一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用，属于基因 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶 类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产， 具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目 标产物的生产水平，具有非常重要的意义。
[0003] 基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研宄手段，通常是指含已知序列的 DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组，整合至细胞受体基因组中，在特异性靶位点上增 加外源DNA片段，或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定 点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此，基因打靶技术在功能基因组 学以及菌株的基因工程改造研宄中发挥着至关重要的作用。在生物体内DNA双链断裂修 复的方式有两种，即同源重组途径和非同源末端连接途径（Non-homologous End Joining， NHEJ)。在丝状真菌中，DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径，从而导致外源DNA 主要以随机插入方式整合到基因组上，同源重组效率低下，使得基因打靶技术的应用受到 了严重制约。有研宄显示失活同源重组途径可以提高外源DNA随机插入整合的效率，失活 非同源末端连接途径则能显著提高外源DNA以同源重组方式整合到基因组上的概率。
【发明内容】
[0004] 为解决土曲霉菌的同源重组能力低导致基因打靶技术在土曲霉遗传改造领域中 应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方 法与应用，所采取的技术方案如下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应 用，该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因提 高外源DNA的同源重组概率。
[0006] 优选地，所述方法是扩增出ku80基因或lig4基因的上游序列U和下游序列D以 及筛选标记基因，再通过融合PCR技术将筛选标记基因分别与上游序列U和下游序列D进 行融合，获得融合产物A和融合产物B，再分别以融合产物A和融合产物B为模板，扩增出打 靶元件A和打靶元件B，再将打靶元件转化到土曲霉原生质体中培养，最后通过筛选获得敲 除ku80基因或lig4基因的土曲霉重组菌。
[0007] 所述打靶元件A和打靶元件B，分别含有一段不完整且部分重叠的筛选标记基因 片段，这两个不完整的筛选标记片段于重叠部分发生同源重组可以组合成一个完整的筛选 标记基因，
[0008] 所述出发菌，是土曲霉CICC40205。
[0009] 优选地，所述方法的步骤如下：
[0010] 1)以土曲霉的基因组为模板，通过PCR扩增ku80基因或lig4基因的上游序列U 和下游序列D，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因 ptrA ;
[0011] 2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因 ptrA分别与上游序列U和下游 序列D融合，获得融合产物A和融合产物B ;
[0012] 3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶 元件A和打靶元件B，打靶元件A包括上游序列U和ptrA筛选标记的5'端部分序列，打靶 元件B包括ptrA筛选标记的5'端部分序列和下游序列D，打靶元件A的5'端和打靶元件 B的3'端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为300-800bp ;
[0013] 4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B转化到土曲 霉原生质体中培养，获得转化子；
[0014] 5)筛选步骤4)中敲除ku80基因或lig4基因的转化子，获得同源重组能力提高的 土曲霉重组菌。
[0015] 更优选地，所述方法的步骤如下：
[0016] 1)以土曲霉NIH2624的基因组为模板，通过PCR扩增ku80基因的上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80,以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因 ptrA ;
[0017] 2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因 ptrA分别与上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80融合，获得融合产物A和融合产物B ;
[0018] 3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打靶 元件ku80_A和打祀元件ku80_B，打祀元件ku80_A包括上游序列U_ku80和ptrA筛选标记的 5'端部分序列，打靶元件ku80-B包括ptrA筛选标记的5'端部分序列和下游序列D-ku80， 打靶元件ku80-A的3'端和打靶元件ku80-B的5'端ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长 度为597bp ;
[0019] 4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B转化到土曲 霉原生质体中培养，获得转化子；
[0020] 5)最后通过吡啶硫胺抗性筛选步骤4)所得转化子，再通过基因组验证获得敲除 ku80基因的重组菌At_Aku80。
[0021] 所述方法中所述扩增，扩增U-ku80的引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所 示；扩增D-ku80的引物序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示，扩增筛选标记基因 ptrA的 引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；扩增打靶元件ku80-A的引物序列如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所示，扩增打靶元件ku80-B的引物序列如SEQ ID NO. 9-SEQ ID NO. 10 所示。
[0022] 更优选地，所述方法的步骤如下：
[0023] 1)以土曲霉NIH2624的基因组为模板，通过PCR扩增lig4基因的上游序列U和下 游序列D，以质粒pPTR II为模板通过PCR扩增筛选标记基因 ptrA ;
[0024] 2)通过融合PCR技术将步骤1)所得筛选标记基因 ptrA分别与上游序列U-lig4 和下游序列D-lig4融合，获得融合产物A和融合产物B ;
[0025] 3)再分别以步骤2)所得的融合产物A和融合产物B为模板，通过PCR扩增出打 革巴元件Iig4-A和打祀元件Iig4-B ;打祀元件Iig4-A包括上游序列U-lig4和ptrA筛选 标记的5'端部分序列，打靶元件Iig4-B包括ptrA筛选标记的5'端部分序列和下游序列 D-lig4,打靶元件Iig4-A的5'端和打靶元件Iig4-B的3'端ptrA序列有重叠部分，该重 叠部分长度为597bp ;
[0026] 4)制备土曲霉原生质体，再将步骤3)获得的打靶元件A和打靶元件B转化到土曲 霉原生质体中培养，获得转化子；
[0027] 5)最后通过吡啶硫胺抗性筛选步骤4)所得转化子，再通过基因组验证获得敲除 lig4基因的重组菌At-Δ lig4。
[0028] 所述方法中所述扩增，扩增U-lig4的引物序列如SEQ ID NO. Il-SEQ ID NO. 12所 示；扩增D-lig4的引物序列如SEQ ID NO. 13-SEQ ID NO. 14所示，扩增筛选标记基因 ptrA 的引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；扩增打靶元件Iig4-A的引物序列如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 8所示，扩增打靶元件Iig4-B的引物序列如SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 9所示。
[0029] 所述任一方法用于制备土曲霉重组菌以及制备出的土曲霉重组菌都在本发明的 保护范围之内。
[0030] 本发明取得的有益效果：
[0031] 本发明提供的土曲霉重组菌株，具有外源DNA同源重组概率高的优点，使基因打 靶技术的应用效率得到提高，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供 基础支持。
[0032] 野生型土曲霉的同源重组概率只有10%，以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除 ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At- Δ ku80,改造前土曲霉CICC 40205 中外源DNA同源重组概率为10%，重组菌At-Aku80中外源DNA同源重组概率提高到 94. 7% ;以土曲霉CICC40205为出发菌，敲除lig4基因，构建外源DNA同源重组概率提高 的重组菌At-Alig4,改造前土曲霉CICC 40205中外源DNA同源重组概率为10%，重组菌 At-Δ lig4中外源DNA同源重组概率提高到100%。
【附图说明】
[0033] 图1为实施例1提供的土曲霉pdc基因敲除原理不意图。
[0034] 图2为敲除土曲霉CICC40205菌株pdc基因所得转化子的基因组PCR验证；
[0035] (图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果， 图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是 CICC40205 野生型菌株作为对照， 1-20为所获得转化子）。
[0036] 图3为敲除ku80基因的打靶元件及其发生同源重组敲