专利名称：表达重组人fviii的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于表达重组人凝血因子的载体、细胞株及其构建方法，特别是一种利用AAV定点整合构建表达重组人凝血因子VIII的293细胞株、其构建方法及应用。
背景技术：
血友病A ( hemophilia A)又名甲型血友病，是一种X-连锁隐性遗传病，在男性中的发病率约为(广2) / 100001。为患者定期输注血浆源性FVIII浓缩物或重组人凝血因子FVIII (rh FVIII)等FVIII制品是目前治疗血友病的主要途径。rh FVIII产品至今已应用20余年，但所有蛋白都是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或幼仓鼠肾细胞(BHK)生产。天然FVIII蛋白的表达经历非常复杂的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)过程，而在非人细胞的表达系统中可能存在由于不正确的PTMs引起免疫反应或FVIII抑制剂的形成，进而导致替代疗法失效。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的一个目的在于提供一种表达重组人凝血因子的整合质粒及其构建方法
技术领域：
本发明的另一目的在于提供一种表达重组人凝血因子的细胞株及其构建方法，
本发明的又一目的在于提供一种基于前述整合质粒和细胞株生产重组凝血因子VIII的方法。为实现上述发 明目的，本发明采用了如下技术方案:
一种表达重组人凝血因子的整合质粒，包括:
rAAV质粒骨架，以及，
整合于所述rAAV质粒骨架中的B区缺失的FVIII基因。进一步的，所述B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间。优选的，所述整合质粒中还可包含用作后续细胞株的筛选标记的GFP基因和/或用以提高整合效率的AAV p5启动子。作为较为优选的实施方案之一，所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP备Nhel和AfeiI双酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV质粒骨架。一种表达重组人凝血因子的整合质粒的构建方法，包括:
提供rAAV质粒骨架，并将B区缺失的FVIII基因连接至rAAV质粒骨架中，获得目标产物。进一步的，该方法包括:将B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间；
所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP经MeI和AfeiI双酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV质粒骨架。一种表达重组人凝血因子的细胞株，包括经过上述整合质粒或上述方法构建的整合质粒以及用于表达AAV R印蛋白的质粒共转染的，且能稳定表达BDD-FVIII的HEK 293细胞。作为较为优选的实施方案之一，所述用于表达AAV Rep蛋白的质粒包括PSVAV2质粒。一种重组人凝血因子的生产方法，包括:
培养如上所述的细胞株，而后收集培养产物，获得目标产物。作为较为优选的实施方案之一，该方法具体包括:
将如上所述的细胞株置于适合培养HEK 293细胞的环境中，使所述细胞株长至80 90%，而后将所述细胞株无血清培养24h以上，收集培养上清，获得目标产物。与现有技术相比，本发明至少具有如下优点:
(1)避免了重组病毒构建及纯化过程，更简单易于操作，整合率高，且无重组病毒基因组的分子量限制，具有更广泛的应用性；
(2)以人细胞作为宿主，表达的FVIII蛋白的结构与功能更接近于天然FVIII蛋白。
图1a是本发明一较佳实施例中rAAV整合质粒pTRP5BDDGFP的图谱，该质粒是在张春构建的rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP基础上改造而成，以pZp9FVIII Λ BS质粒为模板(戚正武院士惠赠，参阅The Gene Expression of Coagulation Factor VIII in Mammalian CellLines.Thrombosis Research., 1999，95: 105 - 115.)PCR扩增 BDD 基因全长 4316bp，受CMV增强子和鸡β-actin启动子的调控，GFP作为细胞株筛选标记，两个基因表达盒皆位于AAV ITR 之间；
图1b系本发明一较佳实施例中所用质粒pTRUFll的图谱；
图1c系本发明一较佳实施例中所用质粒PTRP5GDNF的图谱；
图1d系本发明一较佳实施例中由质粒pTRUFlI和质粒pTRP5GDNF所构建的质粒PTRP5⑶NFGFP的图谱；
图2是本发明一较佳实施例中rAAV整合质粒pTRP5BDDGFP的酶切鉴定结果，其中，M.1OOOObp ladder ；1.Nsi I 酶切，得到 11059bp 片段；2.Sal I 酶切，得到 1030bp+10029bp片段。图3a和图3b分别是本发明一较佳实施例中以流式细胞分析对照细胞293与整合细胞株293-BDD GFP基因表达的图谱，其中AAV Rep蛋白介导ITR之间的BDD基因和GFP基因整合至293细胞基因组，结果显示98%细胞为GFP阳性细胞；
图4是分别由FVIII基因及B区缺失的FVIII基因所编码氨基酸序列的对照结构示意图。
具体实施例方式
本发明提供了一种AAV定点整合构建表达FVIII的人293细胞株及其构建方法，以及利用该人细胞株表达有活性的重组FVIII的方法。
进一步的讲,本发明是利用rAAV整合质粒与表达整合必需的AAV Rep蛋白的质粒共转染HEK 293细胞，经过筛选获得稳定表达FVIII的293细胞株，一方面避免了重组病毒构建及纯化过程，更简单易于操作；另一方面无重组病毒基因组的分子量限制，具有更广泛的应用性。以下结合一较佳实施例及相应附图对本发明的技术方案作进一步的说明。本实施例可包括如下步骤:
一、扩增BDD基因，构建rAAV整合质粒pTRP5BDDGFP。此质粒是在张春构建的rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP基础上改造而成，将pTRP5⑶NFGFP质粒中⑶NF基因替换为BDD基因。其中，所述BDD基因系B区缺失的FVIII基因(BDD-FVIII)，其全长4316 bp，编码1438个氨基酸，其相应序列请参见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，而其结构请参考图4。一般来说，成熟FVIII蛋白包含3个区，其结构为A1-A2-B-A3-C1-C2。虽然B区的功能尚未确定，但很多研究表明B区缺失对FVIII (BDD-FVIII)的促凝血和辅因子活性没有影响；另外，研究表明 ，B区缺失能够将mRNA水平提高17倍之多，也因此伴有翻译产物的增加。在本发明中，通过选择BDD-FVIII，可以获得高表达量的FVIII蛋白。又，前述pTRP5BDDGFP的构建过程包括:
首先，以 BamHI 和 PstI 从 pTRUFll (请参阅图1b 以及 Characterization of aBipartite rAAV Vector for Site Specific Integration, Hum Gene Ther., 2007,18:787-797.)中切出GFP序列，以及，用BamHI和PstI将neoR从pTRP5⑶NF (参阅图1c)中切除；
而后，将GFP和pTRP5⑶NF连接得到pTRP5⑶NFGFP (参阅图1d)；
最后，用Nhe\和AfeiI将⑶NF序列从pTRP5⑶NFGFP中切除，回收骨架部分与BDD基因连接，得到PTRP5BDDGFP，其中含有GFP作为筛选标记。显然，本领域人员能够依据本领域之常识而在前述构建过程中选择采用合适的反应条件及产物纯化、收集等操作程序，继而获得最终产物。二、将整合质粒pTRP5BDDGFP与表达AAV Rep蛋白的pSVAV2质粒(张春博士构建，请参阅 Characterization of a Bipartite rAAV Vector for Site SpecificIntegration,Hum Gene Ther., 2007,18: 787-797.)共转染 HEK 293 细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，连续传代3次；将细胞克隆至96孔板，共克隆3次，筛选出稳定表达BDD-FVIII的293细胞株。利用流式细胞仪检测荧光细胞的比率。当然，本领域人员依据本发明的内容，亦可很容易想到采用其它具有AAV Rep蛋白表达功能的质粒替代前述PSVAV2质粒。三、对所得细胞株分别进行PCR、RT_PCR和Western blot鉴定，以确定基因整合及BDD蛋白的表达。四、检测阳性细胞培养上清中的BDD蛋白活性。本发明利用rAAV整合质粒与表达Rep蛋白的质粒共转染HEK 293细胞，经过三轮筛选获得稳定表达FVIII的293细胞株。此方法避免了重组病毒构建及纯化过程，更简单易于操作，而且整合率高。以人293细胞作为宿主，表达的FVIII蛋白的结构与功能更接近于天然FVIII蛋白。更具体的讲，本实施例中具体可以通过如下步骤实现:一、利用primer premier 5.0软件设计引物，上游引物:5’-CATCGCTAGQ^^CTATGCAAATAGAGCTC，含船el 酶切位点和 kozak 序列；下游引物:5’ -GCAGAA CCA ATG CAT TCA GTA GAG GTC (^6，含 AfeiI 酶切位点。PCR 反应体系为 50 μ L，包含50ng模板质粒pZp9FVIII Λ BS (戚正武院士惠赠，参阅The Gene Expression ofCoagulation Factor VIII in Mammalian Cell Lines.Thrombosis Research., 1999,95: 105 - 115)、上、下游引物各 0.3μΜ、dNTP 0.2mM、MgSO4 1.5mM、I XPCR 缓冲液和 IUKOD-Plus-Neo (东洋纺生物科技有限公司，上海)。PCR扩增过程采用两步法:94° C预变性2min，98° C变性10sec，68。C延伸3min，共35个循环。用觔el和AfeiI双酶切质粒rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP(该质粒可参照前述构建过程及图1b-图1d构建)，将⑶NF基因酶切下来(37° C，2h)，回收骨架部分；将BDD基因PCR产物也用船el和AfeiI双酶切回收，连接至rAAV质粒骨架(T4 DNA连接酶22° C，30min)，使其位于AAV两个ITR之间，并有GFP作为筛选标记。前述的各种酶均可由市场获得，例如，可购自NEB公司。该步骤一最终所获rAAV重组质粒pTRP5BDDGFP的图谱和鉴定结果请参阅图1a和图2。二、将HEK 293细胞接种于24孔板中(相应条件可以为:购自hyclone公司的10%胎牛血清DMEM培养基，37° C，5%C02,培养12h左右)，待细胞长到60%左右，利用PEI将整合质粒PTRP5BDDGFP与表达AAV Rep蛋白的pSVAV2质粒(张春博士构建，请参阅Characterization of a Bipartite rAAV Vector for Site Specific Integration, HumGene Ther., 2007,18: 787-797.)以 50:1 (lug: 20ng)共转染 HEK 293 细胞，继续培养，长满后将细胞传代，连续传3代后仍然可观察到荧光细胞；细胞计数，以每孔10个细胞接种于96孔板中，培养7天左右，挑出有荧光的细胞继续培养于24孔板中；待细胞长满后，单克隆至96板中，如此连续克隆3次，筛选出稳定表达荧光的293细胞株。利用流式细胞仪测得荧光细胞的比率约为98%，具体请参阅图3a-图3b。三、按常规操作对所得细胞株分别进行PCR、RT-PCR和Western blot鉴定。R印蛋白介导的AAV定点整合位于人19号染色体的AAVSI区，用AAV D-序列上游引物(5 ’-AGGAACCCCTAGTGATGGAG )和 AAVSI 下游引物(5 ’ -TCAGAGGACATCACGTGGTG )扩增，以确定基因的整合。具体方法，提取整合细胞的总DNA为模板200ng/50 μ L，上、下游引物各0.3 μ M、dNTP 0.2mM、MgS04 1.5mM、I XPCR缓冲液和 IU KOD-Plus-Neo。采用降落PCR法扩增:94° C预变性 2 min ；98° C 变性 10sec，74° C 延伸 lmin，5 个循环；98° C 变性 10sec，72° C延伸lmin，5个循环；98° C变性10sec，70。C延伸lmin，5个循环；98° C变性lOsec，68° C延伸lmin，30个循环。Trizol法提取细胞的总RNA，用FVIII基因下游引物逆转录成cDNA，然后进行PCR扩增，上游引物:5- CCAGGGTGCCCGTCAGAAGT，下游引物:5- GCA GAA CCA ATG CAT TCA GTAGAG GTC CTG，方法同上。重组细胞株293- BDD培养于25cm2培养瓶中，待细胞长至80 90%，改用无血清培养48h,收集培养 上清,用超滤离心法浓缩，进行SDS-PAGE电泳；Bioworld公司FactorVIII(S2194) pAb 作为一抗(1:800 倍稀释);ABGENT HRP Goat ant1-rabbit IgG antibody作为二抗(1:8000倍稀释)。
鉴定结果表明，BDD基因已被整合至293细胞染色体中，并能在细胞中稳定表达，所获得的细胞株命名为293-BDD。
四、重组细胞株293- BDD培养于25cm2培养瓶中，待细胞长至80 90%，改用无血清培养24h，收集培养上清，用COAMATIC Factor VIII试剂盒检测阳性细胞表达的BDD蛋白活性，结果表明，其凝血活性为14mU/105cells mLl^rs'需要指出的是，以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
权利要求
1.一种表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，包括: rAAV质粒骨架，以及， 整合于所述rAAV质粒骨架中的B区缺失的FVIII基因。
2.根据权利要求1所述的表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，所述B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间。
3.根据权利要求2所述的表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，所述整合质粒中还包含用作后续细胞株的筛选标记的GFP基因和/或用以提高整合效率的AAV p5启动子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的表达重组人凝血因子的整合质粒，其特征在于，所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP经MeI和AfeiI双酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV质粒骨架。
5.一种表达重组人凝血因子的整合质粒的构建方法,其特征在于,包括: 提供rAAV质粒骨架， 并将B区缺失的FVIII基因连接至rAAV质粒骨架中，获得目标产物。
6.根据权利要求5所述的表达重组人凝血因子的整合质粒的构建方法，其特征在于，包括:将B区缺失的FVIII基因连接于所述rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间； 所述rAAV质粒骨架包括rAAV质粒pTRP5⑶NFGFP经MeI和AfeiI双酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV质粒骨架。
7.一种表达重组人凝血因子的细胞株，其特征在于，包括经过权利要求1-4中任一项所述的整合质粒或权利要求5-6中任一项所述方法构建的整合质粒以及用于表达AAV Rep蛋白的质粒共转染的，且能稳定表达BDD-FVIII的HEK 293细胞。
8.根据权利要求7所述的表达重组人凝血因子的细胞株，其特征在于，所述用于表达AAV Rep蛋白的质粒包括PSVAV2质粒。
9.一种重组人凝血因子的生产方法，其特征在于，包括: 培养权利要求7-8中任一项所述的细胞株，而后收集培养产物，获得目标产物。
10.根据权利要求9所述的重组人凝血因子的生产方法，其特征在于，包括: 将权利要求7-8中任一项所述的细胞株置于适合培养HEK 293细胞的环境中，使所述细胞株长至80 90%，而后将所述细胞株无血清培养24h以上，收集培养上清，获得目标产物。
全文摘要
一种表达重组人FVIII的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用。该整合质粒包括rAAV质粒骨架，以及连接于rAAV质粒骨架内的两个ITR元件之间的B区缺失的FVIII基因。进一步的，该整合质粒中还可包含GFP基因，用作后续细胞株的筛选标记；和/或，AAVp5启动子，用以提高整合效率。该细胞株包括经过上述的整合质粒或上述方法构建的整合质粒以及用于表达AAVRep蛋白的质粒共转染的，且能稳定表达BDD-FVIII的HEK293细胞。该细胞株可应用于生产人重组凝血因子VIII。本发明的优点包括(1)避免了重组病毒构建及纯化过程，更简单易于操作，整合率高，且无重组病毒基因组的分子量限制，具有更广泛的应用性；(2)以人HEK293细胞作为宿主，表达的FVIII蛋白的结构与功能更接近于天然FVIII蛋白。
文档编号C12P21/02GK103215308SQ20131004102
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者刘晓玫, 张春 申请人:中国科学院苏州生物医学院工程技术研究所