凝结芽孢杆菌fm603及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物及其培养和应用技术，具体涉及一种产生细菌素的新的凝结芽 孢杆菌菌株，以及该菌株在饲料添加剂领域的应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素是微生物产生的次级代谢产物，对其它微生物具有抗菌活性。20世纪40年 代，科学家们发现饲喂动物低剂量的抗生素可以改善动物的生产性能，提高经济效益。在之 后的几十年内，抗生素广泛的应用于畜牧养殖行业，添加于饲料中用作生长促进剂，或者在 养殖现场用作治疗药剂。抗生素的使用显著的提高了动物的生长效率和饲料转化率，对畜 牧行业的发展起到了重要的作用。但是抗生素的使用也带来了诸多问题，比如耐药细菌的 传播、二次感染及动物产品中的药物残留等。耐药菌的出现严重的威胁到人类健康，以抗甲 氧苯青霉素金黄色葡萄球菌为例，感染该抗药菌株的死亡率是普通菌株的三倍，而且治疗 费用和住院时间也增加很多。在美国和英国，约有40-60%的金黄色葡萄球菌具有甲氧苯青 霉素抗性，在中国，约60-70%的大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素不敏感。大量使用抗生素，并 违反停药期规定则容易导致动物产品中的药物残留超标，这样的动物产品很难进入国际市 场，也会对人的健康存在潜在威胁。近些年来我国食品安全事故时有报道，2013年初的速生 鸡事件和禽流感的爆发给家禽养殖行业带来了巨大损失，消费者们对畜牧养殖行业的关注 也日渐增多，如何保证动物的高生产性能，同时生产出安全的肉、蛋、奶产品，关系到畜牧养 殖行业的持续稳定发展。欧盟于2006年全面禁止抗生素作为生长促进剂添加在饲料中，韩 国也于2011年禁用了抗生素类生长促进剂。中国如今也面临着是否禁止饲料中添加抗生 素的问题，这也促使饲料和养殖企业，以及农牧院校的研究人员积极致力于生物制剂的开 发和使用，以减少或者替代抗生素的应用。
[0003] 芽孢杆菌是革兰氏阳性、产芽孢的一类杆菌，广泛的存在于自然界中。芽孢杆菌 在一定条件下可以转化为芽孢形式，芽孢对外界不良环境如高温、高压、紫外线等有极强的 抵抗力。芽孢杆菌在工业上用作淀粉酶和蛋白酶的生产菌种，也长期的用于发酵类食品的 制作。芽孢杆菌有益于食物的消化和肠道健康，能够促进动物的生产性能，因此也用作食品 补充剂和动物益生菌。大量的研究数据表明，芽孢杆菌能够提高动物的生产性能，减少病原 菌感染几率，提高动物机体免疫，降低养殖环境的氨气浓度，是抗生素类生长促进剂的良好 替代品。芽孢杆菌通过刺激动物肠绒毛发育，提高非特异性免疫，产生抗菌活性物质发挥作 用。细菌素是芽孢杆菌产生的抗菌活性物质之一，是微生物通过核糖体合成的多肽类抗菌 物质，对很多病原菌包括耐药菌具有良好的抗菌活性。芽孢杆菌能够产生细菌素类抗菌物 质，如subtilin、sublancin、subtilosin、Iichenin等。细菌素是益生菌的重要功能性物 质，考克大学的研究人员发现，产细菌素的乳酸菌可以有效的减少单核增生李斯特菌对小 鼠的感染，但是在单核增生李斯特菌获得该细菌素的免疫基因后，乳酸菌失去对小鼠的保 护功能。有研究表明，细菌素可以降低动物肠道中的葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酸酶活性，促进 肉鸡增重，提高生产性能，机理与抗生素相似。因此，相比起普通芽孢杆菌，产细菌素的芽孢 杆菌对动物的生产性能具有更为良好的促进作用，在实际生产中具有更大的应用潜力。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一株产生细菌素的凝结芽孢杆菌新菌株。
[0005] 本发明所提供的凝结芽孢杆菌，是凝结芽孢杆菌FM603,该菌株已于2014年12月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市 朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)，保藏号为 CGMCC NO. 10221。
[0006] 本发明菌株FM603在常温和常规培养基上生长良好，菌落在胰蛋白胨琼脂上呈白 色，不规则，表面粗糙。革兰氏染色阳性，产芽孢。将该菌的16S rRNA序列在美国国家生物 技术信息中心（NCBI)数据库BLAST比对，与凝结芽孢杆菌的同源性为99%，经API 50CHB 试剂盒（bioMerieux, France)鉴定该菌与凝结芽孢杆菌的相似度为99. 7%，因此判定该菌 为凝结芽孢杆菌，命名FM603。
[0007] FM603可采用常规培养基在普通条件下培养，但是在改良胰蛋白胨培养基中能 获得更高生物量，改良胰蛋白胨培养基组成为：质量体积百分比，胰蛋白胨1.5%，葡萄 糖1. 5 %，酵母浸粉0. 5 %，玉米浆干粉0. 2 %，硫酸铵0. 05 %，氯化钠0. 1 %、磷酸二氢钠 0.05%、蒸馏水 100011^4!17.0，培养条件为30°(：，150印111培养2011。
[0008] 凝结芽孢杆菌FM603发酵培养产生细菌素，对革兰氏阳性细菌具有良好的抗菌作 用。该细菌素分子量为4276. 4?a，部分氨基酸序列为Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly -Pro。该细菌素可改变革兰氏阳性菌细胞膜通透性，导致细胞内钾离子外流。
[0009] 本发明还提供一种发酵生产上述细菌素的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)发酵上清液制备：将凝结芽孢杆菌FM603接种于IOmL液体LB培养基培养过夜， 将ImL培养液接种于1000 mL改良胰蛋白胨培养基，200rpm，30°C培养20h，1000 Orpm离心除 去菌体，得到发酵上清液；
[0011] 2)细菌素粗提液制备：将离子柱用50mM、pH 6. 5的磷酸盐缓冲液平衡，发酵上清 液以50mL/min的流速通过离子柱，将通过离子柱的上清液弃去，用磷酸盐缓冲液冲洗离子 柱后，以含IM NaCl的磷酸盐缓冲液（50mM，pH 6. 5)洗脱离子柱，流速为10mL/min，收集洗 脱液100mL，将洗脱液通过C18固相萃取柱，用100%的乙腈洗脱固相萃取柱并收集洗脱液， 将洗脱液冷冻干燥后，溶解在50mM、pH 6. 5的磷酸盐缓冲液中，过滤后得到类细菌素粗提 液；
[0012] 3)细菌素的纯化：类细菌素粗提液用高效液相色谱纯化，使用C18反相柱 (250mmX 10mm，5 μ粒径），流动相分别为A :100%乙腈，B :水，上样量为100 μ L，洗脱时间 为40分钟，流速为lmL/min，收集每分钟洗脱的溶液，重复多次上样纯化后将相同时间点的 洗脱液合并，冷冻干燥后溶于50mM磷酸盐缓冲液，并检测洗脱液的抗菌活性，以Listeria innocua为指示菌，获得纯化的细菌素。
[0013] 与已报道的芽孢杆菌细菌素相比，FM603生产的细菌素在生物学特性及抗菌活性 方面存在较大区别。
[0014] FM603产生的细菌素对热、酸稳定，在60-70°C水浴10分钟保持90%以上活性， 在80-100°C水浴10分钟保持80%活性；在pH 2-8范围内处理2h活性损失小于10%，在 PH9-10范围内处理2h活性存留60%。该细菌素在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋 白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶处理Ih后活性存留率大于90%，链霉蛋白酶处理Ih后剩余 20 %活性（详细见表2)。
[0015] 该细菌素对革兰氏阳性致病菌如金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢 杆菌和耐药菌如抗甲氧西林金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌活性（抑菌圈直径>20mm)，对 厌氧产芽孢梭菌如产气荚膜梭菌和坚强梭菌具有较强的抗菌活性（抑菌圈直径17_18mm)， 对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌，革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽 孢杆菌、乳杆菌以及酵母菌无抗菌活性，对霉菌如黄曲霉菌具有一定抗菌活性（详细见表 3) 〇
[0016] 本发明纯化的细菌素经SDS-PAGE电泳分析，凝胶4500Da处有一条蛋白条带，将凝 胶切下来进行抗菌活性检测，结果表明，该蛋白对李斯特菌有明显的抗菌活性。FM603细菌 素经基质辅助激光解吸飞行时间质谱和串联质谱分析，分子量为4276. 4?a，部分氨基酸序 列为Ala-Gly-HiS-Dhb-Phe-