一种液体型凝血酶时间检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及体外诊断试剂技术领域，具体设及一种液体型凝血时间（TT)检测试 剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 凝血酶时间（T虹ombin time, TT)检测的原理是适量的凝血酶将血浆样品中的纤 维蛋白原转变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，凝固所需的时间即为凝血酶时间（TT)。
[0003] 凝血酶时间是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能的一个简便试验，其检测 对临床的疾病诊断有重要价值。
[0004] 凝血酶时间检测测定过程受多种因素的影响，其中试剂的质量是关键因素，由于 目前国产的凝血试剂普遍存在产品质量不稳定、敏感性差的问题，致使检测结果不稳定，不 同的临床检验实验室之间测得的结果难W比较，因此目前临床实验室所使用的试剂绝大部 分为进口产品，价格昂贵。另一方面，由于试剂中重要组分一-凝血酶的稳定性不好，目前 国内外的凝血酶试剂几乎均为冻干粉剂型，使用前需要进行复溶，操作麻烦、瓶间差异大， 且试剂复溶后质量稳定性差。而液体型的试剂虽然可W直接使用，方便操作，瓶间差小，更 适合自动化仪器的操作，但因为长期保存过程中，稳定性不理想，限制了其应用。
【发明内容】
[0005] 本领域需要开发一种稳定的液体型的凝血酶时间检测试剂，基于此，本发明提供 了一种液体型凝血酶时间检测试剂及其制备方法。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采取了 W下技术方案：
[0007] 一种液体型凝血酶时间检测试剂，含有凝血酶、氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清 白蛋白、明胶，且溶剂为水。
[000引 其抑值为6.0?8.0。
[0009] 所述氨基酸选自甘氨酸或丙氨酸。
[0010] 所述聚己二醇的分子量范围在8000-20000。
[0011] 所述凝血酶的酶活性为5?80IU/血。
[001引还包括缓冲盐。
[0013] 还包括叠氮化钢。
[0014] 所述氨基酸的质量体积百分比为1 %?5% ;
[0015] 聚己二醇的质量体积百分比为0.4%?1% ;
[0016] 甘露醇的质量体积百分比为3%?10% ;
[0017] 牛血清白蛋白的质量体积百分比为3%?12% ;
[0018] 明胶的质量体积百分比为0. 1 %?0. 5%。
[0019] 一种液体型凝血酶时间检测试剂的制备方法，包括：
[0020] 将氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶溶解在水中得到凝血酶保护液， 调节抑值6. 0?8. 0 ;
[0021] 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中，得到所述液体型凝血酶时间检测试 剂，所述液体型凝血酶时间检测试剂中凝血酶的酶活性为5?80IU/血。
[0022] 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中，得到所述液体型凝血酶时间检测试 剂的步骤包括：
[0023] 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中得到凝血酶母液，所述凝血酶母液中 凝血酶的酶活性为3000?lOOOOIU/mL ;
[0024] 将所述凝血酶母液用所述凝血酶保护液分别稀释，获得若干稀释度溶液并滴定， 根据滴定结果选取一个稀释度；
[0025] 根据所述稀释度，用所述凝血酶保护液稀释所述凝血酶母液，得到所述液体型凝 血酶时间检测试剂。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0027] 1)试剂生产过程简化，生产设备简单，无冻干过程，生产成本低；
[002引。使用为即开即用型，不需复溶，操作方便；
[0029] 3)不存在因所用水的质量或体积差异造成的差异，瓶间变异在3% W内；
[0030] 4)试剂稳定性高，瓶间一致性好，37°C热稳定在30天W上，2?8°C密封储存可稳 定18个月W上；
[0031] 5)综合比价，本发明方法制备的液体试剂较市面普遍使用的干粉试剂具有明显优 势。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明凝血酶时间检测试剂制备方法流程示意图。
[0033] 图2是本发明凝血酶时间检测试剂制备方法流程第二示意图。
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示进一步阐述本发明。
[0035] 参照图1，一种液体型凝血酶时间检测试剂制备方法，包括W下步骤：
[0036] 将氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶溶解在水中得到凝血酶保护液， 调节抑值6.0?8.0 ;
[0037] 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中，得到所述液体型凝血酶时间检测试 剂，所述液体型凝血酶时间检测试剂中凝血酶的酶活性为5?80IU/血。
[003引如图2所示，一种液体型凝血酶时间检测试剂制备方法，包括W下步骤：
[0039] 将氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶溶解在水中得到凝血酶保护液， 调节抑值6. 0?8. 0 ;
[0040] 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中得到凝血酶母液，所述凝血酶母液中 凝血酶的酶活性为3000?lOOOOIU/mL ;
[0041] 将所述凝血酶母液用所述凝血酶保护液分别稀释，获得若干稀释度溶液并滴定， 根据滴定结果选取一个稀释度；
[0042] 根据所述稀释度，用所述凝血酶保护液稀释所述凝血酶母液，得到所述液体型凝 血酶时间检测试剂。
[0043] 本申请还公开了一种液体型凝血酶时间检测试剂，含有凝血酶、氨基酸、聚己二 醇、甘露醇、牛血清白蛋白和明胶，溶剂为水，抑为6. 0-8.0。其中，氨基酸优选甘氨酸或丙 氨酸，聚己二醇优选分子量8000-1000的聚己二醇。
[0044] 本申请中甘氨酸、甘露醇与其他试剂组分配合能够很好地保持凝血酶在液体试剂 中的稳定性，制备的液体型试剂在2?8°C密封储存18个月后，用该试剂进行凝血酶时间 检测，检测结果偏移在10% W内。另外，该试剂还可化含有缓冲盐，W更好地维持试剂的pH 值，W更好地保持凝血酶的活性。该试剂还可W含有防腐剂，W抑制试剂中维生物的生长， 有利于该液体型试剂的长期保存。常用的诊断试剂的防腐剂均可使用，例如叠氮钢。
[0045] 下面W-个具体实施例具体介绍一个液体型凝血酶时间检测试剂的组成、制备方 法，W及稳定性性能。
[0046] 实施例1凝血酶时间检测试剂的制备方法
[0047] 1凝血酶保护液配制：称取Tris6. 06g (50mmol/L)、甘氨酸12g (质量分数为 1.2% )、PEG200005g(质量分数为0. 5% )、BSA 35g(质量分数为3. 5% )、明胶2g(质量分 数为0. 2% )、甘露醇40g(质量分数为0. 4% )、叠氮钢Ig(质量分数为0. 1% )，加入1L纯 化水，揽拌使其充分溶解，用0. Imol/L的化OH调抑为7. 0。
[0048] 2过滤除菌：用水润湿0. 45 y m的=醋酸纤维素，紧贴放在抽滤过滤器砂巧上对保 护液进行抽滤，收集滤液得到滤清的凝血酶保护液，去除少量配制中的不溶物。
[0049] 3凝血酶母液配制：取1支1血规格、50000IU/血的凝血酶冻干品，加入1血凝血 酶保护液，室温10分钟，间隔上下颠倒使其充分溶解，然后转移至装有9血凝血酶保护液的 小烧杯中，混匀得到lOmL凝血酶母液。
[0050] 4凝血酶母液的稀释和滴定：
[0化1] 1)用凝血酶保护液对凝血酶母液按1:100、1:150、1:200、1:400进行稀释配制凝 血酶时间检测试剂各2血，分别记为A、B、C、D四组。
[0化2] 2)上述A、B、C、D四组小样分别上血凝仪对30例医院报告为正常的新鲜（2h内） 血浆样本W及Siemens血凝正常水平质控品Ci-Trol 1进行测检测，检测方法为：取待测血 浆或质控品100 y L 37°C育温3分钟，然后加入100 y L凝血酶试剂，W Sysmex CA-1500血 凝仪凝固法进行检测。
[0053] 检测发现稀释比例在1:150?1:400范围内，各样本结果均在20s内，满足行业标 准要求。
[0054] 如取5血凝血酶母液，加入到剩余全部1L保护液中，稀释比例约为1:200,得到1L 凝血酶试剂，混匀即为凝血酶时间（TT)检测试剂。
[0055] 5凝血酶时间們）试剂性能检测：
[0056] 1)准确性检测
[0化7] 上述凝血酶试剂上Sysmex CA-1500血凝仪对30例医院报告为正常的新鲜（2h 内）血浆样本，检测方法同上。结果如下表1 :
[0化引表1凝血酶时间检测试剂测试结果 [0059]
[0060]
【主权项】
1. 一种液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，含有凝血酶、氨基酸、聚乙二醇、甘露 醇、牛血清白蛋白、明胶，且溶剂为水。
2. 根据权利要求1所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，其pH值为6. O? 8. 0〇
3. 根据权利要求1所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，所述氨基酸选自 甘氨酸或丙氨酸。
4. 根据权利要求1所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，所述聚乙二醇的 分子量范围在8000-20000。
5. 根据权利要求1所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，所述凝血酶的酶 活性为5?80IU/mL。
6. 根据权利要求1至5中任意一项所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，还 包括缓冲盐。
7. 根据权利要求6所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，还包括叠氮化钠。
8. 根据权利要求7所述的液体型凝血酶时间检测试剂，其特征在于，所述氨基酸的质 量体积百分比为1 %?5% ; 聚乙二醇的质量体积百分比为0. 4%?1% ; 甘露醇的质量体积百分比为3%?10% ; 牛血清白蛋白的质量体积百分比为3%?12% ; 明胶的质量体积百分比为〇. 1 %?〇. 5%。
9. 一种液体型凝血酶时间检测试剂的制备方法，其特征在于，包括： 将氨基酸、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶溶解在水中得到凝血酶保护液，调节 pH 值 6. 0 ?8. 0 ; 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中，得到所述液体型凝血酶时间检测试剂， 所述液体型凝血酶时间检测试剂中凝血酶的酶活性为5?80IU/mL。
10. 如权利要求9所述制备方法，其特征在于，取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护 液中，得到所述液体型凝血酶时间检测试剂的步骤包括： 取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中得到凝血酶母液，所述凝血酶母液中凝血 酶的酶活性为3000?10000IU/mL ; 将所述凝血酶母液用所述凝血酶保护液分别稀释，获得若干稀释度溶液并滴定，根据 滴定结果选取一个稀释度； 根据所述稀释度，用所述凝血酶保护液稀释所述凝血酶母液，得到所述液体型凝血酶 时间检测试剂。
【专利摘要】本发明公开一种液体型凝血酶时间检测试剂及其制备方法，制备方法包括如下步骤：将氨基酸、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶溶解在水中得到凝血酶保护液，调节pH值6.0～8.0；取凝血酶冻干粉溶解在所述凝血酶保护液中，得到所述液体型凝血酶时间检测试剂，所述液体型凝血酶时间检测试剂中凝血酶的酶活性为5～80IU/mL。一种液体型凝血酶时间检测试剂，含有凝血酶、氨基酸、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶，且溶剂为水。发明试剂生产过程简化，生产设备简单，无冻干过程，生产成低；使用为即开即用型；瓶间变异小；试剂稳定性高。
【IPC分类】G01N33-86
【公开号】CN104569446
【申请号】CN201510058508
【发明人】艾峰, 肖国伟, 潘仁斌
【申请人】上海长岛生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年2月4日