Cxcl1的适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及CX化1适配体在制备检测上尿路上皮癌 试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 所谓尿路上皮癌是指膀脫癌和肾孟癌、尿管癌等的总称，上述癌均由尿路的移行 上皮细胞癌化产生，一般认为其性质是相同的。尿路上皮癌是在泌尿生殖器癌中继前列腺 癌之后患病人数最多的癌症。
[0003] 已经公开了用于膀脫癌的检查和确定的多种标记物及方法。例如可W举出通过核 憐蛋白（nucleophosmin)/B23、皿RP、CYP4B1或CYP4B2等基因表达水平的变化来确定膀脫癌 的方法，通过尿样中特定蛋白质的存在或量来确定膀脫癌的方法，W血液中可溶性化S浓度 为指标确定膀脫癌的方法等。在现有技术中WCX化1蛋白质作为肿瘤标记物，通过使用与其 特异性结合的抗体、或者能够与编码该蛋白质的基因、其转录产物或其cDNA结合的核酸，能 够有意义地检测出尿路上皮癌。
[0004] 核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核巧酸配体，通过SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核 巧酸文库中筛选获得。SELEX技术(即系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制/发展 起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核巧酸文库，结合体外PCR扩增技 术，W指数富集与祀分子特异结合的寡核巧酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的 核巧酸适配子(aptamers)。该技术己成功运用于许多祀分子的筛选，包括金属离子、有机染 料、药物、蛋白质、氨基酸W及各种细胞因子等。运种方法具有简便、快速、经济等特点，与其 他组合化学库如随机肤/肤库、抗体库和隧菌体表面展示文库相比，从寡核巧酸文库中筛 选出的适配子具许多优势:a.本身是寡核巧酸，分子量较小，可W化学合成，节约成本。b.具 有比抗体更高的亲和性和特异性。C.便于标记，可W在不同部位有选择性的标记。d.重复性 好，稳定性好，易于保存，对高溫和剧烈条件不敏感。因此，寡核巧酸适配子/SELEX技术具有 良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差 异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。
[0005] 核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核巧酸文库；将文库与 祀标共解育，使文库中能与祀标特异性结合的寡核酸与祀标形成复合物，分离复合物并洗 脱寡核酸，W洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核巧酸文库，开始 下一轮筛选;重复数轮解育-洗脱-扩增，与祀标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从 文库中筛选出来并被指数富集;对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及 两端序列与文库相符者即为核酸适配子;测定各核酸适配子与祀标结合的特异性和亲和 力，选出能高特异性和高亲和力结合祀标者，即可应用于祀标的检测分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种DM适配子，能够特异性结合尿路上皮癌中的CX化1蛋 白，可W来实现尿路上皮癌治疗药物运送的祀向性，可用于尿路上皮癌的诊断与治疗。
[0007] 本发明采用W下技术方案：
[0008] 体外合成一个含有40个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适 配子随机文库;采用CX化1蛋白为祀蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特 异性RNA适配子;通过结构预测软件RNA S化ucture Program分析预测适配子的二级结构； 通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对祀蛋白的特异性和亲和力，得到了 多个与表面抗原亲和力高、特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结 构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合CX化1蛋白。所述适配子序列如下：
[0009] CXC-1:
[0010] GCTATCTAGCCTATCTGGAACACCCTCTCGCTTAACTATTACAATCTATTCATATGTTATCAGCGTAACGCAGCACT GCA
[0011] CXC-2:
[0012] GCTATCTAGCCTATCTGGAACCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACACACCGCACCTAAGCGTAACGCAGCACT GCA
[0013] 本发明的有益效果：（1)获得了一种能够特异高效结合CX化1蛋白的适配子。该适 配子可W大量人工制备，方法简单，成本低廉。（2) W核酸适配子为基础可W制备成为祀向 尿路上皮癌细胞的诊断和治疗药物。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1巧化1蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选
[001引根据CN 101297046A中公开的CX化1抗原制备方法，制备的到CX化1蛋白。也可W采 用本领域常规的CXCL1蛋白表达的方法。根据已知的基因序列NP_001502,通过常规基因合 成或者基因组调取的方式来获得相应的基因序列，采用酵母表达的方法体外表达CX化1蛋 白，获得了相应的蛋白，命名为CXCL1。
[0016] 化学合成初始寡核巧酸随机文库及引物，序列如下：（5 / -GCTATCTAGCCTATCTGGAAC--N40--AGCGTAACGCAGCACTGCA-3')，其中M0为40个随机寡核 巧酸；
[0017] 引物P1: GCTATCTAGCCTATCTGGAAC;
[0018] 引物 P2: TGCAGTGCTGCGTTACGCT。
[0019] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；W回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。8化g RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与3ug CX化1蛋白37°C解育40min，反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜;然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.7mol/L 醋酸锭，1.6mmol/L EDTA，0.15%SDS)中煮沸5min，离屯、，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新 溶解于20ylDEPC水中；WRNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛 选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，W该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子 库，筛选共进行15轮。
[0020] 实施例2特异性高亲和力的TS/MDEP结合适配子的获得
[0021] 将RNA适配子分别取1.扣g，用牛小肠碱性憐酸酶(CIP)37°C消化比，纯化回收去憐 酸化的RNA;通过T4多核巧酸激酶标记[丫-32P]ATP于去憐酸化的RNA分子末端。Wnmol放射 性标记的RNA适配子分别与不同浓度（l-200nM)的CX化1蛋白37°C解育30min，各组反应液经 硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品 平行做两次测定。计算各个适配子与CX化1蛋白的解离常数。结果如下：
[0022]
'[0023] 实施例3所述适配子特异性分析W及稳定性分析 '
[0024] 从W上结果可W看出，本发明的二个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合CX化1蛋白。
[0025] 实施例3降解活性分析
[0026] 分别采用人血白蛋白，RASAL1蛋白，CYP4B1，CYP4B2蛋白与2条适配子进行特异性 检测，经过结合试验发现，运些适配子都不与运些蛋白相结合，而只与CXC-1蛋白结合保持 较高的特异性。
[0027] 将所述的适配子，取0.化g，分别置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0028] 序列表
[0029] 〈110〉中国人民解放军第四军医大学
[0030] 〈120〉巧化1的适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用
[0031] (210)1
[0032] (211)80
[0033] (212)DNA
[0034] 〈213〉人工序列
[0035] 〈400〉CXC-1
[0036] GCTATCTAGCCTATCTGGAACACCCTCTCGCTTAACTATTACAATCTATTCATATGTTATCAGCGTAACGCAGCACT GCA
[0037] (210)2 [003引〈211)80
[0039] (212)DNA
[0040] 〈213〉人工序列
[0041 ] 〈400〉CXC-2:
[0042] GCTATCTAGCCTATCTGGAACCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACACACCGCACCTAAGCGTAACGCAGCACT GCA。
【主权项】
1. 一种特异性识别CXCL1蛋白的适体，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No. 1-2任一 条序列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。2. 权利要求1所不的适体在筛选尿路上皮癌的应用。3. 权利要求1所示的适体用于制备检测CXCL1蛋白的试剂盒应用。4. 权利要求1所示的适体用于制备检测尿路上皮癌的试剂盒应用。
【专利摘要】本发明涉及一种能够特异性结合尿路上皮癌的适体，所述适体具有较强的结合特性和稳定性；该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以CXCL1蛋白为靶蛋白，从单链RNA随机文库中筛选出了能与CXCL1蛋白特异性结合的DNA适配子。本发明还涉及一种尿路上皮癌诊断用试剂盒，所述试剂盒包含能够与该蛋白质或基因特异性结合的核酸适配子。
【IPC分类】G01N33/574, C12N15/115, G01N33/68
【公开号】CN105505941
【申请号】CN201610040435
【发明人】马建军, 姜雪, 唐启胜, 李瑞晓
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月21日