的分类命名为：表皮生长因子受体（EGFR)单克 隆抗体杂交瘤细胞株；
[0019] 保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0020] 保藏单位简称：CGMCC;
[0021] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
[0022] 保藏日期：2015年07月03日；
[0023]保藏编号：CGMCCNo. 11082。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0025] 图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为0RF区；
[0026] 图2示实施例2重组EGFR蛋白Westernblot检测结果图，以anti-DDK检测重组 EGFR蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗 原的检测结果、泳道R为转染pCMV6-rEGFR质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；
[0027] 图3示实施例2重组EGFR蛋白SDS-PAGE结果图；用抗DDK亲和层析柱纯化重组 EGFR蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；
[0028] 图4示实施例3以单克隆抗体Umab95识别不同肿瘤细胞系内源EGFR蛋白的 Westernblot检测结果图。从左至右分别为：!fepG2，HeLa，SVT2，A549，C0S7，Jurkat，MDCK， PC12,MCF7 ；
[0029] 图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人前列腺组织免疫组化结果图（一抗 为EGFR单克隆抗体Umab95);
[0030] 图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱癌组织免疫组化结果图（一抗 为EGFR单克隆抗体Umab95);
[0031] 图-7示实施例50riGene蛋白芯片鉴定结果图（一抗为EGFR单抗Umab95，l:100 ; 二抗为DyLight649-conjugatedAffiniPureFragmentGoat-anti-MouseIgG，1:400)。
【具体实施方式】
[0032] 本发明公开了抗EGFR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗EGFR单克隆抗体 和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应 用本发明技术。
[0033] 本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（简称为CGMCC)，保藏日期为2015年07月03日，保藏编号为CGMCCNo. 11082。
[0034] 本发明还提供了一种特异性结合EGFR蛋白的单克隆抗体Umab95,由上述杂交瘤 细胞株产生。
[0035] 本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
[0036] (1)重组表达载体的构建：根据EGFR0RF核苷酸序列（EGFR0RF核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示，1215bp;EGFR氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示）
[0037] 设计引物PCR扩增EGFR0RF第lbp位到第1215bp位序列，基因两侧分别引入 限制性内切酶位点Sgfl和Mlul，插入表达载体pCMV6-Entry，构建EGFR的重组表达质粒 pCMV6-rEGFR;上游扩增引物序列，SEQIDNO. 3:CACGCGATCGCATGCGACCCTCCGGGACGGCC:下 游扩增引物序列SEQIDNO. 4:ACCGACGCGTGGCCGTCCCGGAGGGTCGCAT
[0038] (2)EGFR重组蛋白的表达与纯化：将EGFR重组表达质粒转化HEK293T细胞，裂