抗驼乳重链IgG3单克隆抗体、含有所述单克隆抗体的试纸及其应用
【专利说明】抗驼乳重链lgG3单克隆抗体、含有所述单克隆抗体的试纸 及其应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及以抗体为特征的生物检测试剂，特别是一种抗驼乳重链^心单克隆抗 体，还涉及含有该单克隆抗体的试剂盒及其应用。 【【背景技术】】
[0002] 骆驼是我国边疆的主要畜种之一，其身处严酷环境经长期自然选择形成了其它畜 种不具备的独特生物学特性。1993年，HamersCasterman等人发现在胳盤血清中存在两种 结构的天然IgG抗体，一种为具有两条重链和两条轻链的常规四聚体IgGi(约170kD)，另一 种为仅有两条重链构成的二聚体抗体，称为重链抗体（heavy-chainantibodies,HCAbs)， 包括IgG2(约100kD)和IgG3 (约90kD)亚型。与一般抗体相比，这些重链并不与轻链缔合， 它们的重链可变区（VHH)与铰链区间并没有传统免疫球蛋白中的第一稳定区（CH1)，可变 区直接与铰链区和Fc相连接，重链抗体的VHH还具有不同于VH的特征（见图1)。但是这 种二聚体免疫球蛋白仍能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链抗体那样 相互粘连聚集成块，因而在骆驼的体液免疫中发挥非常重要的作用。
[0003] 骆驼是唯一含有重链抗体的哺乳动物，这些重链抗体尽管缺失轻链，但作为抗体 其功能是完整的，这表明重链抗体的重链可变区（VHH)单独能够形成完整的抗原结合位 点。重链抗体VHH具有分量小、结构稳定、亲和力高、人体免疫原型弱、易表达、易纯化的优 点。
[0004] 驼乳对于大多数人来说较为陌生，但是对于许多国家来说，驼乳是无可替代的营 养珍品。驼乳不仅富含人体必需的多种氨基酸，还含有溶菌酶、免疫球蛋白、乳铁蛋白等保 护性蛋白和多种生物活性因子，可杀菌抑菌、调节免疫力，在机体抗病机制方面起着重要作 用。其中免疫球蛋白是骆驼常乳和初乳中最值得关注的免疫因子，骆驼常乳和初乳中最主 要的免疫球蛋白为IgG，而IgM、IgA含量很少。驼乳IgG包括三个亚类，分别为IgGi、IgG2 和IgG3。在许多国家不仅饮用驼乳摄取营养，还常用驼乳来辅助治疗腹泻、胃溃疡、糖尿病 等疾病，并取得了良好的成绩。因此，近年来驼乳及其制品的开发和研究逐渐兴起。
[0005] 我国是最早驯养双峰§它的国家之一，也是双峰§它主要分布区域之一。但我国§它乳 产业起步较晚，然而随着人们对驼乳的认识加深，驼乳的需求量日渐增加，需求量远大于供 应量。由于驼乳不像牛乳那样容易挤出，而且产量较低，因此一方面限制了驼乳企业的发 展，另一方面造成了驼乳掺假现象的发生。然而，现有技术中还缺少能够快速、有效地检测 驼乳是否掺假的技术。
[0006] 金标免疫层析技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂应用于抗原抗体特异性 免疫反应的一种免疫分析技术，具备操作简单、特异敏感、可单份测定、成本低、不需要仪器 的特点。金标免疫层析试纸条通常包括样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和底板。 其中，样品垫置于试纸条的前端，用于进样；金标结合垫是胶体金标记过的待测物的受体的 承载体，测试液经样品垫流经时，胶体金结合物从金标结合垫上释放并与测试液中的待测 物特异性结合形成免疫复合物，随测试液一起流向硝酸纤维素膜；硝酸纤维素膜是金标免 疫层析试纸条的结果显示区域，其一般有两条线：捕获线（或称测试线）和控制线。捕获线 上包被待测物的另一特异性抗体，而控制线上包抗胶体金标记物中抗体的羊抗鼠IgG，即抗 金标结合垫上胶体金标记过的受体的抗体；吸收垫通常置于试纸条末端。
[0007] 目前，胶体金免疫层系技术已经广泛应用于食品、药品、生物医学等许多领域的检 测。 【
【发明内容】
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[0008] 本发明利用驼乳重链抗体的特点，从驼乳中获得重链抗体IgG3，以驼乳^心抗体 为免疫原制作小鼠抗驼乳IgG的单克隆抗体，筛选小鼠抗驼乳IgG3单克隆抗体，研制可以 检测驼乳IgG3抗体水平的试剂盒，为检测驼乳制品提供快速的检测方法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供一株小鼠骨髓瘤细胞H2H6,所述细胞株于2015 年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11099。
[0010] 本发明还提供抗驼乳IgG3单克隆抗体IgG，所述单克隆抗体是由前述的小鼠骨髓 瘤细胞产生的。优选地，所述单克隆抗体为IgG2b亚类，其价效达1:102400。
[0011] 本发明还提供所述单克隆抗体在检测驼乳制品中驼乳含量水平的应用。
[0012] 本发明还提供含有驼乳重链IgG3抗体的检测试纸，所述试纸包括样品垫、金标结 合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜包被上述的抗驼乳IgG3的单克隆 抗体。
[0013] 在本发明中，优选地，所述抗驼乳IgG3的单克隆抗体由胶体金标记。
[0014] 特别优选地，所述检测试纸采用竞争法制备得到。
[0015] 本发明首次利用驼乳特异性重链抗体作为免疫原制备单克隆抗体，并制作检测试 剂盒/检测试纸；通过对比竞争法与夹心法，本发明的检测试纸检测效果好，具有特异性与 灵敏度高、检测时间短的优点；本发明的试剂价格低廉，实验操作方便，无需特殊的仪器设 备，可以满足有关研究单位，质监部门批量检测相关乳品质量的需要；本发明的检测试纸可 用于驼乳及其制品中乳源掺假的快速检测。
[0016] 本发明涉及的小鼠骨髓瘤细胞H2H6于2015年8月13日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11099 【【附图说明】】
[0017] 图1为常规抗体与骆驼重链抗体结构图，其中A:常规抗体IgG，B:骆驼重链抗体， C:纳米抗体（VHH)。
[0018] 图2为纯化驼乳IgG3电泳图，其中M:marker，1 :驼乳中层澄清液，2 :纯化驼乳 IgG3〇
[0019] 图3为杂交瘤技术制备单克隆抗体的线路流程。
[0020] 图4为纯化抗§它乳IgG3单克隆抗体IgG电泳图；其中M:marker，1~9 :纯化抗马它 乳IgG3单克隆抗体（1: :H2H6,2 :H11E8,3 :G1C7,4 :F1B3,5 :F11A4,6 :B8F10,7 :B12G11，8 : B5E11,9 ：A12C2)〇
[0021] 图5为竞争法试纸检测驼乳以及牛乳；其中1 :检测驼乳（阳性），2 :检测牛乳（阴 性）。
[0022] 图6为竞争法试纸检测驼乳与牛乳的混合样品；其中1 :牛乳，2 :驼乳：牛乳= 1:9, 3 :驼乳：牛乳=3:7,4 :驼乳：牛乳=5:5, 5 :驼乳：牛乳=7:3,6 :驼乳：牛乳=9:1， 7 :驼乳。
[0023] 图7为检测试纸结构示意图。
[0024] 图8为检测试纸使用说明图。
[0025] 图9为试纸条检测结果说明图。 【【具体实施方式】】
[0026] 通过以下实施例非限制性地解释本发明的技术方案。
[0027] 实施例1
[0028] 1.驼乳重链抗体IgG3纯化
[0029] (1)样品处理：取盤乳化冻，高速低温离心机12000rpm4°C离心60min，去掉上层 脂肪和下层沉淀；取出中层的液体，取其中不超过〇.lmL用于SDS-PAGE电泳。
[0030] (2)驼乳IgG3分离纯化：
[0031] ①取澄清的中层液与PBS按体积比1 :5稀释；
[0032] ②预处理ProteinGaogaroseFF柱，用 10mLProteinGaogaroseFF胶装柱， 用0. 02MpH7. 0的磷酸盐缓冲液平衡5倍体积；
[0033] ③按其操作步骤上样，用至少10倍体积的平衡缓冲液清洗柱子，去除杂质；
[0034] ④用0. 2MpH3. 6的柠檬酸缓冲液洗脱，收集IgG3洗脱峰，并用1MpH9.OTris-H