Cl 中和所收集的样品；
[0035] ⑤纯化的IgG3样品用10mMpH7. 4PBS透析，4°C保存备用。
[0036] (3)纯化驼乳IgG3进行SDS-PAGE电泳。电泳结果可见分子量43kDa左右IgG3的 重链抗体，如图2所示。
[0037] 2.小鼠抗驼乳IgG#克隆抗体免疫
[0038] 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体的线路流程如图3所示。
[0039] ⑴小鼠免疫：
[0040] ①第一天，取抗原（纯化的盤乳IgG3)用生理盐水稀释至0· 2mg/ml，取750μ1经 过稀释的抗原溶液与750μ1弗氏完全佐剂混合，乳化，腹腔注射3只小鼠；
[0041] ②第三^ 天，抗原用生理盐水稀释至0. 2mg/ml，取750μ1抗原与750μ1福氏不 完全佐剂混合，乳化，腹腔注射3只小鼠；
[0042] ③第四十五天，抗原用生理盐水稀释至0.lmg/ml，取1500μ1抗原直接腹腔注射3 只小鼠；
[0043] ④第五十九天，取50yg抗原尾静脉注射1只小鼠，三天后进行细胞融合。
[0044] (2)ELISA：
[0045] ①包被：将抗原用pH9. 6的碳酸缓冲液稀释为5μg/ml，加入酶标板中，每孔 100μ1，4Γ过夜；
[0046]②封闭：将包被液弃去，每孔加入100μ1封闭液（5wt%脱脂奶粉），22°C放置lh;
[0047] ③加入样本：弃去封闭液，加入样品，每孔100μ1加入酶标板，37°C放置lh;
[0048] ④洗涤：用PBS-T洗3次，每次间隔5分钟，拍干；
[0049] ⑤加入二抗：酶标羊抗鼠，稀释至工作浓度，每孔100μ1加入酶标板，37°C放置1 小时；
[0050] ⑥洗涤：用PBS-T洗3次，每次间隔5分钟，拍干；
[0051] ⑦加入TMB显色底物：每孔100μ1加入酶标板，37°C放置5min;
[0052] ⑧加入终止液：每孔加入2MH2S04100μ1 ;
[0053] ⑨读数：酶标仪0D450nm读数。
[0054] (3)细胞融合：
[0055] ①SP2/0的收集：选择生长状态良好的SP2/0细胞（保持细胞处于对数生长期，融 合前两天换液），用弯头吸管将细胞吹下，收集于50ml离心管中，1200rpm离心5min。弃去 上清，用20mlRPMI1640培养基（购买自美国Gibco公司）将细胞重悬。
[0056] ②脾细胞的收集：小鼠摘眼球取血（37°C放置1小时后8000rpm离心lOmin，吸出 上清即为血清，可作为阳性对照，分装冻存于-20°C)，颈椎脱白处死，放入75vol%乙醇中 消毒5min。小鼠转入超净台中，左侧向上，将皮肤剪一小口，从开口处拉开皮肤暴露腹膜，用 无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏放入筛网中研磨脾脏，用15mlRPMI1640培养基冲洗筛网收 集脾细胞，1200rpm离心5min，弃去上清，用10mlRPMI1640培养基将细胞重悬。
[0057] ③细胞融合：将脾细胞与SP2/0细胞混匀，1200rpm离心5min，弃去上清，将细胞弹 松，吸lml预热的融合剂（PEG1000)，在lmin内逐滴加入，再放置37°C水浴中反应lmin，然 后加入终止液（在2分min内加入15mlRPMI1640培养基，并轻轻搅拌细胞），1200rpm离 心5min，弃去上清，加入25ml预热的HAT培养基（购买自美国Gibco公司），将细胞重悬，轻 轻混匀（用吸管从底部吸起细胞，在液面顶部轻轻盘旋滴入），用吸管将细胞悬浮液加入预 先接种饲养细胞的96孔板中，每孔1滴，铺2或3块板，置孵箱中培养（37°C，5vol%C02)。
[0058] ④融合板的检测：
[0059] a.融合后第3天观察96孔板，看融合细胞的生长状况、有无污染，保证细胞正常生 长。
[0060] b.融合后第三天和第七天换液两次，用吸管将融合板中的培养上清吸光，弃去，然 后每孔补加5滴新鲜的HAT培养基，置孵箱中培养（37°C，5vol%C02)。
[0061] c.第二次换液后2到4天进行抗体检测，将孔板中的上清每孔吸出100μ1加入 包被好的96孔酶标板，并作相应的编号，ELISA检测上清中是否有特异性抗体。
[0062] d.选择ELISA结果为阳性的孔，对应细胞培养板上的细胞进行第一次克隆，将细 胞吸出计数、稀释，以理论值每滴一个细胞加入预先接种饲养细胞的96孔板中，置孵箱中 培养（37°C，5vol%C02) 〇
[0063] e.克隆4天后，用显微镜观察，并对有克隆细胞的孔进行标记，第七天换液一次， 换液后4到6天（观察细胞生长情况而定），进行抗体检测，将孔板中的上清每孔吸出 100μ1加入包被好的96孔酶标板，并作相应的编号，ELISA检测上清中是否有特异性抗体。
[0064] f.选择ELISA结果为阳性的孔，对应细胞培养板上的细胞进行克隆，方法与第一 次相同，分别进行三次克隆。
[0065] g.用弯头吸管将细胞吹打制成悬液，1000转离心lOmin。弃去上清，用冻存液将细 胞重悬，分装入冻存管中，管壁作好标记。将细胞放入程序4°C冰箱中lh，转入液氮罐口悬 挂30min，放入液氮冻存。
[0066] ⑷单抗生产
[0067] ①将移去细胞混悬液的培养瓶中继续加入RPMI1640完全培养基，置孵箱中培养 (37〇C,5vol%C02) 〇
[0068] ②待细胞基本布满瓶底，细胞状态良好时收集细胞。将细胞用弯头吸管吹打制成 悬液，1000转离心lOmin，弃去上清，用生理盐水将细胞重悬，腹腔注射入鼠体内，每只小鼠 注射0. 5ml。
[0069] ③腹水的收集和保存：
[0070] a.小鼠接种杂交瘤细胞后需注意每天观察小鼠状态；
[0071] b.在小鼠濒死前颈椎脱白处死，用手术剪剪开皮肤，撕开皮肤暴露腹膜，再在腹膜 上剪一小口，用滴管将腹水吸出；
[0072] c.腹水3000转离心10分钟，吸取上清，分装冻存于_70°C，并取少量ELISA检测 腹水效价。单抗亚类以及效价见表1 ;
[0073] 表1单克隆抗体腹水亚类及效价
[0074]
[0076] 3.抗驼乳IgG3单克隆抗体的纯化
[0077] (1)纯化方法
[0078] ①样品处理：取抗驼乳IgG3单克隆抗体小鼠腹水，按体积比1 :1加入0. 02MpH7. 0 磷酸盐缓冲液，高速低温离心机l〇〇〇〇rpm离心4°C10分钟，去掉脂肪和沉淀；
[0079] ②预处理ProteinGaogaroseFF柱，用 10mLProteinGaogaroseFF胶装柱， 用0. 02MpH7. 0的磷酸盐平衡缓冲液平衡至少5倍体积；
[0080] ③按其操作步骤上样，用至少10倍体积的平衡缓冲液清洗柱子，去除杂质；
[0081] ④用0· 1MρΗ2· 7的甘氨酸缓冲液洗脱，收集IgG洗脱峰，并用1MpH9.OTris-HCl 中和所收集的样品；
[0082] ⑤纯化的IgG样品用10mMpH7. 4PBS透析，4°C保存备用。
[0083] (2)纯化的抗驼乳IgG3单克隆抗体IgG进行SDS-PAGE电泳，结果如图4。
[0084] 4.采用金标免疫层析法进行抗驼乳IgG3的单克隆抗体的筛选
[0085] (1)竞争法：
[0086] ①筛选方法：
[0087] a.包被：将纯化好的抗驼乳IgG^单克隆抗体用10mMpH7. 4PBS缓冲液稀释到 0. 3~0. 5mg/mL，包被到硝酸纤维素（NC)膜上，烘干。
[0088] b.标记：用pH8. 0的胶体金标记盤乳IgG3抗体，加入lvol%BSA作为稳定剂， lOOOOrpm离心4°C30分钟，沉淀用含重量体积比0. 1 %蔗糖和1 %BSA的复溶液分散，烘干 固化在玻璃纤维垫（金