Zmym1在制备帕金森诊疗试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及ZMYMl在制备帕金森诊疗试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 帕金森病（Parkinson's disease，PD)是一种慢性进展性疾病，目前无法治愈，它 于1817年被英国人Parkinson首先描述，随着对的研宄进展，我们对这个疾病也有了更 深的了解，它在临床上表现为运动性症状如静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍 及非运动性症状如便秘、睡眠障碍、精神行为异常等。目前ro的发病机制还不清楚，可能与 遗传因素、线粒体功能缺陷、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡、环境因素等有关。在ro中，约 10 %的患者为家族型ro患者，具有明显的遗传特性，剩下的90 %为散发性ro患者。现在许 多研宄认为，ro是遗传因素和环境因素共同作用的结果，而对ro致病基因的研宄是目前对 H)发病机制研宄的一大热点。迄今为止，己经发现与遗传性H)相关的基因有SNCA，LRRK2， DJ-l，PINK-l，Parkin等，这些致病基因还需进一步研宄，且远远不能满足临床的需求。对 于ro患者，提前发现提前制定有针对性的个性化治疗方案及最适合患者的疗法，从而改善 左旋多巴类药物的治疗状况和最大限度提高患者的生存质量，减轻患者的痛苦、减少家庭 和社会的经济负担，这就需要提供更多的分子标记以便能及早诊断出帕金森病。
[0003] 为解决目前帕金森分子标记物稀缺的问题，发明人对15例帕金森患者外周血样 本及9例健康人对照外周血样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑 选出候选基因 zmyml。进一步，本发明进行了分子细胞生物学方法证实了 zmyml与帕金森病 的关系与帕金森病具有很好的相关性，可用于制备帕金森辅助诊疗制剂，具有重要 的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供ZMYMl基因和/或蛋白在制备帕金森治疗制剂中的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 ZMYM1，进一步通过分子细胞生物学方法验证了 ZMYMl与帕金森的关系：ZMYMl与帕金森 具有很好的相关性，可用于制备治疗帕金森制剂和/或帕金森诊断制剂，具有重要的临床 应用价值。
[0006] 进一步，所述帕金森治疗制剂是指可以促进ZMYMl基因的表达的制剂。本领域人 员熟知促进基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过DNA水平调控 ZMYMl基因：包括但不限于增加 ZMYMl基因的拷贝数、转染含ZMYMl基因的过表达载体；通 过转录水平调控ZMYMl基因：包括但不限于激活ZMYMl基因的表达、激活调控ZMYMl基因 表达的启动子、抑制负调控ZMYMl基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制ZMYMl基 因表达的抑制子进行干扰；通过转录后水平调控ZMYMl基因：包括但不限于抑制促进ZMYMl 基因 mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进ZMYMl基因表达的microRNA ;通过翻译后水 平调控ZMYMl基因：包括但不限于导入促进ZMYMl基因编码蛋白的分子、抑制负调控ZMYMl 基因表达的蛋白、促进ZMYMl基因表达的因子及蛋白的表达。
[0007] RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的SiRNA可以通过磷酸 妈共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0008] 本发明的目的在于提供一种治疗帕金森制剂，所述抗帕金森制剂促进帕金森患者 中ZMYMl基因的表达。进一步，所述的治疗帕金森制剂中含有促进ZMYMl基因表达的载体。
[0009] 本发明的目的在于提供ZMYMl基因和/或蛋白在制备帕金森诊断制剂中的应用。
[0010] 进一步，所述的帕金森的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测 帕金森外周血中ZMYMl基因的表达。
[0011] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0012] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；三是可同时检测多种疾病。
[0013] 所述的用于荧光定量PCR方法检测帕金森中ZMYMl基因的产品含有一对特异性扩 增ZMYMl基因的引物；所述的基因芯片包括与ZMYMl基因的核酸序列杂交的探针。
[0014] 进一步，所述的帕金森的诊断制剂包括用免疫方法检测ZMYMl蛋白的表达。优选 所述免疫检测方法检测帕金森中ZMYMl蛋白表达的为western blot和/或ELISA和/胶 体金检测方法。
[0015] 酶联免疫吸附实验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷 酸酶（AP)。
[0016] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或外周血 切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标 记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2) 免疫胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或外周血超薄切 片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微 孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体 检测相应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜 上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的 样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动 至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截 留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十 分方便。
[0017] 进一步，所述检测ZMYMl蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒 中的抗体可采用市售的ZMYMl单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被ZMYMl单克隆 抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终 止液等。
[0018] 进一步，所述检测ZMYMl蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的ZMYMl单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 ZMYMl单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0019] 本发明的目的在于提供一种检测帕金森的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒检测基因 ZMYM1，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1， 下游引物序列为SEQ ID NO. 2。
[0020] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0021] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1， 下游引物序列为SEQ ID N0.2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 3,下游引物序列为SEQ ID NO. 4。
[0022] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TRlzol? Reagent进行样本RNA提取。
[0023] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-10 2C〇pieS/ μ 1，最小检出浓度为IOOcopies/ μ 1。
[0024] 本发明目的是提供了