由杂交瘤细胞株分泌抗ttf-1单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种由杂交瘤细胞株分泌抗TTF-I单克隆抗体及其应用。具体而言， 本发明提供了一种抗肿瘤细胞TTF-I蛋白质分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变 区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化 方式，以免疫组织化学染色（IHC)、酶联免疫吸附（ELISA)或免疫印迹（WesternBlot)方式 检测细胞中P63的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002] 甲状腺转录因子-I(thyroidtranscriptionfactor-l)，即TTF-1 表达于甲状 腺腺上皮和肺的上皮细胞中。在肺肿瘤研究中发现，大多数肺的小细胞癌、原发性和转移 性肺腺癌、少部分大细胞未分化肺癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示为 TTF-I阳性，在甲状腺乳头状腺癌中TTF-I也呈阳性，而TTF在其它组织中无表达，据此， TTF-I被认为可用来鉴别肺腺癌与鳞癌，并有助于与肺转移性腺癌的鉴别。TTF-I与血清 TSH的活性有关，活性的TSH-R可增强TTF-I的表达。在良恶性甲状腺组织中，TTF-I表达 的情形不同，正常甲状腺和良性腺瘤表达高，而甲状腺乳头状癌与滤泡癌中表达量低，在未 分化癌中则不表达。75%的肺非小细胞癌（NSCLCs)中的TTF-I呈阳性表达，在腺癌（ACs) 中的表达明显高于鳞癌（SCC)，90%以上的原发性小细胞肺癌（SCLC)表达阳性，TTF-I 在非小细胞肺癌（NSCLCs)阳性表达强度与病人的预后成呈负相关，可作为一项独立的预 后指标，肺的典型性类癌（TCS)均为阴性，表明小细胞肺癌和非小细胞肺癌可能有一个不 同于TCS的共同起源的理论。
[0003] 因此，TTF-I可以作为诊断甲状腺、肺肿瘤的一个重要标记，其阳性染色位置在胞 核。TTF-I的抗体可应用在肺、甲状腺及一些神经内分泌来源的肿瘤诊断及鉴别诊断中，并 且在判断预后方面也有着非常显著的应用前景。
[0004] 最近发现TTF-I抗体在肝细胞癌内呈现较高比率的阳性表达，只是这种染色方式 与一般的TTF-I染色不同，主要在细胞质表达。国内外已有学者证实TTF-I抗体在肝细 胞癌内的胞质染色阳性率达到64-93%，而在肝胆管细胞癌、转移性腺癌、肾透明细胞癌等 染色率均较低，故认为TTF-I抗体可作为一个辅助指标用于HCC的诊断及鉴别诊断。文 献日本临床细胞学会杂志，47 (2) :146-147描述了以免疫组化法测定肺癌的方法，在该 方法中首先使用甲状腺转录因子1(TTF-1，ThyroidTranscriptionFactor1)、天冬氨酸 蛋白酶A(Napsin-A)以及p63区别高级神经内分泌肿瘤、腺癌以及鳞状细胞癌，然后再以 细胞角蛋白18 (CK18)来鉴别大细胞神经内分泌癌（LCNEC，LargeCellNeuroendocrine Carcinoma)和小细胞癌。公开号为CN102405238A的发明专利"测定癌症组织学类型的抗 体鸡尾酒测定试剂盒及测定方法"公开了一种利用Napsin-A和腺癌细胞核中的TTF-I的抗 体构成鸡尾酒检测方式对肺癌组织类型进行鉴别的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种制备TTF-I重组蛋白片段的方法，该重组蛋白由 N端融合的GST标签、Gly4Ser连接肽、TTF-I的第1位至123位片段及用于纯化的组氨酸 标签组成。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的TTF-I单克隆抗体的制备 方法，该抗体由杂交瘤细胞分泌，能特异结合TTF-I重组抗原和天然抗原。所述的小鼠杂交 瘤细胞系为小鼠杂交瘤细胞系600662-18F7,已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路一号院3号，保藏号 为CGMCCNo. 10399。
[0007] 本发明的第三个目的是提供一种可用于肺肿瘤免疫组化诊断的抗体。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明针对TTF-I蛋白，按照Uniprot及Genbank公布的序列进行分析，依据其抗原 性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的第1 位到第123位N端区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便 于纯化，在重组蛋白的N端融合有GST蛋白及便于折叠的甘氨酸-丝氨酸连接肽，在其C端 融合有便于纯化和检测的组氨酸标签。经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-30a中进行 重组表达，对表达的包涵体蛋白纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组 TTF-I蛋白筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0009] 利用该杂交瘤细胞系对小鼠进行腹水制备，ProteinA/G柱亲和层析纯化腹水，获 得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgGl型单克隆抗体，亲和常数 为3. 84X109。免疫印记（Westernblotting)实验显示该抗体能特异识别重组的TTF-I蛋 白以及表达TTF-I蛋白的肿瘤细胞。
[0010] 具体地，本发明涉及以下几个方面： 一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。所述的小鼠杂交瘤细胞系为小鼠杂交瘤 细胞系600662-18F7,已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心登记保藏，保藏号为CGMCCNo. 10399。
[0011] 所述单克隆抗体是一种可识别SEQIDNO. 1所示序列的完整TTF-I蛋白序列，其 亲和力常数为3.84X109。
[0012] 所述的单克隆抗体，其制备中所用的抗原是将具有SEQIDNO. 2所示的核苷酸序 列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的具有SEQIDNO. 3所示序列的TTF-I第1为至第 123位氨基酸序列片段。
[0013] 所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO. 4和SEQID NO. 5所示的DNA序列所编码。
[0014] 所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQIDNO. 6和SEQ IDNO. 7所示的氨基酸序列。
[0015] 所述的单克隆抗体，其为小鼠IgGl亚型单克隆抗体。
[0016] 所述的单克隆抗体，其识别重组TTF-I和病理组织细胞的TTF-I分子。
[0017] 所述的单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。
[0018] 本发明的优点及有益效果 (1)本发明获得的杂交瘤（60662-18F7)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白 TTF-I分子和表达TTF-I的肿瘤细胞，能够检测高表达TTF-I蛋白的肺腺癌、肺支气管肺泡 癌、肺小细胞癌、肺胚层细胞瘤、肺泡腺瘤、肺乳头状腺瘤、甲状腺腺瘤、甲状腺滤泡性癌、甲 状腺乳头状癌、甲状腺髓样癌等多种肿瘤组织。
[0019] (2)本发明获得的杂交瘤（60662-18F7)为一种IgGl类抗体，与TTF-I蛋白的结合 有极强特异性和敏感性。
[0020] (3)本发明获得的杂交瘤（60662-18F7)产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学 (IHC)、免疫印记（Westernblotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和 灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化SPT24抗体的对比实验中，本发明细胞株制备的抗 体60662-18F7染色强度更强，对肺癌的检测敏感性更高，具有更广的应用范围，可显著提 高诊断的准确度。
【附图说明】
[0021] 图l:ITFl-pET30a-GST-codonplus的表达和纯化 电泳条件：12%，SDS-PAGE凝胶电泳。样本说明：1:诱导表达的全菌经超声处理后样 本；60mM咪唑洗脱的GST-融合TTF-I片段重组蛋白，大小约为45kDa;Marker:蛋白质分 子量标记，上样量20yL。
[0022] 图2:抗体的识别特性和实际应用效果 应用纯化的