抗pr蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pr单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗PR单克隆抗体和应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全球每年有上百万妇女患乳腺癌，几十万人 死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。在我国近年来 乳腺癌发病率增长趋势明显，在一些城市已成为女性恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌已成为 妇女健康的最大威胁。
[0003] 内分泌治疗是乳腺癌主要治疗方法之一，已成为乳腺癌治疗的重要组成部分。影 响乳腺癌内分泌治疗效果的主要因素是雌激素受体（ER)和孕激素受体（PR)的表达情况。 有学者统计，ER+/PR+患者ΤΑΜ治疗有效率约60-75%，ER+/PR患者下降至35~50%，并且， 即使是ER/PR患者接受ΤΑΜ治疗后仍然有5%的患者可以从中获益。接受ΤΑΜ治疗的ER+/ PR+患者复发及死亡相对危险性与ER+/PR患者相比下降15%~30%，说明PR对内分泌治 疗效果有较大的影响。
[0004] 孕激素受体（PR)属于核受体家族转录因子，通过和孕激素结合导致受体二聚化， 与特定靶基因启动子区的顺式作用元件结合，调节敏感靶基因的转录。PR是孕激素作用的 靶点，其可促进孕激素刺激激素依赖性乳腺癌细胞的生长。PR至少包括两种不同亚型即 94kD的hPR-A和116kD的hPR-B，在正常子宫内膜及乳腺上皮细胞中表达，同时也在部分乳 腺癌的肿瘤细胞中表达，是乳腺癌预后及激素治疗的重要指示因子。同时，PR也在一些卵 巢癌和子宫内膜癌病患肿瘤细胞中表达。
[0005] 目前在临床上通常用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC)病理实验检测 肿瘤细胞中PR的表达状况；而在科研上则多用蛋白印记和流式细胞术等方法来检测PR的 表达水平；但这些实验方法的核心为特异性结合PR的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定 着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对PR蛋白的单克隆 抗体具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的 抗PR单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与PR蛋白的结合特异性并应用 到相关广品的制备中。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO:11083。
[0009] 本发明所述抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：
[0010] (1)重组表达载体的构建：根据PR片段（l-298aa，PR-N298)0RF核苷酸序列 (PR-N2980RF核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，894p;PR-N298氨基酸序列如SEQIDNO. 2 所示）设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点EcoRI和Bglll，插入 表达载体pET-23b(货号Cat.No. 69771-3,Novagen公司），构建PR-N298片段重组表达质 粒pET-23b/PR-N298 ;
[0011] (2)PR片段重组蛋白的表达与纯化：将PR片段重组表达质粒转化E.Coli感受态 细胞，挑单克隆扩增培养，IPTG诱导后收获细菌，裂解离心取上清，NTA亲和层析柱纯化，获 得纯化的PR重组蛋白片段；
[0012] (3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的PR重组蛋白片段免疫BALB/c小 鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂 交瘤细胞，获得能分泌抗PR特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通 过亲和层析柱纯化获得PR单克隆抗体。分别通过蛋白印记（Western-Blot)、流式细胞术 (FC)、免疫组化（IHC)检测实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
[0013] 经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗PR单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名 为UMAB136,亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保 藏编号为CGMCCN0 :11083。
[0014] 同时，本发明还提供一种抗PR蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO:11083的 杂交瘤细胞分泌产生。制备抗PR蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过无血 清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PR单克隆抗体。
[0015] 本发明所述保藏编号为CGMCCNO:11083的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生 的抗PR蛋白单克隆抗体为IgG2a型，效价较高。所述单克隆抗体的免疫组化检测结果显示， 其能够识别正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中的PR蛋白；在流式细胞术检测中，其能 够检测人乳腺癌细胞系MCF-7中PR蛋白；在蛋白印记检测中，其能够检测到转染PR重组 质粒（RC221303)的HEK293T细胞裂解液以及MCF-7中PR蛋白，分子量大小与预期相符，而 239T细胞中则没有相应大小的条带，表明本发明所述单抗能检测到PR蛋白的特异性表达。
[0016] 同时，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所 述单克隆抗体与近10000种其他蛋白无交叉反应。
[0017] 因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO:11083的的杂交瘤细胞在制备抗PR 蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗PR蛋白单克隆抗体在制备检测PR蛋白的免疫检 测产品中的应用。
[0018] 作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。
[0019] 本发明还提供一种用于蛋白印记检测、流式细胞术检测和免疫组化检测的试剂 盒，包括保藏编号为CGMCCNO:11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR蛋白单克隆抗体。所 述免疫检测试剂盒可检测组织（包括正常组织和肿瘤组织）细胞以及体外培养的PR阳性 的肿瘤细胞系中PR的表达状况。
[0020] 此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNO:11083的杂交瘤细胞分泌产生的抗PR 蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织的试剂盒中的应用。
[0021] 作为优选，所述肿瘤包括乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和宫颈癌。
[0022] 本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗PR蛋白单克隆抗体，且与PR蛋白特 异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了PR蛋白免疫检测 的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织特别是乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌 和宫颈癌等肿瘤组织的检测和标记。
[0023] 生物保藏信息说明
[0024] UMAB136,分类命名为孕激素受体（PR)单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2015年7月3 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0 :11083。
【附图说明】
[0025] 图1所示为实施例1中PR蛋白Westernblot检测结果图，以anti-His检测PR 蛋白在E.Coli中的表达，其中泳道L为转染空载体pET-23b的E.Coli裂解液为抗原的检 测结果、泳道R为转染pET-23b/PR-N298质粒的E.Coli裂解液抗原的检测结果；
[0026] 图2所示为实施例2中PR-N298纯化蛋白SDS-PAGE结果图；
[0027] 图3所示为实施例4中PR蛋白Westernblot检测结果图，以UMAB136分泌产生 PR单克隆抗体（1:2000)检测阴性对照细胞293T，转染PR真核表达质粒RC221303的细胞 裂解液，以及PR阳性的MCF-7细胞裂解液；
[0028] 图4所示实施例5人乳腺癌细胞系中流式细胞术检测结果图（一抗为UMAB136分 泌产生PR单克隆抗体）；其中，A信号区域表示检测人乳腺癌细胞系MCF-7中PR蛋白，图中 B信号代表阴性对照抗体信号；
[0029] 图5所示实施例6正常乳腺组织中免疫组化检测结果图（一抗为UMAB136分泌产 生PR单克隆抗体）；
[0030] 图6所示实施例6正常子宫内膜组织中免疫组化检测结果图（一抗为UMAB136分 泌产生PR单克隆抗体）；
[0031] 图7所示实施例6子宫内膜癌组织免疫组化检测结果图（一抗为UMAB136分泌产 生PR单克隆抗体，1:150);
[0032] 图8所示实施例70rigene蛋白芯片鉴定结果图（一抗为UMAB136分泌产生PR单 克隆抗体，1:150 ;二抗为Alexa647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)。
【具体实施方式】：
[0033] 本发明公开了抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和 应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。 本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本 发明技术。
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