一种用于制备ctl的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养领域，具体地，涉及一种用于制备CTL的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]目前，癌症已超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，新增病例大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也不断增加，由760万人增加到820万人，到2030年，新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。癌症是中国居民死亡的主要原因之一，据全国肿瘤登记中心发布的数据显示，目前每年新发肿瘤病例超过300万例，占全球总数的两成，平均每天确诊8550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症，约有250万人死于癌症。预计，到2020年，新发病例将达到390万，因恶性肿瘤而死亡的人数将达294万。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方式，能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效得清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效低。肿瘤细胞免疫治疗作为一种全新的肿瘤全身治疗方式，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大治疗肿瘤的新技术。
[0003]目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞(树突状细胞)、CIK细胞(细胞因子诱导的杀伤细胞)、DC-CIK细胞和CTL细胞(细胞毒性T淋巴细胞)。树突状细胞(DC)源自骨髓中的前体细胞，是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞，负责对肿瘤抗原的摄取、加工、处理与分类，将肿瘤抗原信息提呈给T细胞，启动肿瘤抗原特异性T细胞应答，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是将人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导、分化、增殖后获得的一群异质细胞，兼具有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞主要由⑶3+⑶56+和⑶3+⑶8+T细胞亚群组成，其中⑶3+⑶56+ Τ细胞为自然杀伤活性Τ细胞(ΝΚΤ细胞)，在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3+CD8+T细胞为CTL，是体内抗肿瘤的主要效应细胞。有报道表明，DC和CIK共同培养联合应用可显著提高CIK对肿瘤的杀伤能力。因此，将对肿瘤抗原的摄取、加工、处理后的成熟DC与同源的CIK混合培养，激活的CTL具有肿瘤特异性，能直接靶向作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高，回输到肿瘤患者体内有助于解除肿瘤患者体内T细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。
[0004]目前，CTL细胞的制备主要包括以下几个步骤:DC细胞和T细胞的分离、DC的诱导分化成熟、CIK的诱导增殖、成熟DC-CIK混合培养、以及CTL的诱导增殖。如申请号为CN201410192581.3的中国专利申请中公开了一种制备CTL细胞的方法，该方法制备的CTL细胞中的⑶3+⑶8+细胞所占比例较高，约为60-70%，但是该方法还存在以下问题:(1)制备的成熟DC分泌的IL-12水平较低，不能有效的共刺激CIK分化为成熟CTL，使得效应细胞的特异性杀瘤活性降低，需要在混合培养时另外加入适量的IL-12 ; (2)制备的CTL细胞中初始τ细胞的数量较高。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种能够解决上述技术问题的CTL试剂盒及CTL的制备方法。
[0006]本发明解决上述问题所采用的技术方案是:
一种用于制备CTL细胞的试剂盒，包括:
(1)DC细胞和T细胞分离体系；
(2)DC的诱导分化成熟体系；
(3)CIK诱导增殖体系，包括:IFN-y、IL-2以及IL-15 ；
(4)成熟DC-CIK混合培养体系，包括:IL-18、IL-7以及抗⑶28单克隆抗体；
(5)CTL诱导增殖体系，包括:IL-2以及IL-6。
[0007]其中，所述(1) DC细胞和T细胞分离体系可以包括:淋巴细胞培养基。
[0008]其中，所述(2) DC的诱导分化成熟体系可以包括:淋巴细胞培养基、GM-CSF、IL-4以及TNF-α。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基。其中，所述GM-CSF终浓度为50ng/ml ;所述IL-4终浓度为25ng/ml、所述TNF- a终浓度为30ng/ml ο
[0009]其中，所述(3) CIK诱导增殖体系还可以包括淋巴细胞培养基、抗⑶3单克隆抗体以及重组人纤维连接蛋白。其中，所述IFN- γ终浓度为1000U/ml，所述IL-2终浓度为20ng/ml，所述IL-15终浓度为lng/ml，所述抗CD3单克隆抗体终浓度为50ng/ml，所述重组人纤维连接蛋白终浓度为1 μ g/mlo其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基，由于自体血浆中含有患者自身的肿瘤细胞信息，培养的细胞靶向性更强。
[0010]其中，所述(4)成熟DC-CIK混合培养体系还可以包括淋巴细胞培养基。其中，所述IL-18终浓度为5ng/ml，IL-7终浓度为10ng/ml，抗CD28单克隆抗体终浓度为50ng/ml。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基。
[0011]其中，所述(5) CTL诱导增殖体系还可以包括抗CTLA-4单克隆抗体及淋巴细胞培养基。其中，所述抗CTLA-4单克隆抗体终浓度为100ng/ml，IL-2终浓度为50ng/ml，IL-6终浓度为100ng/ml。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基。
[0012]本申请所述的试剂盒在(2) DC的诱导分化成熟体系中加入了自身的抗原、GM-CSF以及IL-4，其中，IL-4能够在mRNA和细胞表面蛋白水平上诱导分化THP-1细胞表达高水平的DC ;在(3冗11(诱导增殖体系中采用IL-15可以促进CIK细胞的扩增及CD3+CD56+细胞比例的增加，还可以明显上调CIK细胞上NKG2D的表达；在(4)成熟DC-CIK混合培养体系中采用IL-18能促进外周血单核细胞产生INF- γ、IL-2, GM-CSF等细胞因子，增强NK细胞毒副作用，在抗⑶3单克隆抗体存在时，诱导产生的INF-γ的量远远大于IL-12诱导产生的，促进T细胞增殖，在诱导细胞的分化成熟过程和TH1细胞为主的细胞免疫反应中具有促进和调节作用。在(5) CTL诱导增殖体系中，肿瘤生长局部的CIL前体不能分化成熟，加入IL-2和IL-6因子刺激其成为成熟CTL。且IL-6相对其他细胞因子具有毒性小的特点，能刺激T细胞的分化与增值、诱导IL-2及IL-2R的表达，能减少初始IL-2的使用量。
[0013]—种采用上述试剂盒制备CTL细胞的方法，包括以下步骤:
(1)分离DC细胞和T细胞； (2)DC细胞的诱导分化及成熟；
(3)诱导增殖CIK细胞:将T淋巴细胞转移至经抗⑶3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并加入IFN- γ培养，第2天在培养基中加入IL-2和IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15 ;
(4)成熟DC-CIK混合培养:将上述步骤(2)得到的DC细胞及步骤(3)得到的CIK细胞混合，加入IL-18、IL-7以及抗⑶28单克隆抗体继续培养；
(5)诱导增殖CTL细胞:加入抗CTLA-4单克隆抗体、IL-2以及IL-6，继续培养3天，SP可得到CTL细胞。
[0014]其中，上述步骤(1)分离DC细胞和T细胞可以为:采集并分离PBMC (外周血单个核细胞)，置于含有自体血浆的淋巴细胞培养基中培养以获得悬浮细胞(即T淋巴细胞)和贴壁细胞(即DC细胞)并将所述悬浮细胞和所述贴壁细胞分离。进一步地，该步骤(1)分离DC细胞和T细胞具体为:采集并分离PBMC，置于20ml的含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基AIM- V中，在37°C、5%C02培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞(即T淋巴细胞)和贴壁细胞(即DC细胞)并将所述悬浮细胞和所述贴壁细胞分离(如，可将悬浮细胞转移至新的培养瓶中)。
[0015]其中，上述步骤(2) DC细胞的诱导分化及成熟可以为:贴壁的DC细胞中加入淋巴细胞培养基，同时加入GM-CSF及IL-4，扩增培养5天，第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤全抗原