0034] 下面就本发明提供的抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗 体和应用做进一步说明。
[0035] 实施例1:PR重组表达质粒的构建
[0036] (1)、实验方法：
[0037] 1、载体构建：以Origene公司PR的cDNA克隆质粒RC221303为模板，设计两条引 物并分别引入酶切位点EcoRI和Bglll，克隆入表达载体pET-23b，建立PRN端片段（1~ 298aa)的重组表达质粒pET-23b/PR-N298。
[0038] 2、转化E.Coli感受态细菌：取一个1. 5ml离心管，加入100μ1感受态细胞悬液， 置冰上：加入2ul质粒pET-23b/PR-N298,用移液器轻柔混匀。冰上静置20min;42°C水浴 中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min;加入lmlLB液体培养基（不含抗生素），混匀后 37°C振荡培养（180rpm) 1小时；取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布 均匀；待菌液被培养基吸收后，37°C倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠 时，取出。
[0039] 3、阳性菌株鉴定：挑上述单菌落菌株于5mlLB(Amp+)培养基220rpm培养至0D280 =0. 6,加入IPTG诱37度培养5小时，收集菌体裂解；同时以转化空载体pET-23b的细菌 裂解液为对照，加入5XLoadingBuffer，制样进行SDS-PAGE电泳、用anti-His抗体进行 Western-Blot检测蛋白表达，见图1。
[0040] (2)、实验结果：
[0041] 由图1结果可见，Anti-His单抗（1:2000)能检测到转化PR重组质粒pET-23b/ PR-N298的细菌裂解液中约40kDa大小条带（R)，与预期相符，而转化空载体的对照裂解液 (L)中则没有相应大小的条带，表明重组蛋白PR-N298正确表达。
[0042] 实施例2 :PR重组蛋白的表达与纯化
[0043] (1)、实验方法：
[0044] 1、细菌培养与菌体收集：挑上述单菌落菌株于5mlLB(Amp+)培养基220rpm培养 8小时后转移至1升LB(Amp+)培养基扩大培养，待其生长到0D280 = 0. 6后加入IPTG至终 浓度为〇. 25mM诱导蛋白表达，继续4度200rpm振荡培养12~14小时后，4度离心菌液，收 集菌体沉淀。
[0045] 2、蛋白纯化：将上步收集的菌体沉淀用PBS缓冲液重选并进行超声破碎（超 声探头为6Φ，功率为400W，全程工作时间30min，每个循环超声3秒间隔5秒）， 离心（12000rpm, 5min)，收集上清，并按照Novagen公司蛋白纯化方法进行纯化 (Novagen，Ni-NTAHis-BindResin试剂盒，货号：70666-5)，收获得到纯化的带His标签的 重组蛋白PR-N298。
[0046] 3、纯化蛋白鉴定：纯化后的PR蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图2。
[0047] (2)、实验结果：
[0048] 由图2结果可见，经过His亲和层析柱纯化，洗脱可得到高纯度的PR片段重组蛋 白PR-N298。
[0049] 实施例3 :抗PR单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选
[0050] 根据标准方法用重组产生的纯化的PR片段（PR-N298)重组蛋白（以下简称为PR 抗原）用于对B6/C57小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）进行免疫。具体方法 如下：
[0051] 1、动物免疫：经过纯化的PR抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法 免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全 弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效 价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
[0052] 2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0,融合时处于对数生长期；取 已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混 合，滴加37°C的50%PEG(PH8. 0)lmL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加 入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3. 5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37°C、 5% 0)2恒温培养箱中进行培养。
[0053] 3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的PR片段重组蛋白进行 ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA 值，挑取0D280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为 阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB136。
[0054] 4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株UMAB136用含15%血清的DMEM培养基 培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4X107个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移 到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3X105个/ml。继续培养1~2周后， 当细胞死亡率达到60 % -70 %时（此时细胞密度大概为1-2X106个/ml)，收取细胞悬液 6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料， 细胞株UMAB136分泌产生的单抗亚型为IgG2a，采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓 度测定、分装（100uL/管，浓度为lmg/ml)、保存在4-8°C。
[0055] 实施例4:UMAB136分泌产生的单克隆抗体为一抗的蛋白印记（Western-Blot)检 测
[0056] (1)、实验方法：
[0057] 1、准备细胞：准备HEK293T细胞（293T，ATCCCatlogNo.CRL-3216)以及人乳腺癌 细胞系MCF-7(ATCCCatlogNo.AJCCxHTB-22tm)，培养于含 5%0)2的37°(：细胞培养箱 中。
[0058] 2、转染：将人源全长PR质粒pCMV6-PR(RC221303,OriGene公司）和空载体 pCMV6(PS100001，OriGene公司）转染293T细胞，36小时收获活细胞。
[0059] 3、制备细胞裂解液：将上述细胞消化，水平离心机800-1000rpm/5min离心，PBS洗 2次，细胞沉淀用PBS定容到400ul-EP管，加入细胞裂解液，冰浴裂解20分钟后，12000rpm 离心10分钟，收集上清加入5XLoadingBuffer稀释成IX作为细胞裂解液，-80°C存储备 用。
[0060] 4、SDS-PAGE电泳：恒压180V50min溴酚兰至凝胶底部。
[0061] 5、转膜：提前用转移缓冲液浸泡Nc膜与滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序 为：电极（_)-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-电极（+)，一定要保证胶在下膜在上，即凝 胶靠近负极。恒流600mA，45分钟。
[0062] 6、染色：用立春红S染色2min，用蒸馏水清洗，至marker条带显出，用圆珠笔做好 标记。蒸馏水冲洗膜。
[0063] 7、封闭：用封闭液（含5%脱脂奶的TBST)浸没NC膜并置于37°C孵育1小时。
[0064] 8、一抗孵育：将NC膜置于PR鼠单抗UMAB136 (以封闭液将抗体稀释2000倍）中， 37°C温箱孵育1小时后，再用15mLTBST洗膜15min*3次。（根据容器大小可调整TBST用 量）
[0065] 9、二抗孵育：将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（Jackson，Catlog No. 115-035-146 ;1 :5000)中，室温摇床孵育1小时后，TBST洗膜5次，15min/次。
[0066] 10、底物曝光：鲁米诺和双氧水1 :1混匀后加在NC膜上（1ml/膜），压上X射线胶 片曝光，然后将胶片进行显影和定影（暗室中可根据胶片上的荧光估算艳片时间）。
[0067] 11、根据阴性，阳性，空白对照来进行结果分析和判定，见图3。
[0068] ⑵、实验结果：
[0069] 由图3结果可见，UMAB136分泌产生的PR鼠单抗（1:2000)能检测到转染PR重组 质粒（RC221303)的HEK293T细胞裂解液以及MCF-7中PR蛋白，分子量大小与预期相符，而 阴性对照239T细胞中则没有相应大小的条带，表明本发明所述单抗能检测到PR蛋白的特 异性表达。
[0070] 实施例5 :UMAB136分泌产生的单克隆抗体为一抗的流式细胞术检测
[0071] (1)、实验方法：
[0072] 1、准备细胞：准备人乳腺癌细胞系MCF-7培养与含5% 0)2的37°C细胞培养箱中。
[0073] 2、收获细胞：MCF-7细胞消化，水平离心机800-1000rpm/5min离心，PBS洗细胞2 次，800rpm离心；细胞沉淀用PBST(含0. 05 %TritonX-100)于冰浴上处理lOmin使细胞膜 穿孔；然后离心弃上清，细胞沉淀用PBS定容到400ul-EP管，制备细胞悬液。
[0074] 4、孵育抗体：将PR鼠单抗UMAB136 (工作浓度为10ug/ml)以及阴性对照抗体分别 上述细胞悬