一种3α-HSD试剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种3 a -HSD试剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 3 a -轻类固醇脱氢酶（3 a-HSD，EC. 1. 1. 1. 50)，是睾酮假单胞菌（comamonas pseudomonas testosteroni, CPT)产生一种类固醇脱氢酶。它可作用于多种类固醇基质，可 逆地催化C19-27类固醇3位羟基/酮基的氧化还原反应。3 a -HSD由225个氨基酸组成， 分子量为26. 4KD。3 a -HSD应用到体外诊断试剂中，作为工具酶发挥其催化作用。例如，在 总胆汁酸测定技术中，3 a -HSD可以与Thio-NAD -起特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇 和还原性辅酶（NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶（NAD)每一次循环比原来的反应提高一 倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原 型辅酶（Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得总胆汁酸的含量。此 外，在环境中众多类固醇激素物质的刺激下，睾酮假单胞菌大量表达3 a-HSD，通过多酶的 氧化留核的复杂代谢途径，完全消化这类底物，因此3 a -HSD在这些危害大的稳定化合物 的生物修复中起重要作用。
[0003] 现有的3 a -HSD试剂溶液一般由三（羟甲基）氨基甲烷（Tris)缓冲液、3 a -HSD、 EDTA. 2Na和二价离子（MgCl2、CaCL2)等组成，其在实际应用中存在稳定时间较短的缺陷：在 2_8°C开盖使用状态，测定结果准确性降低；在2-8°C密闭避光保存过程中，随着放置时间 的延长，试剂颜色由无色逐渐变为红色，试剂在稳定性方面的这种缺陷，使得测定结果准确 性降低，也造成原料的浪费，不能满足检测的要求。
[0004] 因此有必要提供一种新的、稳定性高的3 a -HSD溶液，以满足实际应用的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有的3 a -HSD试剂存在的稳定时间短的缺陷，提供一种 在2-8°C开盖使用状态下和在2-8°C密闭避光存储过程中的持续稳定的3 a -HSD试剂。
[0006] 为达到以上目的，本发明提供了一种3 a -HSD试剂，所述试剂的组成成分包括：
[0007] 3a_HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2_(环己胺）乙磺酸、 3-(环己胺）_1_丙磺酸、3-(环己胺）-2-羟基-1-丙磺酸、N-三（羟甲基）-3-氨基丙烷 磺酸、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸和三乙醇胺中的一种。
[0008] 可选的，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯基醚、 聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚和烷基聚乙烯乙二 醇醚所组成的组中的一种或两种。
[0009] 可选的，所述稳定剂选自半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、L-氧 化型谷胱甘肽二钠盐和牛血清白蛋白所组成的组中的一种。
[0010] 可选的，在所述试剂中，3a -HSD的浓度为0. 5-100KU/L，优选为5-20KU/L ;缓冲液 的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mm〇l/L ;表面活性剂的浓度以质量体积百分含量 计为0.05-20% (w/v)，优选为1-15% (w/v);稳定剂的浓度为l-20g/L，优选为3-15mmol/ L〇
[0011] 可选的，所述缓冲液的缓冲容量为〇. 05-lmol/L。
[0012] 可选的，所述3 a -HSD试剂的pH为8. 0-9. 5。
[0013] 可选的，所述缓冲液为N-三（羟甲基）-3_氨基丙烷磺酸，所述稳定剂为L-还原 型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一种，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚 (EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基苯基醚（曲拉通TX-100)中的至少一种。
[0014] 本发明还提供了所述3 a -HSD试剂的制备方法：将缓冲液、表面活性剂、稳定剂、 3 a -HSD依次加入到混合容器中进行分步混合，得到均匀的稳定相。
[0015] 本发明还提供了所述3 a -HSD试剂的应用，包括制备总胆汁酸测定试剂和酶体外 定向分子进化技术的研究。
[0016] 通过上述技术方案，本发明所提供的3 a -HSD试剂在2_8°C开盖使用状态下的稳 定时间可以达到15-30天；在2-8°C密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。
【具体实施方式】
[0017] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0018] 本发明提供了一种3 a -HSD试剂，所述试剂的组成成分包括：
[0019] 3 a -HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2_(环己胺）乙磺酸缓冲 液、3-(环己胺）_1_丙磺酸缓冲液、3-(环己胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲 基）_3_氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液中 的一种。
[0020] 其中，3 a -HSD、表面活性剂和稳定剂均溶解于缓冲液中形成稳定且均一的溶液。
[0021] 在本发明中，所述缓冲液的终浓度表示利用3 a -HSD、表面活性剂、缓冲液和稳定 剂等组分配制所述试剂后，试剂中起缓冲作用的有效成分的终浓度，例如，当所述缓冲液为 N-三（羟甲基）-3-氨基丙烷磺酸时，缓冲液的终浓度表示配制获得的试剂中N-三（羟甲 基）-3-氨基丙烷磺酸的浓度。当缓冲液由两种或两种以上有效成分组成时，缓冲液的终浓 度指代几种有效成分的总浓度。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-lmol/L。为了获 得更好的稳定效果，缓冲液优选为N-三（羟甲基）-3_氨基丙烷磺酸（TAPS)或3-(环己 胺）_1_丙磺酸（CAPS)。
[0023] 可选的，所述试剂的pH为8. 0-9. 5,优选的，为了获得更好的试剂稳定效果，所述 试剂的pH为9. 0-9. 5。
[0024] 在本发明中，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯十二烷基醚、聚乙二醇对异辛基苯 基醚、聚乙二醇单月桂酸酯、4-壬基苯基-聚乙二醇、烷基聚烯烃基乙二醇醚系列和烷基聚 乙烯乙二醇醚所组成的组中的一种或两种。优选的，所述表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基 醚（EMULGEN109P)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚（曲拉通TX-100)。
[0025] 其中，在本发明的一种实施方式中，所述烷基聚烯烃基乙二醇醚指代脂肪醇环氧 乙烷-环氧丙烷的加成物，如PR0PETAL100。
[0026] 可选的，所述稳定剂选自由半胱氨酸、L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽、 L-氧化型谷胱甘肽二钠盐和牛血清白蛋白所组成的组中的一种。优选的，为了获得最佳的 稳定效果，所述稳定剂选自L-还原型谷胱甘肽和L-氧化型谷胱甘肽中的至少一种。
[0027] 可选的，在所述试剂中，3a -HSD的浓度为0. 5-100KU/L，优选为5-20KU/L ;缓冲液 的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L ;表面活性剂的浓度为0. 05-20% (w/v)，优 选为1-15% (w/v);稳定剂的浓度为l-20g/L，优选为3-15g/L。
[0028] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述缓冲液为N-三（羟甲基）_3_氨基丙烷 磺酸（TAPS)缓冲液，所述稳定剂为L-还原型谷胱甘肽、L-氧化型谷胱甘肽和牛血清白蛋 白中的至少一种，表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚（EMULGEN109P)和聚乙二醇对异辛基 苯基醚（曲拉通TX-100)中的至少一种。
[0029] 可选的，所述试剂还包括防腐剂NaNjP Pr〇clin300,所述防腐剂的浓度可以为 0. l-2g/L ;所述防腐剂可以为NaN3，当所述防腐剂为似队时，其浓度为0. l-2g/L。
[0030] 本发明还提供了所述3 a -HSD试剂的制备方法：将上述缓冲液中的一种、表面活 性剂中的至少一种、稳定剂