用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小麦叶锈病防治领域，具体涉及一种用于检测小麦叶锈的胶体金试纸 条。
【背景技术】
[0002] 小麦叶锈病（PucciniareconditaRob.exDesm.f.sp.triticiErikss.EtHenn.) 是由小麦叶锈菌引致的真菌性病害，该病害是中国乃至全世界所有产麦国家的一类重要病 害，严重发生时会造成15%以上的产量损失。
[0003] 长期以来，小麦锈病的预测预报主要基于定期、大规模的田间病情调查和室内病 菌小种的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程 度上取决于调查测报人员的技术水平和经验，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。 叶锈病和条锈病的苗期症状区别不甚明显，一些基层植物保护人员常常将二者混淆，不能 准确区分。在小麦叶锈菌的潜育阶段，寄主的发病症状不易观察，难以界定初侵染的时期和 规模。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的小麦叶锈菌快速诊断和 检测手段。
[0004] 近年来，随着基因芯片和实时PCR技术的发展，基于特定基因序列开发的特异PCR 引物或探针，已被越来越多地用于病害诊断、病原菌鉴定中。DNA/RNA探针技术和聚合酶链 式反应（PCR)具有强专化性、高灵敏度以及程序化试验操作等特点，现已被广泛用于多种 植物病原真菌的鉴定检测。中国农业科学院植物保护研究所采用PCR方法，建立了以(6-微 管蛋白序列为基础的小麦条锈菌和叶锈菌特异性分子诊断检测技术（曹丽华等，2007;Cao etal.，2008)。该类技术体系是建立在核酸技术基础上，依靠病原菌基因组中的特异性DNA 序列进行检测，包括样品提取、PCR扩增以及扩增产物的分析，用于病害诊断检测的准确性 和可靠性均较高。
[0005] 然而，该方法步骤繁琐，从取样到获得结果需要一天时间，费时费力，并且需要在 实验室内进行。因此，需要开发一种快速、简便、准确的检测小麦叶锈菌的方法，可以随时检 测待测植株是否感染了小麦叶锈菌，从而对小麦叶锈进行早期预警。
【发明内容】
[0006] 根据上述领域存在的不足和需求，本发明提供一种用于检测小麦叶锈的胶体金试 纸条及其检测方法，该方法不需要仪器设备，在野外即可进行检测，能够快速准确地判断待 测植株是否患有小麦叶锈病。
[0007] 本发明请求保护的技术方案如下：
[0008] 抗小麦叶锈菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo. 10884的杂交瘤细胞所分泌。
[0009] 分泌抗小麦叶锈菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo. 10884。
[0010] 用于检测小麦叶锈的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸和PS底 板；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸按样品层析方向依次设置于PS底板上；
[0011] 其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的权利要求1所述的的单克隆抗 体；
[0012] 所述NC膜上按样品层析方向依次包括检测线和质控线，所述检测线上包被有小 麦叶锈菌抗原蛋白，其氨基酸序列如SeqIDNo. 1所示；所述质控线上包被有羊抗鼠二抗。
[0013] 所述金标垫上的抗体包被浓度为0. 12ug/cm。
[0014] 所述NC膜检测线上的抗原蛋白包被浓度为2mg/ml。
[0015] 所述NC膜质控线上包被的抗体为羊抗鼠二抗，其包被浓度为0. 5mg/ml。
[0016] 用于检测小麦叶锈菌的方法，其特征在于，采用权利要求3~6所述的胶体金试纸 条按照下列步骤进行检测：
[0017] (1)将待测样品滴加在样本垫上；
[0018] (2)待质控线显色后，观察检测线是否由无色变成红色；若检测线变成红色，则待 测样品中不含有小麦叶锈菌；若检测线不变色，则待测样品中含有小麦叶锈菌。
[0019] 用于制备抗小麦叶锈菌单克隆抗体的方法，其特征在于，以SeqIDNo. 1所示的小 麦叶锈菌抗原蛋白作为免疫原免疫实验动物。
[0020] 本发明请求保护的抗小麦叶锈菌的单克隆抗体，其亚型为IgGl型，能够特异识别 小麦叶锈菌的孢子。该抗体由保藏号为CGMCCNo. 10884的杂交瘤细胞所分泌，其效价高、 亲和力强、特异性好，与常见的小麦条锈菌、杆锈菌和黑粉菌无交叉反应，可用于检测样品 是否含有小麦叶锈菌。
[0021] 本发明还请求保护分泌抗小麦叶锈菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为 CGMCCNo. 10884。
[0022] 本发明提供用于检测小麦叶锈菌的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸 水纸和PS底板，利用胶体金夹心法检测样品中是否存在小麦叶锈菌。其检测原理为：样品 滴加在样品垫上后，便朝着吸水纸的方向泳动，金标垫上胶体金标记的抗小麦叶锈菌的单 克隆抗体（金标抗体）溶解，若样品中没有小麦叶锈菌，那么当金标抗体到达NC膜上的检 测线时，金标抗体被检测线上包被的小麦叶锈菌抗原蛋白捕获，沉积下来使检测线变成红 色，多余的金标抗体继续向前泳动，被质控线上的羊抗鼠二抗捕获，使质控线呈现红色。若 样本中含有小麦叶锈菌，则金标抗体与小麦叶锈菌孢子结合后向前泳动，越过检测线，在质 控线上被羊抗鼠二抗捕获，使质控线呈现红色，而检测线不变色。只有当质控线呈现红色 时，该检测结果才有效。
[0023] 本发明还提供用于检测小麦叶锈菌的方法，该方法操作简单易行，只需将病菌孢 子用0. 02mol/lPBS缓冲液处理后，滴加在本发明试纸条的样本垫上，室温反应约5-10min 后，待质控线显色后，观察检测线是否由无色变成红色；若检测线变红，则表明待测样品中 不含有小麦叶锈菌或者待测植株感染了小麦叶锈菌；若检测线不变色，则待测样品中含有 小麦叶锈菌。采用本发明试纸条进行检测，不需要仪器设备，在实验室和野外均可进行，从 取材到获得检测结果仅需15分钟，操作十分轻松，能够对小麦叶锈病进行早期预警，以便 及时采取防治措施，减少病害造成的经济损失。
[0024] 生物保藏信息：
[0025] 生物材料名称：Lr-2-3
[0026] 分类命名：对小麦叶锈菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株
[0027] 保藏日期：2015年06月05日
[0028] 保藏号：CGMCCNo. 10884
[0029] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0030] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
【具体实施方式】
[0031] 以下通过具体实施例对本发明进行解释和说明，需要声明的是，下述实施例仅作 为举例说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
[0032] 生物材料
[0033] 小麦叶锈菌：中国农业科学院植物保护研究所麦类病害研究组
[0034] 试剂与溶液：
[0035]HAuCL4(进口，sigma)，BSA(进口，巴斯夫或sigma)，PEG (20000)，二氯二甲硅烷 + 氯仿，各种普通化学药品，表面活性剂，缓冲溶液若干。
[0036] 标准品：叶锈菌孢子（浓度：1000 ppm)
[0037] 菌种来源：
[0038]
[0039] 主要材料仪器：
[0040] 划膜仪（biodotXYZ3060);胶体金颗粒（北京勤邦生物技术有限公司）；电磁加热 搅拌套式恒温器；洄流圆形烧瓶；蛇型冷凝管；搅拌子；分光光度计；高速冷冻离心机；烘 箱；切条机（biodotCM4000);除湿机；封口机；NC膜（whatmanFF120);胶体金垫（聚酯膜 whatman);样品垫（玻璃纤维whatman，S2样品垫（处理液成分是：以0? 02mol/lPBS为母 液分别添加〇.5%切的1120,2%蔗糖，2%854);吸水纸、？5(国产进口皆可）。
[0041] 实施例1、小麦叶锈菌单克隆抗体的获得
[0042] 一、杂交瘤细胞的制备
[0043] 实验动物为BALB/c小鼠，由中国军事医学科学院提供。
[0044] 1、抗原制备
[0045] (1)利用软件对小麦叶锈菌蛋白的基因及氨基酸序列分析后确定具有抗原位点的 一定数量的氨基酸序列，并对其进行合成，获得合成多肽产物，筛选特异性强的多肽，其氨 基酸序列为：
[0046] SeqIDNo.I:CSSSKYQDSGREKQRTNSDSNDEIGA。
[0047] (2)利用合成后多肽产物分别偶联蛋白BSA和蛋白0VA，并作为免疫原和包被原使 用，其中免疫原用于免疫小鼠，包被原用于包被检测使用。
[0048] 2、制备杂交瘤细胞
[0049] (1)挑选小麦叶锈病血清检测较好的小鼠，进行加强免疫，同时准备SP2/0骨髓瘤 细胞，放在37°C二氧化碳培养箱中进行培养，加强免疫3天后进行融合。
[0050] (2)取已经免疫小麦叶锈菌的的BALB/c小鼠，通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75% 酒精中5分钟。将小鼠取出晾干，放入超净工作台中，剪开外皮，暴露出腹腔的上皮，在脾脏 处将上皮剪开小口，取出脾脏，放入培养皿中，用注射器吸取不完全培养液，打到脾脏里面， 吹出脾细胞，如此反复，直至脾脏吹至透明为止。
[0051] (3)用吸管将SP2/0从瓶壁上吹下，再将SP2/0悬液全部移到上述脾细胞悬液中， 把离心管盖子拧紧。室温l〇〇〇r/min离心5min。离心好后倒掉上清，用吸水纸将流动液体 吸干，混匀细胞，加入融合剂，2分钟后缓慢加入不完全培养液进行终止融合。室温1000 r/ min离心5min，弃掉上清，加入HAT培养液进行铺板培养。
[0052] (4)用间接酶联免疫吸附法检测融合细胞的阳性率，一共有5个孔对叶锈菌有阳 性反应，然后经有限稀释对检测出的5个孔的阳性杂交瘤细胞分别进行克隆，筛选得到1个 对叶锈菌阳性显色较高的细胞株，将其扩大培养并冻存。
[0053]由此获得了稳定分泌抗小麦叶锈菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其细胞株编号 为：1C8,送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为：CGMCC No.10884。
[0054] 二、单克隆抗体制备
[0055]1、采用体内诱生法大量制备单克隆抗体。
[0056] (1)制备腹水前注意观察，杂交瘤细胞（CGMCCNo. 10884)生长饱满，状态良好，占 总体积的70%即可进行抗体制备。准备好离心管，用无菌的滴定管小心吹打细胞瓶底部，使 细胞从瓶底脱落，此动作重复10次左右，将吹好的细胞无菌转移至离心管内1000转/min