一种脐带血单核细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种脐带血单核细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002] 脐带血是造血干细胞的来源之一，造血干移植已成为治疗多种血液病、某些恶性 实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。临床应用已证明造血 干细胞移植对于重建或者改善骨髓造血功能有良好的疗效。单核细胞（包括单核细胞、淋 巴细胞、干细胞等）是造血干细胞移植的有效成分。单核细胞的分离是干细胞移植和进一 步研究的关键，它直接关系到分离后样本体积、造血干/祖细胞或间充质干细胞分离率、细 胞活性维持及移植的成败。
[0003] 脐带血单核细胞冻存更是解决了空间的问题。低温保存是活体组织保存最常用的 方法之一。细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的"绝症"。而"冬眠"技 术对医学的发展有着里程碑式的意义。
[0004] 脐带血单核细胞冻存也是为细胞治疗标准化提供了基础，使用统一浓度的细胞进 行冻存，便于检测细胞冻存前后各项指标，为实现产业化标准化提供数据支持。
[0005] 中国发明专利CN200810089682. 2公开了一种分离单个核细胞的方法和装置，其 步骤包括诸如：将人脐带血使用Ficoll-Hypaque分层法，通过密度梯度离心去除红细胞， 获得单核细胞，洗涤，离心以及将细胞接种于培养基内进行培养等。
[0006] 但目前公开的脐带血单核细胞制备方法虽均能获得单核细胞，但都不进行冷冻， 很难实现标准化。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备冷冻完成的全过程进行统一、系 统监控，以实现单核细胞的标准产品。尽管目前细胞冷冻技术比较成熟，但是将其应用脐带 血单核细胞存在很大的技术难题和非凡的意义。
[0007] 脐血干细胞（UCB)是干细胞移植的重要来源之一，具有来源丰富、采集简单，免疫 排斥发病率低，移植成功率高且不受伦理学限制等优点。但单条脐带血干细胞含量有限，如 果能够建立完善的脐血库，使复苏后的细胞尽可能地保证各种生物学特性不受损伤，那么 就可以彻底解决脐血样本不足的问题。
[0008] 目前冻存细胞多应用于自体脐带血保存，冻存时保留了大量红细胞，不适于异体 移植。且红细胞裂解后释放出血红蛋白易引起患者一过性血红蛋白尿，有引起急性肾功衰 竭的危险。HSC冻存后复苏应用于临床不仅有利于节约人力物力，避免资源浪费，而且也为 质控检测提供了充足的时间保证。
[0009] 同时，要分离1份脐血需要至少2. 5h，直接使用的时候，考虑到细胞检测周期，通 常需要准备2-3份，以保证临床使用，细胞使用后多余的都直接废弃了。造成资源的浪费， 成本累积。使用新鲜培养的细胞无法满足细胞周期需求，在使用的时候存在风险，分离后需 要做无菌检测，细菌污染检测结果需要7天，真菌检测结果需要14天，这个周期比较长，而 新鲜培养的脐带血只能存放7天。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术的缺陷和难题，本发明提供一种脐带血单核细胞的制备方法，本发 明的方法是一种节约成本、安全可控的方法，本发明制备方法在脐带血采集前对产妇进行 筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，之后进行分离培养，进行冷冻保 存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0012] 本发明提供一种脐带血单核细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0013] 步骤一、脐带血筛选与保存：将分离、筛选的脐带血置于低温下保存；
[0014] 步骤二、脐带血分离：对所述保存后的脐带血进行离心，得血浆；
[0015] 步骤三、加液：向所述血浆中加入淋巴细胞分离液，离心，得单核细胞层；
[0016] 步骤四、收集单核细胞：取所述单核细胞层，离心，即得单核细胞；
[0017] 步骤五、细胞培养：取所述单核细胞进行培养，调整细胞密度至设定值；
[0018] 步骤六、单核细胞冻存：向培养后的单核细胞中加入冷冻保护液，预冷后冻存，BP 可。
[0019] 优选地，步骤一中，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史；
[0020] 所述脐带血是从健康足月产妇志愿者中采集、筛选而来；
[0021] 所述保存具体是置于血袋中保存的；
[0022] 所述低温具体指温度范围为8~10°C。
[0023] 优选地，步骤二中，所述脐带血的分离需要于低温保存6小时内进行；
[0024] 所述离心的条件为1700~2000g、10~15min;
[0025] 本步骤中，将所得到的血浆血浆分装至4. 5ml冻存管（冻存管量程），每管4ml。
[0026] 优选地，步骤三中，所述淋巴细胞分离液为市售产品；
[0027] 所述血浆与所述淋巴细胞分离液的体积比为2:1 ;
[0028] 所述离心的条件为650~750g、19~20min。
[0029] 优选地，步骤四中，所述离心的条件为650~750g、8~lOmin。
[0030] 优选地，所述方法还包括在步骤四之后合并、收集单核细胞的步骤；所述收集具体 方式为300~350g离心8~lOmin。
[0031] 优选地，所述方法还包括根据实际需要对红细胞进行裂解的步骤；
[0032] 进一步地，所述裂解用的红细胞裂解液为市售产品、裂解时间不超过30秒，裂解 终止采用生理盐水；
[0033] 所述裂解之后离心即可；所述离心的条件为300~350g、8~lOmin。
[0034] 优选地，步骤五中，所述培养采用的培养基为市售完全培养基、培养时间为3~4 天；所述设定值为〇. 8~1. 6X10S/T75瓶。
[0035] 优选地，步骤六中，所述冷冻保护液为体积分数为5%血浆的DMS0溶液，用于保护 冷冻细胞的活性；
[0036] 所述预冷条件为4°C、30min以上，DMS0在常温下有毒，为降低试剂对细胞的毒性 伤害，需进行预冷，根据相关文献，在4°C毒性比较小；
[0037] 所述的血浆为自体血浆或异体血浆，如果选用异体血浆则需对血浆进行病毒、微 生物等相关检测；
[0038] 所述冷冻保护液的使用终浓度5%，体积分数。
[0039] 优选地，所述冻存具体指预冷后将细胞转入-80°C冰箱过夜，第二天转入液氮保 存。
[0040] 优选地，步骤六还包括对培养后的单核细胞上清液进行无菌检测、支原体检测；
[0041] 所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；
[0042] 所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
[0043] 优选地，所述方法包括在所述单核细胞冻存之后对单核细胞进行复苏的步骤；
[0044] 优选地，所述复苏的步骤具体包括：取冷冻的单核细胞，解冻，生理盐水洗涤，统计 细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并用复方电解质溶液混匀。
[0045] 进一步优选地，所述解冻的条件为37~40°C，2min内；
[0046] 所述洗涤的次数为2遍；
[0047] 所述离心的条件为300~350g、8~lOmin;
[0048] 所述复方电解质溶液可以购买20%白蛋白溶液用盐水稀释10倍得到，也可以购 买（华兰生物可以购买），也可以使用自体血浆作为溶液使用终浓度为2%。
[0049] 优选地，所述内毒素检测包括用鲎试剂（厦门鲎试剂厂，0. 25EU/ML)进行检测；所 述细菌检测包括用革兰氏染色液进行检测。
[0050] 本发明在实施过程中，对冷冻保护液的组分进行了筛选，相比之下，5%DMSO+血 浆比5%DMSO+右旋糖酐、5%DMSO+培养基要效果好，在复苏后细胞活率无明显变化。
[0051] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0052] 1、全过程全面质量监控，从脐带血采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品 及终产品的质量全部受控；
[0053] 2、无血清培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏 风险；
[0054] 3、低浓度冻存保护剂，保持细胞的活性及干细胞的干性，使复苏后的细胞尽可能 地保证各种生物学特性不受损伤，
[0055] 4、复苏后内毒素、革兰氏染色、活率的检测，保证细胞的稳定性及安全性；
[0056] 5、本申请还包括裂解红细胞的步骤，解决了现有技术不适于异体移植的问题，避 免了异体移植引起急性肾功衰竭等负面作用；
[0057] 6、本发明方法克服了新鲜脐带血干细胞使用过程中保存期短、检测耗时长、细胞 源浪费的问题，是一种节约成本的方法。
【具体实施方式】
[0058] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0059] 实施例1
[0060] 本实施例提供一种单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
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