一种植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 中国新疆地区哈萨克族和蒙古族等少数民族自古以来就有制作和食用发酵乳制 品的习惯。他们以牛乳、水牛乳、羊乳、牦牛乳、马乳、胳驼乳等作为原料，采用传统的制作工 艺制成各种传统乳制品，如奶皮子、稀奶油、酸奶子、奶豆腐、奶干、奶酒、奶疙瘩、马奶酒和 黄油等。传统的乳制品制作方法有着明显的地域性以及户籍性，从而做成的乳制品有着浓 厚的地区特色和风味。经过几千年的驯化，这些传统乳制品中保留了许多赋予乳制品独特 风味的乳酸菌，为发酵乳制品菌种的分离筛选以及研究开发提供了宝贵的资源。
[0003] 乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB)是一类能够发酵碳水化合物主要产物为乳 酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。按伯杰氏系统细菌学手册中的生化及形态分类法，乳 酸菌可分为18个属。它在自然界中广泛存在，不仅可以提高食品附加值和保藏性，还能帮 助调节肠道微生态平衡，具有促进营养物质有效吸收的保健功能。近年来，乳酸菌已经作为 益生菌广泛应用于食品及药品领域。乳酸菌能够产生多种有益的代谢产物，例如乳酸、细菌 素、胞外多糖等。胞外多糖（exopolysaccharides，EPS)是由乳酸菌发酵产生的、分泌于细 胞外的一种糖类化合物，它对改善发酵乳制品的组织状态起着重要作用。乳酸菌中的乳杆 菌、链球菌、明串珠菌和乳酸乳球菌等属的菌株产胞外多糖的报道比较多。这些乳酸菌能分 泌多糖于细胞外，形成荚膜多糖黏附于细胞表面，或以粘质多糖形式存在于细胞周边培养 基中。由肠膜明串珠菌生产的右旋葡萄糖酐是最早被开发利用的乳酸菌胞外多糖，也是美 国食品药品监督管理局（FDA)批准的第一种可添加于食品中的微生物胞外多糖。
[0004] 乳酸菌胞外多糖的功能包括以下几个方面： (1)改善发酵乳的组织状态。产EPS乳酸菌可提高低脂Mozzarella干酪的水分，提高 干酪的得率；产EPS嗜热乳酸菌生产发酵乳，可以改善搅拌型酸乳的组织状态，防止乳清分 离，无须添加稳定剂。
[0005] (2)改善菌株对肠道粘膜的吸附。EPS可以提高菌株对肠道表面的非特异性粘附。
[0006] (3)抗肿瘤作用。目前认为乳酸菌EPS抗肿瘤作用可能有下述几方面的机制：（1) 影响血液供应，鉴于细菌素能引起肿瘤细胞出血性坏死，曾经设想多糖的抗肿瘤作用可能 影响肿瘤细胞的血液供应。（2)刺激某种器官或组织，分泌一种物质攻击肿瘤细胞；(3)细 胞膜接触抑制作用，肿瘤细胞表面具有很强的负电荷，而有些多糖可以结合这些电荷，使细 胞表面被"中和"，从而有利于细胞接受信号终止分裂。
[0007] (4)对免疫系统的促进作用。一些学者从乳酸菌培养物分离得到的EPS，通过对小 鼠试验证实，能够通过刺激细胞因子的产生和竞争性拮抗存在于肿瘤宿主体内的免疫抑制 因子等途径，增强机体的抗肿瘤免疫功能。另外EPS还能促进非特异性和特异性免疫反应， 激活巨噬细胞释放集落刺激因子和增加细胞内溶酶体的含量。
[0008] (5)对细胞体的保护作用，荚膜和粘液多糖的生理功能，主要是防护作用，保持适 当水分，吸收金属离子，并可能抑制溶菌酶和防御噬菌体作用等。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于：1、提供一种从新疆传统民族奶制品一酸奶子中分离得到的高 产胞外多糖植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ZWQ-9) ;2、提供这种植物乳杆菌ZWQ-9 的工业应用。
[0010] 本发明的技术方案为：一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)ZWQ_9,该菌 株的保藏编号为CCTCC No :M 2015453。所述的植物乳杆菌ZWQ-9的16S rRNA基因序列如 SEQ ID NO. 1所示。上述的植物乳杆菌ZWQ-9,在保健功能性食品或药品或饲料或饲料添加 剂或化妆品中的应用。
[0011] 本发明的有益效果：微生物胞外多糖是一种长链、高分子质量的聚合物，其独特的 物理学和流变学特性以及使用安全性使它在食品和非食品工业倍受青睐，尤其是在医药领 域所具有的巨大应用潜能正日益引起人们的广泛关注。乳杆菌为国际公认安全的益生细 菌，具有多种生理功能，其代谢产生的EPS具有很高的安全性和保健功能。因此，开发乳酸 菌EPS较其他微生物来说，更具有理论意义与实际价值。本发明申请的植物乳杆菌ZWQ-9 能十分显著的产生胞外多糖。
[0012] 菌种保藏说明：菌种名称：植物乳杆菌；拉丁学名：Lactobacillus plantarum ;保 藏编号：CCTCC No :M 2015453;保藏机构：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉武汉 大学，邮编：430072,电话：（027) 68754052,传真：（027) 68754833, E-mail :cctcc@whu. edu. cn;保藏日期：2015年7月14日。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例详细描述本发明申请，所述实施例用于理解而不是限制本发 明申请。
[0014] 实施例1、植物乳杆菌ZWQ-9的采集及分离 样品为采自新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州阿合奇县的民族特色乳制品一一酸奶子。将 采集的样品置于4°C低温环境下保藏；在实验室进行乳酸菌的分离操作：取IOmL酸奶子样 品，加入90mL无菌生理盐水稀释于锥形瓶中充分搅拌均匀，充分溶解后于振荡器上振摇 20min，使样品与水充分混合，将细菌分散，即为10 1样品稀释液；吸取ImL 10 1样品稀释液 注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，充分混合均匀，依次稀释至10 4,选取10 2、10 3、10 4三个稀释梯度，划线接种于MRS-碳酸钙琼脂培养基平板上，于37°C培养48h ;观察菌落的形 态，如出现圆形稍隆起的乳白色菌落及菌落周围出现"溶钙圈"者初步定为目标菌株，挑取 单个可疑菌落，反复划线，直至获得纯培养物。挑取生长旺盛的单个菌落，涂片，进行革兰氏 染色、镜检及过氧化氢酶试验；将革兰氏染色呈阳性，镜检为杆状或球状的菌株，过氧化氢 酶试验为阴性的菌株暂定为乳酸菌。将纯化后的菌株进行斜面保存、甘油低温冻存和牛奶 管冻干保存。
[0015] 实施例2、植物乳杆菌ZWQ-9的鉴定 参照东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，凌代文等编著的《乳酸细菌分 类鉴定及实验方法》，郭兴华等编著的《乳酸细菌现代研究实验技术》等对所分离乳酸菌进 行生理生化指标检测，包括明胶液化试验、硝酸盐还原试验、硫化氢产生试验、吲哚试验、运 动性试验、淀粉水解试验、乳酸旋光性试验、葡萄糖产气试验、酪素水解试验、V-P试验及糖 发酵试验等。
[0016] 同时对所分离乳酸菌进行16S rRNA基因序列分析。具体操作为： SDS法提取菌株基因组DNA : (1)取ImL新鲜培养的菌液至I. 5mL离心管中，12000rpm离心5min收集菌体。
[0017] (2)弃上清，将菌体重悬于360 yL IXTE中，然后加50mg/mL的溶菌酶储液 100 μ L，上下颠倒混匀，37°C水浴4h-5h。
[0018] (3)加入 40 yL 20% SDS，上下颠倒混匀，60°C水浴 15min。
[0019] (4)取出，加入 125 μ L NaClO4 (5mol/L)混勾，再加入氯仿：异戊醇（24:1)625 μ L， 混勾。12000rpm，IOmin离心，小心吸出上清液，加入2倍体积无水乙醇，混勾后12000rpm离 心 IOmin0
[0020] (5)弃上清，加70%乙醇600 μ L，混勾后12000rpm离心5min。
[0021] (6)弃去乙醇，吸出多余液体，室温自然晾干，加入40yL无菌水吹打沉淀， 12000rpm 离心 30s 后-20°C 保存。
[0022] 对已初步鉴定为表皮葡萄球菌的菌株进行16S rDNA片段的扩增，革兰氏阳性细菌 的通用引物作为扩增引物，预期片段大小为1500bp，引物由上海生工合成，引物序列如下： 上游引物（27F) :5' -AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3' ； 下游引物（1541R) :5' -AAG GAG GTG ATC CAG CC-3' ；
PCR反应扩增结束后，取IyL 6XLoading buffer加3yL PCR产物混匀点样，120V电 泳30min，EB染色5min，凝胶成像系统成像。
[0023] 将扩增出较亮16S rDNA条带的菌株送上海生工测序，测序结果用DNAMAN进行编 辑，然后把编辑后的16S rDNA基因序列提交至NCBI，与Genbank中的序列进行同源性比对 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，将比对结果作为菌株最终的鉴定结果。
[0023] 结果表明，所分离的乳酸菌经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)，编 号为ZWQ-9,其生理生化特征见表1 ;16S rRNA测序结果见序列表。 表1植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ZWQ-9)的生理生化特征 CN 105176875 A 说明书 5/8 页
[0024] 实施例3、植物乳杆菌ZWQ-9胞外多糖的测定 植物乳杆菌ZWQ-9胞外多糖的提取：采用MRS琼脂培养基对所分离乳杆菌进行活化， 37°C条件下培养24h ;活化菌株再采用MRS肉汤进行发酵，发酵条件为37°C培养48h以 上。将发酵液离心（15min、12000Xg、4°C )，除去菌体和杂质；上清液添加质量浓度为 80g/100mL的三氯乙酸至终质量浓度4g/100mL，静置4~8h，离心（15min、12000r